성인 쥐에 있는 재조합 형 Adeno 관련 바이러스의 직접 Intrathecal 주입

요약

여기에 우리가 작은 동물에 게 효율적인 adeno 관련 바이러스 전달 되도록 하 여 중앙에서 변환 효율 예측 점수 시스템 구축 바이러스 솔루션에서 1 %lidocaine 염 산 염을 사용 하 여 직접 intrathecal 사출 기법 제시 lidocaine에 의해 유도 된 과도 함의 정도 따라 신경 시스템.

초록

Adeno 관련 바이러스 (AAV)의 Intrathecal (IT) 주사는 CNS에 CNS 유전자 치료의 안전, noninvasiveness, 그리고 우수한 전달 효능 덕에 상당한 관심을 받고 있다. 이전 연구는 관리 그것에 의해 신경 장애에서 AAV 전달 유전자 치료의 치료 효능 입증. 그러나, 작은 동물에서 IT 관리의 기술적 제한으로 인해 예측할 수 없는 실패의 높은 속도 보고 되었습니다. 여기, 우리는 주입 솔루션으로 1 %lidocaine 염 산을 추가 하 여 작은 동물에 허리 빵 꾸의 성공 정도 나타내는 점수 시스템 설립. 우리는 추가 주입 다음 과도 함의 정도 AAV의 변환 효율을 예측할 수 있습니다 보여줍니다. 따라서,이 IT 주입 방법 CNS의 넓은 영역을 괴롭히다 CNS 질병 마우스 모델에서 치료 실험을 최적화 하기 위해 사용할 수 있습니다.

서문

AAV 몇 가지 부작용, CNS 변환에 장기적이 고 광범위 한 유전자 발현을 중재할 수 및 따라서 루 경화 증 (ALS), 헌팅턴의를 포함 하 여 CNS 질병을 치료 하는 유전자 치료에 대 한 가장 유망한 차량 중 하나 되고있다 (HD) 질병, Alzheimer의 질병 (광고), lysosomal 저장 질병 (LSD), Gaucher 질환 (GD), 그리고 신경 ceroid lipofuscinosis (NCL)¹ 현재, 이상의 100 AAV serotypes 인간과 동물에서 분리 되었습니다. 이러한 가운데, 적어도 12 전 임상에서 사용 되 고 AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, 같은 유전자 벡터를 사용 하는 가장 일반적으로 포함 하는 임상 시험, rAAVrh.8, 및 rAAVrh.10^,12,3,4, ^5,6.

다른 CNS 질병 때문에 다양 한 영향을 받는 CNS 영역 및 세포 유형 다른 AAV 배달 전략 필요합니다. CNS 영역 및 셀 AAV transduce 수 종류는 serotype에 따라 전달 방법 뿐만 아니라. 예를 들어 rAAVrh10 transduce 주로 조직의 정 맥 주사 (IV)에 의해 전달 하는 때 이다 그것은 신경 및 명과 intrathecal 주입^4,7에 의해 전달 될 때 불리고 반면에 표시 되었습니다. 또한, 실질 주입 결과 사출 사이트의 부근을 로컬 변환 반면 intraventricular 통해 뇌 척추 액체 (CSF)에 주입 또는 intrathecal 주입 결과 광범위 한 CNS 변환⁸ . 연구는 또한 신경 장애에서 AAV 전달 유전자 치료의 치료 힘에 의해 증명 그것 관리^9,,1011. ALS 같은 CNS의 넓은 영역에 영향을 주는 질병에 CSF에 intrathecal 주입 체계 배달 방법^4,10에 비해 낮은 복용량으로 질병에 의해 시달리는 대부분 영역을 커버 하 표시 되었습니다. 최근 연구는 또한 ALS laminectomy 및 intrathecal catheterization⁴와 관련 된 잠재적인 부상 방지에 대 한 마우스 모델에서 AAV를 주입 하는 허리 빵 꾸를 사용할 수 있습니다 나타났습니다.

