במחלה ישירה הזרקה של וירוסים Adeno-הקשורים רקומביננטי בעכברים מבוגרים

Summary

כאן אנו מציגים טכניקה הזרקה ישירה במחלה באמצעות הידרוכלוריד לידוקאין 1% פתרון ויראלי להבטיח משלוח וירוס יעיל adeno-הקשורים לבעלי חיים קטנים ולהקים מערכת הניקוד לחזות התמרה חושית יעילות המרכזי מערכת העצבים על פי מידת חולשה חולפת הנגרמת על ידי לידוקאין.

Abstract

הזרקת במחלה (IT) של adeno-הקשורים וירוס (AAV) יש עניין רב ב- CNS ריפוי גנטי מכוח את הבטיחות, noninvasiveness, והיעילות התמרה חושית מעולה שלופה מערכת העצבים. מחקרים קודמים הדגימו העוצמה טיפולית של טיפול גנטי המועבר AAV הפרעות ניווניות לפיו המינהל. עם זאת, שיעור גבוה של כשל לא צפוי עקב המגבלה הטכנית של הממשל זה חיות קטנות דווחו. . הנה, הקמנו מערכת הניקוד כדי לציין את מידת ההצלחה מותני אצל בעלי חיים קטנים על-ידי הוספת 1% לידוקאין הידרוכלוריד בתוך תמיסת הזרקה. בהמשך נראה כי מידת החולשה ארעית לאחר ההזרקה ניתן לחזות את יעילות התמרה חושית AAV. לכן, בשיטה זו זריקה זה יכול לשמש כדי למטב טיפולית ניסויים במודלים של העכבר של מחלות מערכת העצבים המרכזית מעשן יותר אזורים רחב של מערכת העצבים.

Introduction

AAV יכולים לתווך גנים בהעברת CNS עם מעט תופעות לוואי לטווח ארוך ונפוץ, ולכן הפך לאחד הרכבים המבטיחים ביותר עבור ריפוי גנטי לטיפול במחלות CNS כולל נוירודגנרטיביות (ALS), הנטינגטון (HD), מחלת אלצהיימר (AD), באנזימים מחלות (LSD), מחלת Gaucher (GD) מחלות ceroid עצביים lipofuscinosis (NCL)¹. כיום, יותר מ-100 AAV אשר נגרמו מהזנים אליהם היה מבודד של בני האדם ובעלי החיים. בין אלה, לפחות 12 השתמשו בפרה, ניסויים קליניים, כולל הנפוץ ביותר בשימוש ג'ין וקטורים כגון AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, rAAVrh.8 ו- rAAVrh.10^{1,2,3,4, 5,6}.

מחלות מערכת העצבים המרכזית שונות דורשות אסטרטגיות שונות משלוח AAV עקב אזורים המושפעים CNS סוגי תאים שונים. CNS אזורים של התא סוגי AAV יכול מגלי משתנה בהתאם serotype כמו גם שיטת מסירה. לדוגמה, rAAVrh10 הוכח מגלי בעיקר האסטרוציטים כאשר נמסר על ידי הזרקה תוך ורידי סיסטמי (IV), ואילו זה transduced נוירונים וגם עכשיו, דונלד כאשר נמסר על ידי במחלה הזרקה^4,7. בנוסף, הביאו parenchyma הזרקת התמרה חושית מקומיים כדי באזור ההזרקה, ואילו זריקה לתוך הנוזל מוחי שדרתי (CSF) דרך ע או הזרקת במחלה, גרמו CNS נפוצה של התמרה חושית⁸ . מחקרים גם הראו עוצמה טיפולית של טיפול גנטי המועבר AAV הפרעות ניווניות לפיו המינהל^9,10,11. מחלות המשפיעות על אזורים רחבים של מערכת העצבים כגון ALS, במחלה הזרקה לתוך CSF הוכח כדי לכסות את רוב אזורים נגועים על ידי המחלה במינון נמוך, בהשוואה למשלוח מערכתית שיטה^4,10. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו גם שאת המותני ניתן להזריק AAV במודלים של העכבר על ALS, אשר מונע פציעות פוטנציאליות המשויך צנתור laminectomy ולא במחלה⁴.

