Direkte intrathekale Injektion von Recombinant Adeno-assoziierten Viren bei Erwachsenen Mäusen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen eine direkte intrathekale Injektionstechnik mit 1 % Lidocain Hydrochlorid in eine virale Lösung gewährleisten effizienten Adeno-assoziierten Viren Lieferung an Kleintieren und etablieren ein scoring-System zur Vorhersage der Transduktion Effizienz im zentralen Nervensystem nach dem Grad der vorübergehende Schwäche durch Lidocain induziert.

Zusammenfassung

Intrathekale (IT) Injektion von Adeno-assoziierte Virus (AAV) hat großes Interesse in der CNS Gentherapie aufgrund seiner Sicherheit, Noninvasiveness und ausgezeichnete Transduktion Wirksamkeit im ZNS gezogen. Frühere Studien zeigten die therapeutische Wirksamkeit der AAV geliefert Gentherapie bei neurodegenerativen Erkrankungen dadurch Verwaltung. Jedoch wurden hohe Raten von unvorhersehbaren Ausfall aufgrund der technischen Begrenzung der IT-Administration bei kleinen Tieren berichtet. Hier haben wir ein scoring-System um den Erfolg der Lumbalpunktion bei Kleintieren, inwieweit durch Zugabe von 1 % Lidocain Hydrochlorid in der Injektionslösung. Wir zeigen weiter, dass das Ausmaß der vorübergehende Schwäche nach der Injektion die Transduktion Effizienz der AAV vorhersagen kann. So kann dieser IT-Injektionsverfahren zur Therapiestudien in Mausmodellen der ZNS-Erkrankungen zu optimieren, die weite Bereiche des ZNS zu bedrängen.

Einleitung

AAV kann vermitteln langfristige und weit verbreitete Genexpression in der CNS-Transduktion mit wenigen Nebenwirkungen und daher eines der vielversprechendsten Fahrzeuge für Gen-Therapie zur Behandlung von ZNS-Erkrankungen wie Amyotrophe Lateralsklerose (ALS), Huntington es geworden Krankheit (HK), Alzheimer-Krankheit (AD), lysosomale Speicherkrankheiten (LSD), Gaucher-Krankheit (GD) und neuronale Ceroid Lipofuscinosis (NCL)¹. Derzeit sind mehr als 100 AAV Serotypen von Mensch und Tier isoliert gewesen. Unter diesen sind mindestens 12 dienten in präklinischen und klinischen Studien, darunter die am häufigsten verwendeten gen Vektoren wie AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, rAAVrh.8 und rAAVrh.10^{1,2,3,4, 5,6}.

Andere ZNS-Erkrankungen erfordern unterschiedliche AAV Lieferung Strategien aufgrund der verschiedenen betroffenen CNS Regionen und Zelltypen. Die CNS Regionen und Zelle Arten, die AAV transduzieren kann variiert je nach der Serotyp sowie Versandart. Z. B. rAAVrh10 nachweislich überwiegend transduzieren Astrozyten im Auslieferungszustand durch systemische intravenöse Injektion (IV), während es Neuronen und Glia im Auslieferungszustand durch intrathekale Injektion^4,7ausgestrahlt. Darüber hinaus führte Parenchym Injektion in lokalen Transduktion bis in die Nähe der Injektionsstelle, während Injektion in den Liquor cerebrospinalis (CSF) durch intraventrikuläre oder intrathekale Injektion führte zu weit verbreiteten CNS Transduktion⁸ . Studien haben auch therapeutische Potenz der AAV geliefert Gentherapie bei neurodegenerativen Erkrankungen dadurch Verwaltung^9,10,11gezeigt. Bei Erkrankungen, die weite Bereiche des ZNS wie ALS betreffen, hat sich intrathekale Injektion in den Liquor gezeigt, die meisten Bereiche abzudecken, die durch die Krankheit mit einer niedrigeren Dosis, im Vergleich zu einer systemischen Lieferung Methode^4,10befallen sind. Neuere Studien haben auch gezeigt, dass Lumbalpunktion AAV injizieren in Mausmodellen für ALS, die mögliche Verletzungen verbunden mit Laminektomie und intrathekale Katheterisierung⁴vermeidet einsetzbar.