실험적인 직접 요 추 찔린 에이전트, 특히 마 취약, 진통 및 1885^12,13마 취 척수에 전달 하 처음 사용 되었다. 이 보고서에서 우리 허리 빵 꾸 1 %lidocaine 염 산 염는 지역 아 미드 파생 취 평가 하 고 사출 품질 모니터링 주입 솔루션에서의 도움으로 성인 쥐에 주입 방법으로 그것을 설명 합니다. 반면 실패 한 주사는이 동작을 보여주지 않았다 성공적인 주사 일시적인 마비 lidocaine 유도 의해 표를 했다. 우리는 주입 효율을 예측할 수 있도록 다섯 등급 중 하나로 과도 약점의 수준을 분류. 마지막으로, 우리는 rAAVrh10 변환 수준 마비의 급료에 의해 예측 될 수 있습니다 보여줍니다. 따라서,이 intrathecal AAV 전달 방법 AAV 중재 CNS 질환의 실험적 치료를 위한 유전자 납품을 향상 시키기 위해 사용할 수 있습니다.

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프로토콜

FVB/뉴저지 쥐 허베이 신경과 키 실험실의 동물 시설에서 자란 했다. 모든 마우스 실험에 의해 두 번째 병원의 허베이 의료 대학 윤리 위원회 승인 되었고 실험실 동물 관리 과학과의 인민 공화국의 기술에 의해의 규정에 따라 실시 중국입니다.

1. 20 %Lidocaine 염 산 염 재고 솔루션의 준비

1. Lidocaine 염 산 염의 2 세대의 무게. 부드럽게 살 균 물과 소용돌이의 5-6 mL를 추가 합니다. 멸 균 물 10 mL의 총 볼륨을 증가.
2. 1.2 0.2 미크론 필터를 통해 재고 솔루션을 필터링 합니다. 약 수 재고 솔루션, 1.5 mL microcentrifuge 당 1 mL 튜브, 및 씰링 필름으로 그것을 봉인. 4 ° c.에 게

2. 깨어 있는 마우스에 직접 Intrathecal AAV 배달

1. 70% 에탄올과 멸 균 거 즈를 사용 하 여 작업 영역을 닦 고 표 1에서 설명한 대로 필요한 용품을 준비.
2. 살 균 200 µ L microcentrifuge 튜브에 rAAVrh10 재고 솔루션 (5 x 10¹² 게놈 사본/mL)의 95 µ L을 추가 하 여 복잡 한 AAVrh.10/1% lidocaine 염 산 염의 100 µ L를 준비 하 고 20 %lidocaine 염 산 염 재고 솔루션의 5 µ L를 추가 합니다. 아래로 pipetting으로 잘 섞는다. 다음, 얼음 (4 ° C)에 바이러스 솔루션을 저장 합니다.
   참고: 8 µ L 마우스⁴ 당 사용 됩니다.
3. 주입을 위한 AAV 솔루션 주사기 준비
   1. 해밀턴 주사기 27 G 바늘 및 주사기에 체적 규모와 바늘의 경사진 끝 25 µ L를 조립.
   2. 주사기로 부드럽게 바이러스 솔루션의 4 x 10¹⁰ 게놈 사본 8 µ L를 그립니다. 공기 방울을 제거 해야 합니다.
4. 마우스를 준비
   참고: 남성 또는 여성 FVB/뉴저지 쥐 (30-70 일)이이 연구에 사용 되었다. IT 분사 후드에서 운영 했다.
   1. 70% 에탄올과 후드에 작업 영역을 소독. 후드에서 발생 하기 쉬운 위치에 bedpiece에 깨어 마우스 (남성 또는 여성, 30-70 일, 13-20 g 체중)을 넣어. 마우스를 진정 하 고 물린 피하기 위해 멸 균 거 즈와 상체를 커버.
   2. 다른 쪽에 한 쪽과 집게/중간 손가락에 엄지는 골반 거 들에 적절 하 고 단단히 창과 하 여 동물을 해결. 엄지와 집게손가락으로 긴장 된 양측 골반 거 들 사이의 피부 유지. 부드럽게 손바닥으로 동물의 상체에 개최.
   3. 양측 골반 거 들 사이 그것의 뒤에 모피를 면도 다음 요오드 화 기반 스크럽과 70% 에탄올과 피부 표면에 소독.
5. Intrathecal 주입¹²
   1. L6 L5 척추 공간을 나타내기 위해 손톱으로 들여쓰기를 누르고 엄지 또는 검지로 다른 손의 양측 골반 거 들 사이 중간 선 따라 척추 공간 느낌 (주사 사이트를 찾습니다).
   2. 약간 하며 부드럽게 회전 하는 꼬리의 척추의 중간을 나타냅니다. (단계 2.3.1에서에서 언급) 주입 전에 동물의 머리 쪽으로 바늘 경사를 조정 합니다.
   3. 동물 단단히 고정 하는 척추의 중간을 따라 바늘을 정렬 되었는지 확인 합니다.
   4. 부드럽게 하 고 수직으로 바늘을 삽입 (또는 약간 70-80 ° 기울기) 들여쓰기와 계속 중앙 화살 평면에서 주사기의 교차로에서. 뼈, 연결할 때 천천히 약 30 ° 각도 줄이기 위해 다음 척추 공간에 바늘을 풀.
      참고: 분명 갑자기 꼬리 영화 intradural 공간에 성공적인 항목의 표시 이다. 일단 바늘 척추 공간 입력, 바늘 팁 단단히 채워 느낄 것 이다. 27 G 니 들이이 연구에 사용 된 쥐 쥐 하지에 그것 배달에 적합 합니다.
   5. 벡터 솔루션 (2.2 단계에서 언급 한)을 주입. 타이머를 시작 하 고 마친 후 1 µ L/4 미 유지 바늘 약 1 분의 속도 벡터 솔루션의 8 µ L를 주사 배달. 누수를 방지 하려면 부드러운 회전 바늘을 철회 한다.
   6. ⁴사출 품질 평가 하기 위해 배달 후 즉시 마우스의 일시적인 약점 사지를 점수.
      참고: 표준⁴는 다음과 같습니다. 점수 0: 없음 약점; 1 점수: 걸음 걸이 이상; 없이 뒷 다리 사지의 약점을 마이너 2 점수: 분명 한 걸음 걸이 이상;으로 뒷 다리 사지의 약점을 적당 한 3 점수: 완료; 뒷 다리 사지의 마비 4 점수: 뒷 다리 사지의 마비, 호흡 곤란, 그리고 포어 사지;의 온건한 약점 완료 5 점수: 완전 한 모든 4 개의 사지의 마비 및 호흡 분명 곤란.
   7. 마비에서 회복을 위한 감 금 소에 다시 마우스를 이동 합니다.
6. 정리
   1. 메 마른 물 1 mL 주사기를 플러시. 실험실 공급을 정렬 하 고 압력가 마로 소독 살 균에 대 한 모든 비 일회용 재료를 수집 합니다. 70% 에탄올과 벤치를 청소.

3. 조직 Immunohistochemical 얼룩을 위한 준비

1. 조직 컬렉션
   1. 복 주입 깊이 3 %chloral 하이드 레이트 (0.1 mL/10 g)와 21 일 후 주입에 쥐를 anesthetize.
   2. 얼음 처럼 차가운 0.01 M PBS (NaCl 147 m m;의 20 mL와 함께 transcardially perfuse NaH₂포₄ 1.9 m m; K₂HPO₄ 8.1 m m, pH 7.4) 첫째, 다음 4% 얼음 paraformaldehyde (0.01 M PBS)에서 펌프 (1 분, 9 분 다음 5 mL/min 10 mL/min).
      주의: Paraformaldehyde은 발암 성 독성. 장갑을 착용 하는 동안 연기 후드에만 처리 합니다.
2. 척수와 뇌의 해 부
   1. 주사기 바늘, 거품 상자 덮개에서 발생 하기 쉬운 위치에 사지와 각 동물의 머리를 해결 다음 제거 하 고가 위로 천 골을 머리에서 피부를 제거.
   2. 두개골과 뇌, 시 가로 라인의 중간 경로 함께 잘라 다음 각 측에 두개골을 열고, 눈 사이 두개골을 클립 합니다.
   3. 핀셋으로 후 두 뼈를 들어올린 안과 위 양측 척추 운하를 엽니다. 양쪽에 있는 갈비뼈에서 잘라내어 신중 하 게 척추의 위쪽 절반을 제거.
   4. 곡선된 핀셋으로 두뇌를 들어올린 두개골 기지의 신경을 절단 하는 다 다음 뇌와 척수를 신중 하 게 해 부 합니다. 후에 24 h에 대 한 4 %paraformaldehyde 조직 수정 했다.
3. 조직 조각의 준비
   1. Cryoprotect 뇌와 경 추 및 요 추 척수 30% 자당 해결책에서 4 ° c.에서 하룻밤 최적의 절삭 온도 (10 월) 화합물에 조직을 포함 하 고 액체 질소로 빨리 동결.
   2. 25 µ m는 cryostat를 사용 하 여 조직을 잘라 고 사용 4 ° C에서 0.01 M PBS에 냉동된 섹션을 저장 합니다.