ניסיוני מותני ישירה שימש תחילה למסור סוכנים, בייחוד הרדמה, חוט השדרה שיכוך כאבים, הרדמה 1885^12,13. בדו ח זה, אנו ממחישים הניקוב המותני זה בשיטת הזרקת בעכברים בוגרים בסיועם של 1% לידוקאין הידרוכלוריד, מקומיים אמיד-derived הרדמה, בפתרון הזרקת להעריך, לפקח על איכות הזרקה. זריקות מוצלחות סומנו על ידי לידוקאין-induced שיתוק חולף, בעוד זריקות כושלות לא הראה התנהגות זו. אנו מסווגים את הרמה של חולשה ארעי כאחת חמישה ציונים כדי לעזור לחזות את יעילות הזרקת. לבסוף, אנו מראים כי רמת התמרה חושית rAAVrh10 עשוי להיות שמנבאת את הציון של שיתוק. לכן, שיטת העברה זו במחלה AAV יכול לשמש כדי לשפר את המסירה הגן בתיווך AAV לטיפול ניסיוני של מחלות מערכת העצבים המרכזית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

FVB/NJ עכברים התרבית במתקן בעלי חיים של מעבדה מפתח לנוירולוגיה של חביי. כל עכבר ניסויים היו שאושרו על-ידי השנייה בבית החולים של חביי רפואי אוניברסיטת ועדת האתיקה, עפ י התקנון של ניהול חיות מעבדה שיפורסמו על ידי משרד המדע והטכנולוגיה של הרפובליקה העממית של סין.

1. הכנת 20% לידוקאין הידרוכלוריד פתרון מניות

1. שוקל 2 גר' לידוקאין הידרוכלוריד. להוסיף 5-6 מ"ל של מים סטריליים, מערבולת בעדינות. להגדיל את נפח כולל של 10 מ"ל מים סטריליים.
2. 1.2 לסנן את הפתרון מניות דרך מסננים 0.2-מיקרון. Aliquot הפתרון מניות, 1 מ"ל לכל microcentrifuge 1.5 mL צינור, לאטום אותו עם סרט איטום. חנות ב 4 º C.

2. לכוון את משלוח במחלה AAV בעכברים ער

1. לנגב אזור העבודה באמצעות גזה סטרילית עם 70% אתנול ולהכין את הציוד הנדרש כאמור בטבלה1.
2. להכין µL 100 של AAVrh.10/1% הידרוכלוריד לידוקאין מורכבים על-ידי הוספת µL 95 של rAAVrh10 מניות פתרון (5 x 10¹² הגנום עותקים/mL) לתוך צינור microcentrifuge µL 200 סטרילי, ולהוסיף 5 µL של 20% לידוקאין הידרוכלוריד פתרון מניות. מערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה. לאחר מכן, אחסן את הפתרון וירוס על קרח (4 ° C).
   הערה: µL 8 לכל העכבר⁴ ישמש.
3. הכנת את המזרק עם פתרון AAV להזרקה
   1. להרכיב µL 25 המילטון מזרק עם מחט 27 G, יישר את קצה המחט עם המשקל הנפחי. משופע על המזרק.
   2. צייר µL 8 עם 4 x 10¹⁰ עותקים הגנום של הפתרון וירוס לתוך המזרק בעדינות. הקפד להסיר בועות אוויר.
4. הכנת העכבר
   הערה: עכברים FVB/NJ זכר או נקבה (בן 30-70 ימים) השתמשו במחקר זה. הזרקת זה הופעל בשכונה.
   1. לעקר את אזור העבודה בשכונה עם 70% אתנול. לשים את העכבר ער (זכר או נקבה, 30-70 ימים בת 13 – 20 גרם משקל) bedpiece במצב של שכיבה בשכונה. מכסים את הגוף העליון עם גזה סטרילית כדי להרגיע את העכבר להימנע ננשך.
   2. לתקן את החיה על-ידי כשתפסת כראוי, בחוזקה על המחוך באגן הירכיים שלה עם אגודל על האצבע בצד ובאמצע/לאצבע אחת בצד השני. לשמור על העור בין מחוכים האגן דו צדדיים מתוח כאשר האגודל לאצבע. החזק בעדינות על הגוף העליון של החיה עם כף היד.
   3. לגלח את הפרווה על גבו בין מחוכים האגן דו צדדיים, ולאחר מכן לחטא לפני השטח של העור עם יודיד סקראב ו- 70% אתנול מבוסס.
5. במחלה הזרקת¹²
   1. להרגיש את השטח בין-חולייתי לאורך הקו האמצעי בין מחוכים האגן הדו-צדדיים עם האגודל או לאצבע של היד השנייה והקש ההזחה עם ציפורן כדי לציין את החלל בין-חולייתי L5-L6 (אתר ההזרקה).
   2. לסובב את בסיס הזנב מעט ובעדינות כדי לציין האמצע של עמוד השדרה. להתאים את המסגרת המשופעת המחט אל הראש של החיה לפני ההזרקה (שהוזכר בשלב 2.3.1).
   3. ודא כי החיות הן קבועות בחוזקה, ליישר את המחט לאורך הקו האמצעי של עמוד השדרה.
   4. את המחט בעדינות ואנכית (או להטות מעט 70 – 80°) בצומת של כניסה ולשמור המזרק במטוס sagittal המרכזית. להקטין את הזווית כ 30° באיטיות כאשר הוא מחובר לעצם, ואז להחליק את המחט לתוך המרחב בין-חולייתי.
      הערה: סרט ניכר הזנב פתאומי הוא סימן כניסה מוצלחת לחלל intradural. ברגע שהמחט נכנסת לשטח בין-חולייתי, ירגיש קצה המחט בחוזקה בחוזקה. המחט 27 G השתמשו במחקר זה מתאים למשלוח זה עכברים אך לא חולדות.
   5. להזריק את הפתרון וקטור (שהוזכר בשלב 2.2). להתחיל את הטיימר ולהזריק 8 µL של הפתרון וקטור במהירות של µL/4 1 ס שמור המחט כ 1 דקות לאחר סיום הלידה. לשלוף את המחט עם סיבוב עדין כדי להימנע דולף.
   6. ציון חולשה ארעית של העכבר הגפיים מיד לאחר הלידה כדי להעריך את איכות הזרקה⁴.
      הערה: התקן הוא כדלקמן⁴. ציון 0: חולשה; ציון 1: מינור חולשה של הגפיים האחוריות בלי הילוך חריגות; ציון 2: בינוני חולשה של הגפיים האחוריות עם ההליכה ברור חריגות; ציון 3: להשלים שיתוק של הגפיים האחוריות; ציון 4: להשלים שיתוק של הגפיים האחוריות, קוצר נשימה, חולשה מתונה של הגפיים פור; ציון 5: להשלים שיתוק של כל ארבעת הגפיים, ניכר קוצר נשימה.
   7. להזיז את העכבר בחזרה לכלוב. שחזור משיתוק.
6. ניקיון
   1. לרוקן את המזרק עם 1 מ"ל מים סטריליים. ציוד מעבדה למיין ולאסוף את כל החומרים שאינם חד פעמיות עבור עיקור בלוק. לנקות את הספסל עם 70% אתנול.

