Method Article
ونحن تثبت استخدام التدرجات كثافة متقطع لفصل السكان البكتيرية استناداً إلى إنتاج كبسولة. يتم استخدام هذا الأسلوب لمقارنة كمية كبسولة بين الثقافات، وعزل طفرات مع النمط الظاهري كبسولة محددة، أو لتحديد المنظمين كبسولة. الموصوفة هنا هو الأمثل وتشغيل المقايسة.
كبسولة عامل فوعة رئيسية في العديد من الأنواع البكتيرية، والتوسط للتهرب من المناعة ومقاومة الإجهادات الجسدية المختلفة. حين تتوفر العديد من الطرق لقياس ومقارنة إنتاج كبسولة بين سلالات مختلفة أو طفرات، لا يوجد أي أسلوب المستخدمة على نطاق واسع لفرز البكتيريا على أساس أنها تنتج عن كم كبسولة. قمنا بتطوير طريقة لفصل البكتيريا بمقدار كبسولة، استخدام تدرج كثافة متقطع. يتم استخدام هذا الأسلوب لمقارنة مقادير كبسولة شبه كمي بين الثقافات، لعزل طفرات مع تغيير الإنتاج الكبسولة، وتنقية capsulated البكتيريا من عينات معقدة. هذا الأسلوب يمكن أيضا أن يقترن التسلسل ينقول-الإدراج لتحديد الجينات المشتركة في تنظيم كبسولة. ويتجلى الأسلوب هنا، بالتفصيل، بما في ذلك كيفية تحسين شروط التدرج لأنواع بكتيرية جديدة أو السلالة، وكيفية بناء وتشغيل التدرج الكثافة.
العديد من الأنواع البكتيرية تنتج كبسولة السكاريد، الذي يحمي الخلية البكتيرية من مختلف الضغوط المادية والاعتراف وقتل قبل النظام المناعي. في الكلبسيله الرئوية، إنتاج كبسولة شرط مطلق للعدوى1،2. كبسولة K. الرئوية يتوسط مقاومة الببتيدات المضادة للميكروبات، والمقاومة لقتل مكملاً بوساطة، ومنع البلعمه، وقمع ل الاستجابة المناعية الفطرية3. فائض إنتاج كبسولة يرتبط بزيادة الفوعة والعدوى المكتسبة في المجتمع (بدلاً من المستشفيات)4.
وتتوفر مجموعة من الاختبارات الكمية والنوعية للتحقيق في إنتاج كبسولة. للأنواع الكلبسيله ، وتشمل هذه السلسلة اختبار5، التي يتم سحبها مسواك تطرق إلى مستعمرة صعودا ويقاس طول السلسلة تنتجها، وموكوفيسكوسيتي الإنزيم6، الذي ينطوي على الطرد المركزي بطيئة من ثقافة متبوعاً بقياس الكثافة البصرية للمادة طافية. هذه الأساليب هي بسيطة وسريعة، ولكن تفتقر إلى الحساسية عند استخدامه في الكلاسيكية الكلبسيله سلالات بدلاً من سلالات إفراز كبسولة. هو أسلوب آخر للقياس الكمي كبسولة مقايسة حمض uronic، الذي يمثل تحديا من الناحية التقنية ويتطلب استخدام حامض الكبريتيك تركيز1. وأخيراً، كبسولة مرئياً مباشرة عن طريق الفحص المجهري (الشكل 1A). من هذه الأساليب، إلا مجهرية تسمح للمستخدم لمراقبة الدول كابسوليشن مختلفة داخل مجموعة واحدة من سكان، وأيا من هذه الأساليب تمكن الفصل المادي للبكتيريا كابسولاتيد وغير كابسولاتيد.