Experimentelle direkte Lumbalpunktion wurde zuerst verwendet, das Rückenmark zur Analgesie und Anästhesie in 1885^12,13Agenten, vor allem Anästhetika, anzubieten. In diesem Bericht zeigen wir die lumbale Punktion IT Injektionsverfahren bei Erwachsenen Mäusen mit Hilfe von 1 % Lidocain Hydrochlorid, einem lokalen Amid abgeleitet Betäubungsmittel in die Injektionslösung zur Bewertung und Überwachung der Qualität der Injektion. Erfolgreiche Injektionen waren geprägt von Lidocain-induzierte vorübergehende Lähmung, während fehlerhafte Injektionen nicht dieses Verhalten zeigen. Wir klassifizieren die Höhe der vorübergehende Schwäche als einer der fünf Klassen, um die Effizienz der Injektion vorherzusagen. Schließlich zeigen wir, dass die rAAVrh10 Transduktion Ebene durch den Grad der Lähmung vorhergesagt werden kann. Daher kann diese intrathekale AAV Lieferung Methode verwendet werden, um AAV-vermittelten gen-Lieferung für experimentelle Therapie von ZNS-Erkrankungen zu verbessern.

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Protokoll

FVB/NJ Mäuse wurden in der Tierstation Key Laboratory der Hebei Neurologie gezüchtet. Alle Maus-Experimente wurden von der zweiten Krankenhaus von Hebei medizinische Universität Ethikkommission genehmigt und durchgeführt nach den Vorschriften des Labor Tiermanagement unter Beachtung der vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie der Volksrepublik China.

1. Vorbereitung von 20 % Lidocain Hydrochlorid-Stammlösung

1. Wiegen Sie Lidocain Hydrochlorid 2 g. 5 – 6 mL sterilem Wasser und Wirbel sanft hinzugeben. Erhöhen Sie die Lautstärke auf insgesamt 10 mL mit sterilem Wasser.
2. 1.2 filtern Sie der Stammlösung durch 0,2 µm-Filter. Aliquoten Stammlösung, 1 mL pro 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch, und verschließen Sie diese mit einer Dichtfolie. Shop bei 4 ° C.