3. רקמות הכנה נוגדן

1. אוסף רקמה
   1. עזים ומתנגד עכברים ב 21 ימים שלאחר ההזרקה עם 3% כלורין (0.1 מ"ל של 10 גרם) עמוקות על ידי זריקה בקרום הבטן.
   2. Perfuse transcardially עם 20 מ של 0.01 M קר כקרח PBS (NaCl 147 מ"מ; ₂PO NaH₄ 1.9 מ מ; K₂HPO₄ מ"מ 8.1, pH 7.4) ראשית, ואז 4% קר כקרח paraformaldehyde (ב- PBS 0.01 M) עם משאבה (10 מ ל/דקה עבור 1 דקות, ואז 5 mL/min במשך 9 דקות).
      התראה: Paraformaldehyde הוא מסרטנים רעילים. . להתמודד עם זה רק בשכונה fume בעת לבישת כפפות
2. דיסקציה של חוט השדרה, המוח
   1. לתקן את הגפיים, ראש כל בעל חיים במצב של שכיבה על קופסת קצף לכסות עם מחטי מזרקים, להתפשט ואז מסירים את העור מהראש כדי סקרום עם מספריים.
   2. קליפ הגולגולת בין העיניים, לחתוך לצד המסלול האמצעי של הגולגולת, קו אופקי על המוח הקטן, ואז לפתוח את הגולגולת לשני הצדדים.
   3. הרם את עצם העורף עם פינצטה, לפתוח את תעלת השדרה באופן דו-צדדי עם מספריים אופטלמולוגיות. לחתוך את הצלעות משני הצדדים ולהסיר את החצי העליון של חוליות בקפידה.
   4. תרים את המוח עם פינצטה מעוקל, לנתק את העצבים של בסיס הגולגולת, לאחר מכן לנתח בזהירות החוצה כל המוח ואת חוט השדרה. פוסט-לתקן את הרקמות ב 4% paraformaldehyde במשך 24 שעות ביממה.
3. הכנת הרקמה פרוסות
   1. Cryoprotect המוח ואת חוט השדרה הצווארי, המותני בפתרון 30% סוכרוז למשך הלילה ב 4 º C. להטביע את הרקמה טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) מתחם ומקפיאים מהר עם חנקן נוזלי.
   2. חותכים את הרקמה מיקרומטר 25 באמצעות cryostat ולאחסן הסעיפים קפוא ב- 0.01 M PBS ב 4 ° C לשימוש.

4. אימונוהיסטוכימיה

1. Pretreat לתרשים ובסעיף 1% H₂O₂ למשך 10 דקות ולאחר מכן לשטוף ב- PBS במשך 10 דקות Incubate בפתרון חסימה המכילה 5% סרום, דטרגנט ללא יונית 0.3% ב- PBS לשעה.
2. דגירה את הפרוסות עם נוגדנים העיקרי המקביל בן לילה ב 4 º C. לשטוף בסעיפים PBST (0.2% 20 Tween ב- PBS) במשך 30 דקות (3 פעמים במשך 10 דקות כל אחד).
3. דגירה את הפרוסות עם נוגדן המתאים ביוטין-משני בטמפרטורת החדר במשך ה 1 לרחוץ PBST במשך 30 דקות (3 פעמים במשך 10 דקות כל אחד).
4. דגירה הסעיפים עם זיקה ביוטין peroxidase מורכבים למשך 40 דקות, כתם עם סוכן achromogenic. הר הסעיפים על גבי שקופיות ויבש כראוי.
5. להשרות את השקופיות אתנול נטול מים במשך 5 דקות, קסילן למשך 10 דקות, ואז לאטום את השקופיות עם מדיום הרכבה. לבסוף, תמונה השקופיות עם מיקרוסקופ מצויד עם תשלום מצמידים מכשיר (CCD)-100 x, 200 x ו- 400 x הגדלה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

עכברים הראה דרגות שונות של חולשה חולף מיד אחרי זה הזרקה של פתרון AAV הידרוכלוריד לידוקאין 1% בשל איכות שונות של הזרקת במחלה. על פי כמותיים חצי כיתה 5 מערכת התוצאות הקמנו, בדקנו את הדפוסים התמרה חושית של AAV בעכברים עם דרגות שונות של האיבר לידוקאין-induced חולשה (ציון 0, n = 2; ציון 1, n =...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

טכנית, ישנם מספר שלבים קריטיים במהלך הזריקה זה בעכברים ער. ראשית, ראוי המחווה ושליטה המשרד של העכברים לאורך כל המבצע הוא תנאי מוקדם מסירה מוצלחת. שנית, הנקודה הכי קשה הוא מרגיש את החלל בין-חולייתי עם קצה המחט, כפי שנדרש לא להוסיף יותר מדי עמוק ללא התנגדות או להוסיף בכפייה תחת התנגדות חריפה ב?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FVB/NJ mice	Charles River Laboratories China
Lidocaine hydrochloride monohydrate	HEOWNS	73-78-9
AAV	Viral Vector Core of the Gene Therapy Center at University of Massachusetts Medical School
25 µL  Hamilton syringe/27-30 G needle	GASTIGHT	1702
O.C.T compond	SAKURA	4583
H 2O 2	SHUI HUAN PAI	170401
Goat serum	Solarbio	S9070
Triton X-100	LIFE SCIENCES	T8200
Rabbit anti-GFP	Life tech	G10362	1:333 dilution
The second antibody (goat-anti rabbit)	Jackson Immuno Research	111-005-144	1:1,000 dilution
VECTASTAIN ABC REAGENT	Vector Lab	PK-6100
ImmPACT DAB Peroxidase Substrate Kit	Vector Lab	SK-4105
Mounting medium for fluorescence with DAPI	Vectorshield	H-1200
NaCl	Yong Da Chemical
NaH2PO4·2H2O	Yong Da Chemical
Na2HPO4·12H2O	Yong Da Chemical
Paraformaldehyde	Yong Da Chemical	307699
Adhesion Microscope Slides	CITOGLAS	17083	25 mm x 75 mm
SUPER-SLIP MICRO-GLAS	Electro Microscopy Siences	72236-60	24 mm x 60 mm
15 mL Centrifuge tube	CORNING	430790
96 well cell culture cluster	Coster	3599
24 well cell culture cluster	Coster	3524
70% Ethanol	WEN ZHI
Gauze	Wei AN	05171112	8 cm x 10 cm x 12 cm
1 mL syringe	Hong Da
Microtubes	Plasmed
Micropipet	eppendorf
Peppet tips	Rainin
Centirifuge	eppendorf	5427R
Regerator	Haier	BCD-539WT
Filter	MILLEX GP	R4PA42342
Pump	LongerPump	BT-100-2J/YZ1515X
Microscope	Olympus	BX53
Freezing-microtome	Leica	CM1520