تستخدم بشكل روتيني في بيولوجيا الخلايا لتنقية الخلية حقيقية النواة مختلف أنواع7فواصل مبنية على الكثافة بالطرد المركزي التدرج، ولكن نادراً ما تستخدم في الأبحاث الميكروبيولوجية. التحليل موكوفيسكوسيتي الكلبسيله يستند إلى ملاحظة أن البكتيريا capsulated عاليا يستغرق مزيدا من الوقت بيليه بالطرد المركزي، ونحن مسبب أن هذا قد يكون بسبب انخفاض الكثافة الإجمالية من الخلايا كابسولاتيد. الأسلوب هو موضح هنا وضعت لفصل السكان K. الرئوية فعلياً بمقدار كبسولة، استخدام الكثافة المتدرجة الطرد المركزي (الشكل 1). وكان تطبيق هذا الأسلوب بنجاح العقدية الرئوية، مما يشير إلى أنها تنطبق على الأنواع البكتيرية الأخرى. فصل الكثافة--التدرج من مكتبة متحولة ينقول مشبعة مقترنة بالتسلسل ينقول-الإدراج (الكثافة--تراديسورت) وقد استخدمت لتحديد الجينات المشاركة في الإنتاج والتنظيم كبسولة8. وبالمثل، كان استخدام هذا الأسلوب بالاقتران مع عشوائي رئيس الوزراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) من مستعمرات فردية لعزل غير كابسولاتيد الرئوية ك. المسوخ. يمكن أيضا استخدام هذا الأسلوب لمقارنات سريعة لإنتاج كبسولة بين مختلف قطاعات السكان والظروف، أو لتنقية البكتيريا كابسولاتيد من العينات المعقدة (الشكل 1B). وأخيراً، هناك خيار للاعتداء الأخرى تعمل التي تؤثر على كثافة، مثل حجم الخلية أو التجميع.
يوضح كيفية تحسين الإجراءات الخاصة أنواع بكتيرية جديدة أو سلالة هذه المخطوطة ويدل على تشييد وتشغيل التدرج كثافة متقطع لفصل البكتيريا فرط كابسولاتيد وكابسولاتيد وغير كابسولاتيد.
ملاحظة: ضمان الالتزام أي تقييمات المخاطر المطبقة على السلالات البكتيرية إلى عند استزراع ومناولة العينات. كن على علم أن إنشاء تدرجات كثيرة جداً في وقت واحد يمكن أن يؤدي إلى الاضطرابات العضلية الهيكلية بسبب الضغط على مفاصل من بيبيتينج بطيئة المعنية. خطة العمل واتخاذ الاحتياطات اللازمة لتجنب الإصابة.
1-إعداد السلالات البكتيرية أو مكتبات متحولة
2-إعداد اختبار التدرج المصغر وتخفيف التدرج
3-إعداد الخلايا للتجربة الرئيسية
4-إعداد التدرجات كثافة متقطع
ملاحظة: يرد وصف طريقة بديلة لإعداد التدرج من أسفل (أكثر تركيزاً) إلى الأعلى (الأقل تركيز) استخدام ماصة في الخطوة 7.
5-إضافة خلايا المعدة للتدرجات والفصل بالطرد المركزي
6-استعادة عينة الكسور وثمرة الاختياري خطوة
7-أسلوب بديل لإعداد التدرج من أسفل (أكثر تركيزاً) إلى الأعلى (الأقل تركيز) استخدام ماصة
8-قياس مقدار كبسولة بمقايسة حمض Uronic
وتظهر نتائج الممثل في الشكل 2. النتيجة بالضبط أن نتوقع سيتوقف على الأنواع البكتيرية، إنشاء التدرجات الكثافة، وما إذا كان المستخدم هو دراسة سلالة واحدة أو مجموعة من المسوخ. سيتم ترحيل معظم السلالات إلى موقع واحد ضمن تدرج، كما هو مبين في الشكل 2 ألف و 2D. تطبيق الطريقة إلى مكتبة متحولة بكتيرية سوف تؤدي إلى فرقة رئيسية أعلاه التدرج، عصابة أقل كثافة توزيعها عن طريق الطبقة العلوية من التدرج، وكسر أكابسولار طفيفة في الجزء السفلي (الشكل 2ب). تختلف هذه الكسور في كبسولة المبلغ كما هو موضح بفحص للأحماض أورونيك (الشكل 2ب). النتائج ينقول الإدراج تسلسل من كسور الفردية في الترجمة واضحة من طفرات محددة داخل مختلف الكسور التدرج، كما هو مبين على محور التركيب الحيوي كبسولة من ATCC43816 الرئوية ك. (الشكل 2-ج). نتائج تمثيلية لثقافات نقية الرئوية ك. نتوه-K2044 و الرئوية. س.، والتركيب الحيوي كبسولة مختلفة أو طفرات تنظيمية، مبينة في الشكل 2د.