2. Direktlieferung intrathekale AAV in wach Mäuse

1. Wischen Sie den Arbeitsbereich mit steriler Gaze mit 70 % Ethanol und bereiten Sie die erforderlichen Beistellungen, wie in Tabelle 1genannten.
2. Bereiten Sie 100 µL der AAVrh.10/1% Lidocain Hydrochlorid komplexe durch Zugabe von 95 µL der Stammlösung rAAVrh10 (5 x 10¹² Genom Kopien/mL) in einen sterilen 200 µL Microcentrifuge Schlauch vor, und fügen Sie 5 µL 20 % Lidocain Hydrochlorid-Stammlösung. Mischen Sie gut durch Pipettieren rauf und runter. Speichern Sie dann die Virenschutzlösung auf Eis (4 ° C).
   Hinweis: es werden 8 µL pro Maus⁴ verwendet werden.
3. Vorbereitung der Spritze mit AAV-Lösung zur Injektion
   1. Montieren Sie eine 25 µL Hamilton mit einem 27 G Nadel Spritze und richten Sie die abgeschrägte Spitze der Nadel mit der volumetrischen Skala auf der Spritze.
   2. Ziehen Sie sanft 8 µL mit 4 x 10¹⁰ Genom Kopien des Virus-Lösung in die Spritze. Achten Sie darauf, um Luftblasen zu entfernen.
4. Vorbereitung der Maus
   Hinweis: männlich oder weiblich FVB/NJ Mäuse (30 – 70 Tage alt) wurden in dieser Studie verwendet. IT-Injektion wurde in der Haube betrieben.
   1. Im Arbeitsbereich eine Kapuze mit 70 % Ethanol zu sterilisieren. Ein Bedpiece in Bauchlage in der Haube wachte Maus (männlich oder weiblich, 30 – 70 Tage alt, 13 – 20 g Gewicht) aufsetzen. Decken Sie den Oberkörper mit steriler Gaze, die Maus zu beruhigen und zu vermeiden, gebissen.
   2. Befestigen Sie das Tier durch packende angemessen und fest auf seinen Beckengürtel mit dem Daumen auf der einen Seite und Zeigefinger/Middle Finger auf der anderen Seite. Halten Sie die Haut zwischen bilateralen Bauchflossen Mieder straff mit Daumen und Zeigefinger. Halten Sie sanft auf den Oberkörper des Tieres mit der Handfläche.
   3. Rasieren Sie das Fell auf dem Rücken zwischen der bilateralen Bauchflossen Miederhosen zu, dann sterilisieren Sie die Hautoberfläche mit einem Jodid-Peeling und 70 % Ethanol aus.
5. Intrathekale Injektion¹²
   1. Fühle die Bandscheiben Raum entlang der Mittellinie zwischen den bilateralen Bauchflossen Mieder mit einem Daumen oder Zeigefinger der anderen Hand und drücken Sie eine Vertiefung mit einem Fingernagel an der Bandscheibe L5-L6-Raum (suchen Sie die Injektionsstelle).
   2. Drehen Sie die Schwanzwurzel, leicht und sanft an der Mittellinie der Wirbelsäule. Passen Sie die Abschrägung der Nadel in Richtung des Kopfes des Tieres vor der Injektion (in Schritt 2.3.1 erwähnt).
   3. Stellen Sie sicher, dass die Tiere fest sind und richten Sie die Nadel entlang der Mittellinie des Rückens.
   4. Stechen Sie die Nadel vorsichtig und senkrecht (oder neigen Sie leicht 70 – 80°) an der Kreuzung der "Einrückung" und halten Sie die Spritze in eine zentrale Sagittalebene. Reduzieren Sie den Winkel um ca. 30° langsam, wenn es die Knochen verbindet, dann schlüpfen Sie die Nadel in die Bandscheibe Raum.
      Hinweis: Eine offensichtlich plötzliche Tail Flick ist ein Zeichen der erfolgreichen Einstieg in den intradurale Raum. Sobald die Nadel den Bandscheiben Raum betritt, fühlen die Nadelspitze fest eingespannt. Die in dieser Studie verwendete 27 G Nadel eignet sich für IT-Servicebereitstellung in Mäuse aber nicht Ratten.
   5. Die Vektor-Lösung (in Schritt 2.2 genannten) zu injizieren. Der Timer gestartet und injizieren 8 µL der Vektor-Lösung mit einer Geschwindigkeit von 1 µL/4 s. Retain Nadel ca. 1 min nach Beendigung Lieferung. Ziehen Sie die Nadel mit sanften Drehung um auslaufen zu vermeiden.
   6. Gäste die vorübergehende Schwäche der Maus Gliedmaßen unmittelbar nach der Geburt, die Injektion Qualität⁴zu bewerten.
      Hinweis: Der Standard lautet⁴. Ergebnis 0: keine Schwäche; Tor 1: kleinere Schwäche der hinteren Gliedmaßen ohne Gang Abnormität; 2 Punkte: moderate Schwäche der hinteren Gliedmaßen mit offensichtlichen Gangart Anomalie; 3 Punkte: komplette Lähmung der hinteren Gliedmaßen; Note 4: vollständige Lähmung der hinteren Gliedmaßen, Kurzatmigkeit und moderate Schwäche der vorderen Gliedmaßen; und 5 Punkte: vollständige Lähmung aller vier Gliedmaßen und offensichtlich Kurzatmigkeit.
   7. Bewegen Sie die Maus zurück in den Käfig für die Wiederherstellung von Lähmung.
6. Aufräumarbeiten
   1. Spülen Sie die Spritze mit 1 mL sterilem Wasser. Sortieren Sie Laborbedarf zu und sammeln Sie alle nicht-Einweg-Materialien für autoklaviert Sterilisation. Reinigen Sie die Bank mit 70 % Ethanol.

