Отделяя бактерии капсула величину, с использованием градиента разрывными плотность

Резюме

Мы продемонстрировать использование разрывных плотности градиенты для разделения бактериальных популяций, основанные на капсулы производства. Этот метод используется для сравнения капсула сумму между культурами, изолировать мутантов с конкретным капсула фенотип, или для идентификации капсула регуляторы. Описанные здесь является оптимизация и выполнение анализа.

Аннотация

Капсула является ключевым вирулентности фактором многих бактериальных видов, посредников иммунитета уклонения и сопротивления различным физическим нагрузкам. Хотя многие методы доступны для количественной оценки и сравнения капсулы производства между разными штаммами или мутантов, существует не широко используемый метод сортировки на основе бактерий на сколько капсула они производят. Мы разработали метод, чтобы отделить бактерий капсула величину, с использованием градиента разрывными плотности. Этот метод используется для сравнения капсула суммы полу количественно между культурами, изолировать мутантов с измененной капсулы производства и очистить капсулированной бактерий из сложных образцов. Этот метод может также сочетаться с transposon вставка последовательности для идентификации генов, участвующих в капсуле регулирования. Здесь в деталях, включая как оптимизировать градиента условия для новых видов бактерий или деформации и как создать и запустить градиент плотности демонстрируется метод.

Введение

Многие виды бактерий производить мощной полисахаридной капсулы, которая защищает от различных физических напряжений и признание и убийства бактериальных клеток иммунной системой. В Klebsiella pneumoniaeкапсула производство является абсолютным требованием для инфекции^1,2. K. pneumoniae капсула опосредует нежелание антимикробных пептидов, устойчивость к дополнение опосредованной убийства, предотвращения фагоцитоза и подавление врожденный иммунный ответ³. Избыток капсул производство связано с повышенной вирулентности и сообщества-(вместо внутрибольничные) инфекций⁴.

Широкий спектр количественных и качественных тестов доступны для расследования капсулы производства. Для видов нейтрофилов к ним относятся строки теста⁵, в котором зубочистку коснулся в колонию потянул вверх и измерить длину строки производства и mucoviscosity пробирного⁶, который включает в себя медленный центрифугирования в Культура, следуют измерения оптической плотности супернатант. Эти методы являются простой и быстрый, но не имеют повышенную чувствительность при использовании на классической нейтрофилов штаммов вместо капсулы overproducing штаммов. Другой метод капсула количественной оценки является assay Уроновые кислоты, который является технически сложным и требует использования концентрированной серной кислоты¹. Наконец капсула виден непосредственно при микроскопии (рис. 1A). Из этих методов только микроскопии позволяет пользователям наблюдать различные герметизации государств в рамках одной популяции, и ни один из этих методов позволяет физическое разделение капсулированной и не капсулированных бактерий.

На основе плотности Цветоделение градиентов центрифугированием обычно используются в клеточной биологии для очистки различных эукариотической клетки типа⁷, но редко используются в микробиологических исследованиях. Mucoviscosity assay для нейтрофилов основывается на том наблюдении, что весьма капсулированной бактерий занимают больше времени Пелле центрифугированием, и мы рассудил, что это может быть из-за снижения общей плотности капсулированной клеток. Метод, показанный здесь был разработан для разделения населения K. pneumoniae физически капсула сумму, с помощью градиентного центрифугирования плотности (рис. 1). Этот метод был успешно применен к пневмококк, указав, что она применима к других бактериальных видов. Градиент плотности разделения насыщенных transposon мутант библиотеки в сочетании с transposon вставка последовательности (плотность TraDISort) был использован для идентификации генов, участвующих в капсуле производства и регулирования⁸. Кроме того, этот метод был использован в сочетании с случайными премьер полимеразной цепной реакции (ПЦР) отдельных колоний изолировать не капсулированных K. pneumoniae мутантов. Этот метод также может использоваться для быстрого сравнения капсулы производства между различными группами населения и условий, или очистить капсулированной бактерий из сложных проб (рис. 1B). Наконец существует возможность анализа другие фенотипы, которые влияют на плотность, размер ячейки или агрегирования.