الشكل 1 : التخطيطي أسلوب الطرد المركزي الكثافة لفصل البكتيريا على أساس كبسولة، وتطبيقاتها- (أ) صورة الميكروسكوب الإلكتروني capsulated الكلبسيله الرئوية الخلية. الكبسولة مرئياً كطبقة كثيفة على السطح الخارجي للخلية. (ب) تطبيقات كثافة استخدام الطرد المركزي للدراسة من البكتيريا كابسولاتيد. (Bi) يمكن استخدامها لإنشاء الكسور عالية ومنخفضة، ولا كبسولة من مكتبة متحولة ينقول كثافة الفصل وتليها ينقول الإدراج التسلسل لتحديد الجينات التي تؤثر على إنتاج كبسولة. (Bii) تنقية للبكتيريا كابسولاتيد من عينة معقدة. (بيي) استخدام الفصل القائم على كثافة لمقارنات سريعة كبسولة المبلغ بين العينات. يسمح هذا الأسلوب أيضا تصور إنتاج كبسولة المتباينين في سكان الجرثومي، كما هو مبين في (بيي). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : نتائج الممثل. (أ) مثال للإخراج من اختبارات التدرج المصغر. اثنين مختلفة تم فصل سلالات K. الرئوية في 1 مل من 15% الكثافة المتوسطة التدرج. يتم الاحتفاظ هايبرموكوفيسكوس سلالة نتوه-K2044 فوق الطبقة المتوسطة الكثافة التدرج، حين ترتحل ATCC43816 (مما يجعل أقل كبسولة) إلى الجزء السفلي من الطبقة. (Bi) استخدام التدرج الكثافة لفصل مكتبة ينقول متحولة إلى ثلاثة كسور. علما بأن الكسر أسفل تحتوي على نسبة منخفضة من طفرات وهو غير مرئي على هذه الصورة. (Bii) التحقق من صحة المبالغ كبسولة مختلفة في الأعلى والأوسط، وكسور أسفل باستخدام مقايسة للأحماض أورونيك. خلايا من أسفل الأعلى والأوسط والمتضخمة الكسور كانت معزولة وحراكه في برنامج تلفزيوني ل التطوير التنظيمي600 4، ثم كبسولة السكريات المستخرجة والأحماض أورونيك قياس1. (ج) نتائج المثال الكثافة--تراديسورت. يتم عرض مواقع طفرة حددت بخطوط زرقاء فوق الرسم التخطيطي كروموسوم. ويمكن تحديد طفرات تفتقر إلى كبسولة كتلك التي تكون موجودة في مكتبة الإدخال ولكن تنضب في الأجزاء العليا بينما يجري التخصيب في الجزء السفلي، كما هو موضح هنا ل المكان الحيوي كبسولة8. (د) مثال لاستخدام الكثافة المتدرجة الطرد المركزي لمقارنة كمية كبسولة بين نوع البرية وسلالات متحولة الرئوية ك. نتوه-K2044 و الرئوية س. 23F. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
كبسولة عامل فوعة هامة في العديد من أنواع الجراثيم بما في ذلك الرئوية ك.3، العقدية الرئوية9و راكدة10والأنواع11 نيسريه. على الرغم من أن هناك أساليب مختلفة للقياس الكمي والتصور كبسولات البكتيرية، في الوقت الحاضر هناك أي أسلوب يستخدم على نطاق واسع لفصل الخلايا كابسولاتيد وغير كابسولاتيد جسديا. في هذه المقالة، قد أثبتنا وسيلة قوية للانفصال على أساس كبسولة سكان الجرثومي، مع العديد من التطبيقات المحتملة بالاقتران مع مختلف البروتوكولات المنبع أو المصب.
وجود كبسولة السطحية يمكن أن تقلل من كثافة الخلايا البكتيرية، التي تسمح بفصل بكثافة التدرج الطرد المركزي (الشكل 2د). ونحن قد التحقق من صحة هذا الأسلوب في الرئوية ك. نتوه-K204412 و ATCC4381613 فضلا عن العقدية الرئوية 23F14 وبه Δcps متحولة15. يستخدم هذا الأسلوب بيركول16 كما يمكن أن تكون المكونات الرئيسية للتدرج الكثافة، وهو تعليق جزيئات السليكا الغروية المغلفة له اللزوجة منخفضة ولا سمية تجاه البكتيريا-من حيث المبدأ، مواد أخرى تفي بهذه المعايير يستخدم لإنشاء التدرج الكثافة.
يمكن أن يكون تحديا لضمان أن لا تخلط طبقات مختلفة الكثافة عند بناء كثافة التدرجات، وإذا كان يحدث خلط، طريقة فصل لا تعطي النتائج نظيفة. أدرجنا اثنين من الأساليب البديلة لصب التدرجات، باستخدام إبرة أو ماصة – وكلاهما فعال، والطريقة التي يجب استخدامها هي ببساطة مسألة تفضيل. لجميع الخطوات التي تنطوي على بيبيتينج مادة (أما تعليق بكتيرية، أو طبقة تدرج أكثر مخفف) فوق طبقة متدرجة، بيبيتينج متعددة مختبرين من أحجام أصغر يمكن جعله أسهل لتحقيق واجهة حادة دون أي خلط الطبقات.