(3) Gewebe Vorbereitung für immunhistochemische Färbung

1. Gewebe-Sammlung
   1. Mäuse auf 21 Tage nach der Injektion mit 3 % Chloral Hydrate (0,1 mL/10 g) tief durch intraperitoneale Injektion zu betäuben.
   2. Technologieprodukte Transcardially mit 20 mL eiskaltem PBS in 0,01 M (NaCl 147 mM; NaH₂PO₄ 1,9 mM; K₂HPO₄ 8,1 mM, pH 7,4) Erstens dann 4 % eiskaltem Paraformaldehyd (in 0,01 M PBS) mit Pumpe (10 mL/min für 1 min, dann 5 mL/min für 9 min).
      Vorsicht: Paraformaldehyd ist giftig und krebserzeugend. Behandeln Sie es nur in der Dunstabzugshaube mit Handschuhen.
2. Dissektion des Rückenmarks und des Gehirns
   1. Befestigen Sie die Gliedmaßen und den Kopf eines jeden Tieres in Bauchlage auf einer Schaum-Kastenabdeckung mit Spritze Nadeln, dann Streifen Sie und entfernen Sie die Haut vom Kopf zum Kreuzbein mit einer Schere.
   2. Clip der Schädels zwischen Augen, neben der mittleren Strecke des Schädels und horizontale Linie auf das Kleinhirn schneiden, dann öffnen Sie den Schädel auf jeder Seite.
   3. Heben Sie das Hinterhauptsbein mit Pinzette und öffnen Sie den Spinalkanal bilateral mit ophthalmologischen Schere. Schneiden Sie die Rippen auf beiden Seiten und entfernen Sie vorsichtig die obere Hälfte der Wirbel.
   4. Heben Sie das Gehirn mit gebogenen Pinzette und trennen Sie die Nerven von der Schädelbasis, dann sezieren Sie vorsichtig heraus, das ganze Gehirn und Rückenmark zu. Nach dem Beheben der Gewebe in 4 % Paraformaldehyd für 24 h.
3. Vorbereitung des Gewebes Scheiben
   1. Cryoprotect das Gehirn und der Hals- und Lendenwirbelsäule Rückenmark in 30 % Saccharoselösung über Nacht bei 4 ° C. Das Gewebe in optimale Arbeitstemperatur (OCT) zusammengesetzte einbetten und schnell mit flüssigem Stickstoff eingefroren.
   2. Schneiden Sie das Gewebe bei 25 µm mit einem Kryostaten und speichern Sie die Gefrierschnitte mit 0,01 M-PBS-Puffer bei 4 ° C einsetzbar.

4. Immunhistochemie

1. Freischwebende Abschnitte in 1 % H₂O₂ für 10 min vorbehandeln, dann waschen mit PBS-Puffer für 10 Minuten Inkubation in eine blockierende Lösung mit 5 % Serum und 0,3 % nicht-ionische Reinigungsmittel mit PBS-Puffer für 1 h.
2. Inkubieren Sie die Scheiben mit entsprechenden Primärantikörper über Nacht bei 4 ° c Die Abschnitte in PBST waschen (0,2 % Tween 20 in PBS) für 30 min (3 Mal für 10 min).
3. Inkubieren Sie die Scheiben mit entsprechenden Biotin-Sekundär-Antikörper bei Raumtemperatur 1 Stunde waschen in PBST für 30 min (3 Mal für 10 min).
4. Die Abschnitte mit Affinität Biotin-Peroxidase-Komplex für 40 min inkubieren und Flecken mit Achromogenic-Agent. Montieren Sie die Abschnitte auf Folien und trocknen Sie richtig.
5. Folien in wasserfreiem Ethanol für 5 min und Xylol für 10 min einweichen, dann die Folien mit einem Eindeckmittel zu versiegeln. Zu guter Letzt Bild Folien mit einem Mikroskop, ausgestattet mit einer Ladung – Coupled Vorrichtung (CCD) bei 100 X 200 X und 400 X Vergrößerungen.