Эта рукопись демонстрируется как оптимизировать процедуры для новых видов бактерий или деформации, а строительство и запуск разрывными плотность градиента для разделения гипер капсулированных, капсулированных и не капсулированных бактерий.

протокол

Примечание: Убедитесь, что любой оценки рисков, применимых к бактериальных штаммов соблюдаются при культивировании и обработки образцов. Имейте в виду, что установка слишком много градиентов в одно время может привести к опорно-двигательного аппарата из-за давления на суставы от Медленное дозирование участвующих. План работы и принять меры предосторожности, чтобы избежать травм.

1. Подготовка бактериальных штаммов или мутант библиотек

1. Полоса из штаммов испытаны на соответствующие агар пластины. Это акции пластины для эксперимента.
   1. Инкубируйте пластины на ночь на желаемую температуру для достижения единого колоний. Для этого эксперимента, культура K. pneumoniae (NTUH-K2044 и ATCC43816 штаммов) на агаре Лурия бульон (LB) при 37 ° C и S. pneumoniae (23F дикого типа и 23F Δcps) на агаре крови в увлажненные свеча банку при 37 ° C.
2. Выберите один колонии от запасов пластины (шаг 1.1) для инокуляции 10 мл соответствующие бульона, с использованием стерильных петлёй или коктейль палку. Для скрининга случайных мутант библиотек, прививать бульон с 10 мкл случайных мутант библиотечного фонда (TraDIS библиотека).
   1. Инкубировать штаммов K. pneumoniae в низкой соли LB СМИ при 37 ° C при встряхивании и штаммов S. pneumoniae в мозг сердца инфузии (BHI) средства массовой информации, статически при 37 ° C.
   2. Передать на ночь культуры 15 мл трубки и центрифуги в центрифугу скамейка Топ 10 мин на 3200 x g в swing из ведра с 15 мл трубки вставки и аэрозолей жесткие крышки.
   3. Отменить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 2 мл 1 x фосфат амортизированное saline (PBS).
      Примечание: Распоряжаться супернатанта через соответствующие жидких биологических отходов маршрут в лаборатории. Центрифугирования и ресуспендирования шагов (1.2.2 и 1.2.3) призвана сосредоточить бактерий для легкой визуализации на градиенте. Бактериальных культур могут быть загружены непосредственно на градиент, если предпочтительнее. Сильно капсулированной штаммы могут не образуют плотный Пелле. Если это происходит, удалить столько супернатанта как можно без удаления любых бактериальных клеток, добавить ПБС окончательный объемом 5 мл и Ресуспензируйте гранулы. Продолжать протокол с шагом 1.2.5.
   4. Для не mucoid штаммов перейдите к шагу 2.
   5. Центрифуга трубы, как описано в пункте 1.2.2.
   6. Отменить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 2 мл ПБС. Клетки в настоящее время готова к использованию.
      Примечание: Плотности суспензии бактериальных клеток не является критическим, но должно быть достаточно для визуализации в градиенте. Минимальная ОД₆₀₀ (оптическая плотность 600 Нм) 4 предлагается.