4입니다. Immunohistochemistry

1. 10 분의 1% H₂O₂ 에 부동성 섹션을 pretreat 다음 10 분 품 5% 혈 청 및 1 시간에 대 한 PBS에 0.3% 비 이온 세제 차단 솔루션에 대 한 PBS에 세척 합니다.
2. 4 ° c.에 하룻밤 해당 기본 항 체와 슬라이스를 품 어 PBST에 섹션을 세척 (0.2 %PBS 트윈 20) 30 분 (3 시간 10 분 동안 각).
3. (3 시간 10 분 동안 각) 30 분 동안 1 h. PBST에 세척에 대 한 실 온에서 해당 biotin 이차 항 체와 슬라이스를 품 어.
4. 40 분, 복잡 한 선호도 biotin 과산화 효소와 섹션을 품 어 그리고 achromogenic 에이전트와 얼룩. 슬라이드에 섹션을 탑재 하 고 제대로 건조.
5. 슬라이드 5 분 무수 에탄올과 자일 렌 10 분에 담가 다음 설치 매체와 함께 슬라이드를 밀봉 합니다. 마지막으로, 100 배, 200, 및 400 x 배율에는 전 하 결합 소자 (CCD)를 갖춘 현미경 슬라이드 이미지.

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결과

마우스 과도 약점의 다른도 바로 뒤 AAV 솔루션의 주사로 intrathecal 주입의 다양 한 품질 1 %lidocaine 염 산 염 보였다. 시스템에 따라 반 양적 5 학년 점수 우리는 설립, 우리 AAV의 변환 패턴에에서 테스트 쥐 lidocaine 유도 사지 약점의 다른도로 (점수 0, n = 2; 1, n 점수 = 1; 4, n 점수 = 4; 점수 5, n = 3). 척수의 EGFP immunostaining 보였다 중 "없음" 또는 "작은 0를 득점 하는 쥐의 요 추 척수?...

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토론

기술적으로, 깨어 있는 쥐의 IT 주입 하는 동안 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 첫째, 적절 한 제스처 및 회사 전체 작업을 통해 쥐의 관리는 배달 하기 위해 필수. 둘째, 그것은 저항 없이 너무 깊게 삽입 하거나 동물 부상 또는 절곡 바늘 팁의 경우 강력한 저항에서 강제로 삽입 하지 필요한 가장 어려운 포인트 바늘 팁과 척추 공간을 느낌입니다. 셋째, lidocaine 인해 일시적인 마비 제공 하지만 객관?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
FVB/NJ mice	Charles River Laboratories China
Lidocaine hydrochloride monohydrate	HEOWNS	73-78-9
AAV	Viral Vector Core of the Gene Therapy Center at University of Massachusetts Medical School
25 µL  Hamilton syringe/27-30 G needle	GASTIGHT	1702
O.C.T compond	SAKURA	4583
H 2O 2	SHUI HUAN PAI	170401
Goat serum	Solarbio	S9070
Triton X-100	LIFE SCIENCES	T8200
Rabbit anti-GFP	Life tech	G10362	1:333 dilution
The second antibody (goat-anti rabbit)	Jackson Immuno Research	111-005-144	1:1,000 dilution
VECTASTAIN ABC REAGENT	Vector Lab	PK-6100
ImmPACT DAB Peroxidase Substrate Kit	Vector Lab	SK-4105
Mounting medium for fluorescence with DAPI	Vectorshield	H-1200
NaCl	Yong Da Chemical
NaH2PO4·2H2O	Yong Da Chemical
Na2HPO4·12H2O	Yong Da Chemical
Paraformaldehyde	Yong Da Chemical	307699
Adhesion Microscope Slides	CITOGLAS	17083	25 mm x 75 mm
SUPER-SLIP MICRO-GLAS	Electro Microscopy Siences	72236-60	24 mm x 60 mm
15 mL Centrifuge tube	CORNING	430790
96 well cell culture cluster	Coster	3599
24 well cell culture cluster	Coster	3524
70% Ethanol	WEN ZHI
Gauze	Wei AN	05171112	8 cm x 10 cm x 12 cm
1 mL syringe	Hong Da
Microtubes	Plasmed
Micropipet	eppendorf
Peppet tips	Rainin
Centirifuge	eppendorf	5427R
Regerator	Haier	BCD-539WT
Filter	MILLEX GP	R4PA42342
Pump	LongerPump	BT-100-2J/YZ1515X
Microscope	Olympus	BX53
Freezing-microtome	Leica	CM1520