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Ergebnisse

Mäuse zeigten unterschiedliche Grade der vorübergehende Schwäche gleich nach es Injektion AAV Lösung in 1 % Lidocain Hydrochlorid aufgrund unterschiedlicher Qualität der intrathekale Injektion. Nach der semi-quantitative 5 Grade scoring-System haben wir eingerichtet, wir testeten die Transduktion Muster der AAV bei Mäusen mit unterschiedlichem Lidocain-induzierte Gliedmaßen Schwäche (score 0, n = 2; Tor 1, n = 1; Note 4, n = 4; 5, n Punkte = 3). EGFP Immunostaining von Rückenmark...

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Diskussion

Technisch gibt es mehrere wichtige Schritte während der IT-Injektion bei Mäusen wach. Erste, richtige Geste und Firma Kontrolle der Mäuse während der gesamten Operation ist Voraussetzung für die erfolgreiche Zustellung. Zweitens ist der schwierigste Punkt den Bandscheiben Raum mit der Nadelspitze, Gefühl, wie es notwendig, nicht zu tief ohne Widerstand einfügen oder gewaltsam unter starken Widerstand ist bei verletzen die Tiere oder die Nadelspitze biegen einfügen. Drittens, obwohl die vorübergehende Lähmung du...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
FVB/NJ mice	Charles River Laboratories China
Lidocaine hydrochloride monohydrate	HEOWNS	73-78-9
AAV	Viral Vector Core of the Gene Therapy Center at University of Massachusetts Medical School
25 µL  Hamilton syringe/27-30 G needle	GASTIGHT	1702
O.C.T compond	SAKURA	4583
H 2O 2	SHUI HUAN PAI	170401
Goat serum	Solarbio	S9070
Triton X-100	LIFE SCIENCES	T8200
Rabbit anti-GFP	Life tech	G10362	1:333 dilution
The second antibody (goat-anti rabbit)	Jackson Immuno Research	111-005-144	1:1,000 dilution
VECTASTAIN ABC REAGENT	Vector Lab	PK-6100
ImmPACT DAB Peroxidase Substrate Kit	Vector Lab	SK-4105
Mounting medium for fluorescence with DAPI	Vectorshield	H-1200
NaCl	Yong Da Chemical
NaH2PO4·2H2O	Yong Da Chemical
Na2HPO4·12H2O	Yong Da Chemical
Paraformaldehyde	Yong Da Chemical	307699
Adhesion Microscope Slides	CITOGLAS	17083	25 mm x 75 mm
SUPER-SLIP MICRO-GLAS	Electro Microscopy Siences	72236-60	24 mm x 60 mm
15 mL Centrifuge tube	CORNING	430790
96 well cell culture cluster	Coster	3599
24 well cell culture cluster	Coster	3524
70% Ethanol	WEN ZHI
Gauze	Wei AN	05171112	8 cm x 10 cm x 12 cm
1 mL syringe	Hong Da
Microtubes	Plasmed
Micropipet	eppendorf
Peppet tips	Rainin
Centirifuge	eppendorf	5427R
Regerator	Haier	BCD-539WT
Filter	MILLEX GP	R4PA42342
Pump	LongerPump	BT-100-2J/YZ1515X
Microscope	Olympus	BX53
Freezing-microtome	Leica	CM1520