2. Подготовка градиентного разведений и мини-градиент тест

1. Подготовка градиентного разведениях.
   Примечание: Точные концентрации средний градиент плотности (например, Percoll) необходимы в плотности градиенты для достижения хорошего разделения будет отличаться в зависимости от бактериальный штамм и роста условия, используемые. Мини-градиент тесты выполняются во-первых, для определения концентрации, которые даст лучшее разделение. Они включают в себя 500 мкл одного разрежения в 2-мл пробирку. Если бактерии будут извлечены из градиента и subcultured вниз по течению приложений, эти шаги должны выполняться в асептических условиях.
   1. Объединить градиент средней плотности с ПБС сделать разведений градиента плотности. Сделать разведений 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% и 80% (например,, 2 мл плотности градиента средний плюс 8 мл ПБС = 10 мл 20% плотности градиента среды).
   2. Аликвота 500 мкл градиента разбавления 20% в 2-мл пробирку для каждого штамма проверяется (например, 4 штаммов = 4 пробирки, содержащие 500 мкл градиента 20% раствора).
   3. Повторите шаг 2.1.2 для остальной части градиента разведениях.
2. Применить бактерий к градиенту.
   1. Примените 100 мкл бактериальных клеток, подготовленный в шагах 1.2.3 и 1.2.6 в верхней части каждого градиента разведения следующие действия.
      1. Возьмите 100 мкл клеток с помощью пипетки 200 мкл и поместите наконечник пипетки на стороне трубки чуть ниже мениска мини-градиента.
      2. Аспирационная бактериальные клетки на градиент крайне медленно, так, что они образуют слой на вершине градиент, без смешивания интерфейса.
      3. Повторите шаги 2.2.1.1–2.2.1.2 для всех штаммов для проверки.
   2. С помощью ротора фиксированный угол с плотной крышкой аэрозоля, центрифуга подготовленный трубы в microcentrifuge 10 мин на 8000 x g.
   3. После центрифугирования передачи трубы к стойке для визуализации минимальный градиент разрежения, требуется сохранить клетки чуть выше градиент слой после центрифугирования.
   4. Если результаты не ясны, повторите тест мини-градиент с шагом 5% плотность градиента средних разведений выше и ниже концентраций, определенных в шаг 2.1.1 (например, 25% и 35% разбавления должны быть протестированы если неоднозначный результат на 30%).
      Примечание: Смотрите Рисунок 2A для типичные результаты в одной плотности градиента средних разрежения.
   5. Используйте результаты из 2.2.3–2.2.4 шаги для определения идеального градиента разведений использовать для разделения клетки в крупных разрывных градиентов.

3. Подготовка клеток Главный эксперимент

1. Подготовьте свежие ночи культур, прививки 10 мл бульона, соответствующих, как описано в шаге 1.2.
   1. Инкубируйте культур на ночь в надлежащих условиях, как описано в пункте 1.2.1.
   2. Пелле ночь культуры, как описано в пункте 1.2.2.
2. Вымойте клетки, как описано в шаге 1.2.3.
3. Отменить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 1 мл ПБС. Если штамм является mucoid и не легко Пелле, Ресуспензируйте гранул до 2 мл PBS или остаточных средств массовой информации. Клетки в настоящее время готова к использованию.

4. Подготовка разрывными плотности градиенты

Примечание: Альтернативный метод градиентного подготовки к началу (наименее концентрированный) с помощью пипетки снизу (наиболее сосредоточены) описано в шаге 7.

1. Пипетка 1 мл наиболее разбавляют разбавления градиента плотности в 5 мл полипропиленовые круглая труба внизу сформировать верхний, наиболее разбавляют, слой градиента.
   Примечание: последующие слои более концентрированной градиента разведений будут добавлены ниже этот слой с помощью иглы, чтобы не нарушить слои. Как минимум двух и максимум три градиентного слоя 1 мл рекомендуются для надежной сепарации и легко визуализации бактерий.
   1. Использование одноразовой шприц 1 мл с иглой 1,5 дюймовый придает, принимать 1 мл следующий наиболее концентрированным плотность градиента средних разбавления в шприц. Избегайте брать вверх воздух, как пузыри могут нарушить градиента слои.
   2. Поместите конец иглы в нижней части трубки, содержащий первый слой. Аспирационная содержимое шприца очень медленно, чтобы избежать смешивания интерфейс.
      Примечание: Интерфейс двух разведений будет расти как добавляется более концентрированной градиента разрежения. Наблюдать за интерфейс, удерживая его до света или за пределами окна. Если собственный интерфейс не наблюдается, отменить градиента и начать снова.
      1. Удалите иглу из градиента очень осторожно, чтобы не нарушить взаимосвязи между различными градиента разведениях. Поместите трубку в стойку держать его вертикально.
   3. Если с помощью трех различных разведениях, повторите шаги 4.1.1–4.1.2.1 так, что плотная разрежения в нижней. Если градиент был создан успешно, будет существовать три различных слоев с без смешивания на интерфейсы.

5. Добавление подготовленного клетки градиентов и разделения центрифугированием

1. Мкл 600 подготовленных клеток из шага 3.3 в верхнюю часть градиента в трубе очень медленно и без смешивания интерфейс, как описано в шаге 2.2.
2. Трубы в трубку адаптеры и весят комбинированных адаптеры и трубы, чтобы убедиться, что они являются сбалансированными.
   1. Поместите трубки адаптеры в ротор фиксированный угол в пределах настольная центрифуга. Центрифуги для 30 мин при 3000 x g.
   2. После центрифугирования тщательно удалить трубы, поместите их в стойку и сфотографировать результаты как запись.
3. Восстановить бактериальных фракций Уроновые кислоты количественной оценки или экстракции ДНК, следуя шаг 6.
   1. Если нисходящие приложения не требуются, распоряжаться образцы/градиенты через соответствующие жидких биологических отходов маршрут в лаборатории.
      Примечание: Важно проверить разделения для новых видов/штаммов бактерий. Отдельных фракций из градиента должны быть изучены при микроскопии, Уроновые кислоты пробирного (шаг 8), или другой подходит количественного анализа для подтверждения капсула фенотип каждой фракции. Если цель состоит в том, чтобы отделить на основе агрегирования или размер ячейки, следует использовать независимые соответствующие анализы.

6. Восстановление образец дроби и необязательные нарост шаг

1. Восстановить фракций из градиента, удалив и отбрасывая любые жидкости из верхнего разрежения, если нет бактериальных фракция присутствует в этом слое.
   1. Чтобы удалить верхней доли, использовать пипетку Р200 и мягко пройти кончик пипеткой через градиент на долю и занять долю. Поместите часть в 1,5 мл трубку и маркировать соответствующим образом.
   2. Для восстановления дальнейшего фракций, по-прежнему используя пипетку P200, вставьте наконечник мягко через градиент на долю и восстановить дробь к свежим 1,5 мл. Удалите избыток градиента как внизу градиент дроби доступны.
   3. Если экстракции ДНК из фракции, содержащие числа очень низкой клеток (например, для плотности TraDISort), субкультура фракция, следуя протоколу от шага 6.2 для факультативного нарост получить больше клеток.
      Примечание: Там будет низкий уровень уноса от клеток в верхней части градиента в нижней доли, как фракций удаляются сверху донизу. Минимизировать это, работая осторожно чтобы не смешивать градиент, используя иглы для удаления нижней доли и, выполняя повторной очистки очень низкой обилие образцов где уноса может повлиять на результаты.
2. Передача клетки от фракции низкой изобилие, восстановленные в 6.1.1–6.1.2 шаги в 5 мл соответствующих жидких сред. Место в инкубаторе и расти в течение 2 ч при 37 ° C.
   1. После 2 ч роста или когда образец достигла ОД₆₀₀ 1 передачи культуры в 15 мл. Центрифуга трубки для 10 мин на 3200 x g в центрифуге с качели из ведра и крышки плотно аэрозоля. Отбросить супернатант
   2. Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл ПБС.
3. Подготовьте свежие сингл концентрация плотности градиент в 5 мл полипропиленовые трубы. Используйте градиент концентрации от чуть выше расположение фракции в оригинальной градиента (например, для очистки ΔslyA мутант, показано в рисунке 2D, будет использоваться средний градиент плотности 15%).
   Примечание: этот шаг повторной очистки является необязательным.
   1. Применить клетки к верхней части градиента и центрифуги, как описано в шагах 2.2 и 5.1.
   2. Удаление трубы из центрифуги и место в соответствующей стойке. Сфотографировать градиента и восстановить часть для экстракции ДНК как описано в 6.1 – 6.1.2.
      Примечание: Образец теперь готов для экстракции ДНК или другие нисходящие приложения.

7. альтернативный метод для градиента приготовления к началу (наименее концентрированный) с помощью пипетки снизу (наиболее концентрированные)

1. Используйте градиент разведений, определенный на шаге 2.2.3. С помощью пипетки 1000 мкл, добавьте 1 mL плотной градиента разрежения в 5 мл трубку.
   1. С помощью пипетки 200 мкл, добавьте 200 мкл следующий плотной градиента разбавления очень медленно в верхней части слоя в трубе, чтобы не смешивать интерфейс. Добавьте еще 200 мкл и затем окончательный 600 мкл. Добавление несколько меньшие объемы дает больше контроля над дозирования скорость и предотвращает смешивание интерфейса. Если интерфейс смеси, удалить и начать снова.
   2. Повторите шаг 7.1.1 с третьего, наименее плотные градиента концентрации, если используются три разведения. Трубки должны теперь иметь градиенты 2 мл или 3 мл в зависимости от результатов от шага 2.2.3.
   3. Перейдите к шагу 5 протокола для добавления ячеек и продолжить эксперимент.

8. измерение количества капсула, Уроновые кислоты Assay

1. Отрегулируйте ОД₆₀₀ каждой восстановленной фракции до 4.0 разрежения с PBS. Продолжите с квантификацией уроновых кислот как ранее опубликованные¹.

Результаты

Представитель результаты показаны на рисунке 2. Ожидать точный результат будет зависеть от бактериальных видов, создание градиентов плотности, и ли пользователь рассматривает один штамм или пул мутантов. Большинство штаммов будут мигрировать в одном месте в пределах градиент, как показано на рисунке 2А и 2D. Применение метода в библиотеке бактериальной мутант вызовет основных группы выше градиент, менее плотной группы, распространяются через верхний слой градиента, и незначительных acapsular фракции в нижней части (рис. 2B). Эти фракции различаются в капсуле сумму как показано assay для Уроновые кислоты (рис. 2B). Transposon вставки последовательность отдельных фракций приводит к четкой локализации конкретных мутантов внутри фракций градиента, как показано для капсула биосинтез Локус ATCC43816 K. pneumoniae (рис. 2C). Представитель результаты для чистых культур K. pneumoniae NTUH-K2044 и S. pneumoniaeи различных капсульных биосинтез или регулирования мутантов, показаны на рисунке 2D.

Рисунок 1 : Схема метода центрифугирования плотности для разделения бактерий, основанные на капсулу и ее приложений. (A) изображение электронной микроскопии капсулированной Klebsiella pneumoniae ячейка. Капсула виден как плотным слоем на внешней стороне клетки. (B) приложения центрифугирования плотности к изучению капсулированной бактерий. (Bi) Плотность разделения могут быть использованы для создания высокой, низкой и без капсула фракций transposon мутант библиотеки и следуют последовательности вставки transposon определить гены, которые влияют капсулы производства. (ВП) Очистка капсулированной бактерий из сложных образца. (Biii) Использование на основе плотности разделения для быстрого сравнения количества капсулы между выборками. Этот метод также позволяет визуализировать разнородные капсулы производства в бактериальных популяций, как показано на (Biii). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 : Представитель результаты. (A) пример вывода из тестов мини-градиент. Два различных штаммов K. pneumoniae были центрифугируется на 1 мл 15% плотность градиента среды. Hypermucoviscous NTUH-K2044 штамм сохраняется выше плотность градиента среднего слоя, в то время как ATCC43816 (которая делает меньше капсула) мигрирует в нижней части слоя. (Bi) Использование градиента плотности для разделения transposon мутант библиотеки на три фракции. Обратите внимание, что нижняя часть содержит низкий процент мутантов и не видна на снимке. (ВП) Проверка различных капсульных сумм в верхней, средней и нижней фракции, используя assay для уроновых кислот. Уроновые кислоты измеряется¹и клетки от верхней, средней и перерос нижней доли были изолированы и высокомобильна в PBS ОД₆₀₀ 4, затем капсулы полисахариды извлечены. (C) пример плотности TraDISort результаты. Мутация места определены обозначены синими линиями выше схеме хромосомы. Мутанты не хватает капсулы можно определить как те, которые присутствуют во входной библиотеке, но истощаются в верхней доли во время обогащается в нижней доли, как показано ниже для Локус капсула биосинтеза⁸. (D) пример использования для сравнения капсула сумму от дикого типа и мутантов штаммов K. pneumoniae NTUH-K2044 и S. pneumoniae 23F плотность градиентного центрифугирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Капсула является важным вирулентности фактором многих бактериальных видов, включая K. pneumoniae³, пневмококк⁹, Acinetobacter¹⁰и¹¹ видов Neisseria. Хотя существуют различные методы для количественной оценки и визуализации бактериальной капсулы, в настоящее время существует не широко используется метод физически отделить капсулированной и не капсулированных клетки. В этой статье мы продемонстрировали надежный метод для разделения на основе капсула бактериальных популяций, с несколько потенциальных приложений в сочетании с различными протоколами, вверх или вниз по течению.

Присутствие поверхности капсулы может уменьшить плотность бактериальных клеток, который позволяет разделение по плотности градиентного центрифугирования (Рисунок 2D). Мы подтвердили этот метод в K. pneumoniae NTUH-K2044¹² и ATCC43816¹³ , а также в пневмококк 23F¹⁴ и его Δcps мутант¹⁵. Этот метод использует Percoll¹⁶ как главной составляющей градиента плотности, который представляет собой суспензию покрытием кремнезема коллоидных частиц, что имеет низкую вязкость и отсутствие токсичности по отношению к бактерии - в принципе, другие вещества, соответствующие этим критериям может быть используется для создания градиента плотности.

Это может быть сложным для обеспечения что слои различной плотности не смешиваются при построении плотности градиенты, и если смешивания происходит, метод разделения не дадут чистые результаты. Мы включили два альтернативных методов для наливания градиенты, с помощью иглы или пипетки — оба являются эффективными, и какой метод использовать это просто вопрос предпочтения. Для всех шагов, которые включают дозирование вещества (бактериальный подвеска, или более разбавленный слой градиента) выше слой градиента закупорить несколько аликвоты небольших объемов может сделать его легче добиться резкого интерфейс без перемешивания слоев.

Ограничение этого протокола является, что не может быть гарантировано его производительность с другими бактериальными видами. Таким образом важно, при рассмотрении новых видов бактериальных или деформации для проверки на основе плотности разделения с помощью метода дополнительные, независимые капсула количественной оценки. Визуализация бактерий, присутствующих в каждой фракции при микроскопии с соответствующим капсула пятна является надежным методом, для которого подробные протоколы, доступные¹⁷. Кроме того капсулы, содержащие уроновых кислот (например, кишечной палочки и K. pneumoniae) могут быть количественно определенных пробирного как показано на рисунке 2B¹. Тест на основе центрифугирования mucoviscosity не подходит как метод независимой проверки, как этот assay также зависит от плотности бактериальных клеток.

Еще одним ограничением этого метода, что капсулы производства очень чувствителен к условиям культуры и даже небольшие изменения, рост средний, температура, или аэрации могут повлиять на результаты этого анализа. Чтобы свести к минимуму эту проблему, исследователи можно использовать определенный рост средний или партии последовательного комплекса среднего, держать все остальные параметры роста идентичные между экспериментов и включают штаммы соответствующий элемент управления для включения интерпретации неожиданных результатов . Некоторые бактериальной капсулы являются хрупкими и можно наклонять от ячейки, когда накапаны культур. Чтобы избежать сдвига капсулы, культур следует центрифугируют и высокомобильна не более чем в два раза во время подготовки к загрузке на градиенте. Если потеря капсулы во время концентрация культур остается проблематичным, бактериальных культур может применяться к градиент плотности напрямую, с большего объема бактериальной подвеска Добавлено при необходимости для визуализации.

Будущих приложений этот метод, чтобы применить его к другим бактериальных видов и использовать это разделение в сочетании с различными технологиями вверх и вниз по течению. В дополнение к плотности TraDISort⁸мы рекомендуем, что градиент плотности разделения капсулированной бактерий могут использоваться для изоляции мутантов с измененной капсуле, для очистки капсулированной клеток от смешанных культур или сложных образцов и для Быстрое профилирование капсулы производства в нескольких штаммов. Наконец эта технология может использоваться для изучения других бактериальная фенотипов например агрегации.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Centrifuge 5810R with Rotor A-4-81 and 500 mL buckets	Eppendorf	5810 718.007
Adapters for 15 mL tubes	Eppendorf	5810 722.004
Fixed andgle rotor F-34-6-38	Eppendorf	5804 727.002
2.6 to 7 mL tube adapter	Eppendorf	5804 739.000
Centrifuge 5424 including Rotor FA-45-24-11	Eppendorf	5424 000.460
2 mL tubes	Eppendorf	0030 120.094
1.5 mL tubes	Eppendorf	0030 120.086
5 mL polypropylene round bottom tube	Falcon	352063
1 mL disposable syringe Luer slip	Becton Dickinson	300013
AGANI Needle 21G Green x 1.5"	Terumo	AN 2138R1
P1000 pipette and tips
P200 pipette and tips