حد من هذا البروتوكول أنه لا يمكن ضمان أدائها مع غيرها من الأنواع البكتيرية. ولذلك، من الأهمية بمكان عند دراسة أحد الأنواع البكتيرية الجديدة أو سلالة للتحقق من صحة الفصل القائم على كثافة استخدام أسلوب التقدير الكمي كبسولة إضافية ومستقلة. تصور البكتيريا الموجودة في كل جزء من الفحص المجهري مع البقع كبسولة المناسبة هو أسلوب الموثوق بها التي هي بروتوكولات مفصلة متاحة17. بدلاً من ذلك، يمكن قياسها كمياً الكبسولات المحتوية على الأحماض أورونيك (مثل الإشريكيّة القولونية و الرئوية ك.) قبل مقايسة محددة كما هو مبين في الشكل 2ب1. اختبار موكوفيسكوسيتي المستندة إلى استخدام الطرد المركزي ليست مناسبة كأسلوب للتحقق مستقل، كما يعتمد هذا التحليل أيضا على كثافة الخلايا البكتيرية.
تقييد آخر لهذا الأسلوب هو أن إنتاج كبسولة حساسة جداً لظروف الثقافة، وحتى التغيرات الصغيرة إلى المتوسطة النمو، درجة الحرارة، أو تهوية قد تؤثر على نتائج هذا الفحص. وللحد من هذه المشكلة، الباحثين يمكن استخدام متوسط نمو محددة أو وسيلة معقدة دفعة متسقة وإبقاء كافة المعلمات الأخرى النمو متطابقة بين التجارب وتشمل سلالات المراقبة المناسبة لتمكين تفسير نتائج غير متوقعة . بعض كبسولات البكتيرية هشة ويمكن القص بعيداً عن الخلية عندما يتم بيبيتيد الثقافات. لتجنب إمالة كبسولات، ينبغي فصل الثقافات وحراكه ليس أكثر من مرتين أثناء التحضير للتحميل على التدرج. إذا كان فقدان الكبسولة أثناء تركيز الثقافات ما زالت إشكالية، الثقافات البكتيرية يمكن تطبيقها على تدرج كثافة مباشرة، مع حجم أكبر من تعليق البكتيرية وأضاف إذا لزم الأمر للتصور.
التطبيقات المستقبلية لهذا الأسلوب يتم تطبيقها على الأنواع البكتيرية الأخرى، واستخدام هذا الفصل بالاقتران مع مختلف التكنولوجيات المنبع والمصب. بالإضافة إلى8من الكثافة--تراديسورت، فإننا نقترح أن كثافة الفصل التدرج من البكتيريا كابسولاتيد يمكن أن تستخدم لعزل طفرات مع كبسولة محوره، لتنقية الخلايا كابسولاتيد من الثقافات المختلطة أو العينات المعقدة، وعلى التنميط السريع لإنتاج كبسولة في سلالات متعددة. وأخيراً، يمكن استخدام هذه التكنولوجيا لدراسة أخرى تعمل البكتيرية مثل التجميع.
المؤلفين قد أية مصالح مالية الكشف عن.
ونشكر وانغ جين-المدينة وسوزانا سولتر لتوريد السلالات، وأعضاء الفريق برخيل لإجراء مناقشات مفيدة. تم تمويل هذا العمل من معهد سانغر ويلكوم (منحة ويلكوم 206194)، والسير هنري ويلكوم زمالة ما بعد الدكتوراه إلى F.L.S. (منحة 106063/A/14/Z). ويدعم "سنهم دكتوراه معهد سانغر ويلكوم" M.J.D..
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
Centrifuge 5810R with Rotor A-4-81 and 500 mL buckets | Eppendorf | 5810 718.007 | |
Adapters for 15 mL tubes | Eppendorf | 5810 722.004 | |
Fixed andgle rotor F-34-6-38 | Eppendorf | 5804 727.002 | |
2.6 to 7 mL tube adapter | Eppendorf | 5804 739.000 | |
Centrifuge 5424 including Rotor FA-45-24-11 | Eppendorf | 5424 000.460 | |
2 mL tubes | Eppendorf | 0030 120.094 | |
1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | |
5 mL polypropylene round bottom tube | Falcon | 352063 | |
1 mL disposable syringe Luer slip | Becton Dickinson | 300013 | |
AGANI Needle 21G Green x 1.5" | Terumo | AN 2138R1 | |
P1000 pipette and tips | |||
P200 pipette and tips |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved