Method Article
נדגים את השימוש צפיפות מקוטע הדרגתיים כדי להפריד בין אוכלוסיות חיידקים המבוססת על ייצור כמוסה. שיטה זו משמשת כדי להשוות בין כמות קפסולה בין תרבויות, לבודד מוטנטים עם פנוטיפ קפסולה ספציפית, או כדי לזהות הרגולטורים כמוסה. המתוארים כאן הוא אופטימיזציה ריצה של וזמינותו.
הקפסולה היא גורם מפתח התקפה אלימה חיידקי מינים רבים, מתווכים חיסוניים התחמקות, עמידות בפני לחצים פיזיים שונים. בעוד שיטות רבות זמינים לכמת ולהשוות ייצור קפסולה בין זנים או מוטציות, לא קיימת בשימוש נרחב שיטה למיון חיידקים מבוססת על כמה כמוסה שהם מייצרים. פיתחנו שיטה להפרדת חיידקים על ידי כמות קפסולה, באמצעות הדרגה צפיפות מקוטע. שיטה זו משמשת כדי להשוות כמויות קפסולה באופן כמותי למחצה בין תרבויות, לבודד מוטנטים עם ייצור קפסולה מסולף, לטהר את החיידקים capsulated מדגימות מורכבים. שיטה זו יכולה גם להיות יחד עם transposon-הכניסה רצף לזיהוי גנים המעורבים בוויסות כמוסה. כאן, השיטה הוא הפגין בפירוט, כולל כיצד לייעל את התנאים הדרגתיות עבור מינים חדשים חיידקי או זן, וכיצד לבנות ולהפעיל את ההדרגה צפיפות.
מינים חיידקיים רבים מייצרים קפסולה רב-סוכר, אשר מגנה את תא החיידק לחצים פיזיים שונים, זיהוי והרג על-ידי המערכת החיסונית. קלבסיאלה pneumoniae, ייצור קפסולה היא דרישה מוחלטת זיהום1,2. ק' pneumoniae כמוסה שמתווכת עמידות מיקרוביאלית פפטידים, עמידות הרג בתיווך המשלים, מניעת phagocytosis ולאחר דיכוי של תגובה חיסונית מולדת3. ייצור עודף קפסולה משויכת התקפה אלימה מוגברת וזיהומים רכשה הקהילה (ולא nosocomial)4.
מגוון של בדיקות והמעצרים כמותיים זמינים לחקור ייצור כמוסה. עבור מינים קלבסיאלה , אלה כוללים את מחרוזת הבדיקה5, בו קיסם נגע למושבת נמשך כלפי מעלה, למדוד אורך המחרוזת המיוצר, ו mucoviscosity assay6, אשר מערבת את צנטריפוגה איטי של תרבות ואחריו מדידת צפיפות אופטית תגובת שיקוע. שיטות אלה פשוטה ומהירה, אך חסרי רגישות בעת שימוש בקלאסית קלבסיאלה זנים ולא קפסולה זנים יצרה יותר מדי. שיטה נוספת של כימות קפסולה היא וזמינותו חומצה uronic, אשר הוא טכנית מאתגר ודורש השימוש של חומצה גופרתית מרוכזת1. לבסוף, כמוסה מוצגת ישירות על ידי מיקרוסקופ (איור 1 א'). השיטות האלה, רק במיקרוסקופ מאפשר למשתמש לצפות capsulation שונה הברית בתוך אוכלוסיה אחת, אף אחת משיטות אלה מאפשר ההפרדה הפיזית של חיידקים capsulated-capsulated.
הפרדות צבע מבוססות-צפיפות על ידי צנטריפוגה הדרגתיות משמשים באופן שגרתי לטהר את סוגי התאים האיקריוטים7ב ביולוגיה של התא, אך משמשים לעתים נדירות במחקר מיקרוביולוגית. וזמינותו mucoviscosity עבור קלבסיאלה מתבסס על התצפית כי חיידקים capsulated מאוד לארוך זמן רב יותר כדי הצניפה על ידי צנטריפוגה, אנחנו הסיק כי ייתכן שהסיבה מופחתת הכוללת צפיפות של תאים capsulated. השיטה המוצגת כאן פותחה כדי להפריד בין אוכלוסיות ק' pneumoniae פיזית על ידי כמות קפסולה, באמצעות צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות (איור 1). שיטה זו הופעלה בהצלחה pneumoniae סטרפטוקוקוס, המציין כי זה החלים מיני חיידקים אחרים. צפיפות-הדרגה ההפרדה של ספריית מוטנטים רוויים transposon יחד עם transposon-הכניסה רצף (צפיפות-TraDISort) שימש לזיהוי גנים המעורבים קפסולה ייצור, תקנה8. באופן דומה, שיטה זו שימשה בשיתוף עם פריים אקראי תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) של מושבות בודדות כדי לבודד-capsulated ק' pneumoniae מוטציות. שיטה זו יכולה לשמש גם להשוואות מהירה של קפסולה ייצור בין אוכלוסיות שונות בתנאים, או לטהר חיידקים capsulated מדגימות מורכבים (איור 1B). לבסוף, יש האפשרות assay פנוטיפים אחרים המשפיעים על צפיפות, כגון גודל התא או צבירה.
כתב יד זה מדגים כיצד לייעל את ההליך עבור מינים חדשים חיידקי או זן ומדגים את הבנייה ואת הריצה של מעבר הדרגתי צפיפות רציף כדי להפריד בין חיידקים היפר-capsulated, capsulated ו- capsulated.
הערה: ודא כי כל הערכות סיכונים החלים זני חיידקים הם דבקו כאשר culturing וטיפול דגימות. שימו לב כי הקמת מעברי צבע מדי בבת אחת יכולה להוביל בהפרעות שרירים עקב הלחץ על המפרקים מ איטי pipetting מעורב. תוכנית עבודה ולנקוט אמצעי זהירות כדי למנוע פציעות.
1. הכנת זני חיידקים או ספריות מוטציה
2. הכנת דילולים הדרגתיות ובדיקה הדרגתי מיני
3. הכנה של תאים הניסוי הראשי
4. הכנה של מעברי צבע צפיפות מקוטע
הערה: שיטה חלופית של הכנה הדרגתיות מלמטה (הכי מרוכז) למעלה (לפחות מרוכז) באמצעות פיפטה מתואר בשלב 7.
5. הוספת תאים מוכן מעברי צבע והפרדה על ידי צנטריפוגה
6. מחלים דוגמת שברים ומספרים שלב תוצר אופציונלי
7. שיטה חלופית להכנה הדרגתיות מלמטה (הכי מרוכז) למעלה (לפחות מרוכז) באמצעות פיפטה
8. מדידה של כמות קפסולה על ידי חומצה Uronic Assay
נציג התוצאות מוצגות באיור2. התוצאה המדויקת לצפות יהיה תלוי בזן חיידקי, הסידור של מעברי צבע צפיפות, ובודקים אם המשתמש הוא זן יחיד או הבריכה של מוטציות. רוב זני להעביר למיקום יחיד בתוך הדרגתי, כפי שמוצג באיור 2A ו- 2D- החלת שיטת ספריית מוטנטים חיידקי יהיה להצמיח להקה גדולה מעל המילוי ההדרגתי, להקה פחות צפוף מופץ דרך השכבה העליונה של מעבר הצבע, שבר acapsular מינור בתחתית (איור 2B). אלו שברים שונים בכמות קפסולה כפי שמוצג על ידי וזמינותו עבור חומצות uronic (איור 2B). Transposon רצף הכניסה של שברים בודדים התוצאה ברורה לוקליזציה של מוטציות ספציפיות בתוך שברים מעבר צבע שונה, כפי שמוצג על מיקומה ביוסינטזה קפסולה של ק' pneumoniae ATCC43816 (איור 2C). נציג תוצאות תרבויות טהור של pneumoniae ק' NTUH-K2044, pneumoniae ס, ו שונה ביוסינטזה קפסולה או מוטציות רגולטוריות, מוצגים באיור 2D.
איור 1 : סכימטי של השיטה צנטריפוגה צפיפות כדי להפריד בין חיידקים בהתבסס על קפסולה, ושימושיה. (א) תמונה מיקרוסקופ אלקטרונים של capsulated קלבסיאלה pneumoniae התא. הקפסולה מוצגת כשכבה צפופה על החלק החיצוני של התא. (B) יישומים של צפיפות צנטריפוגה לחדר העבודה של חיידקים capsulated. (Bi) צפיפות ההפרדה ניתן להיות המשמש ליצירת שברים גבוה - נמוך-, לא-כמוסה של ספריית מוטנטים transposon, ואחריו transposon רצף הכניסה להגדרת גנים המשפיעים על ייצור כמוסה. (Bii) טיהור של חיידקים capsulated מתוך מדגם מורכבים. (ביל) השימוש ההפרדה מבוססת-צפיפות להשוואות מהירה של סכום קפסולה בין דגימות. שיטה זו מאפשרת גם הפריט החזותי של ייצור כמוסה heterogenous אוכלוסיות חיידקים, כפי שמוצג (ביל). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : תוצאות נציג. (א) דוגמה של הפלט מבדיקות הדרגתי המצומצמת. שני שונים זנים pneumoniae ק' היו centrifuged על 1 מ"ל של 15% צפיפות בינונית הדרגתיות. Hypermucoviscous NTUH-K2044 המתח נשמר מעל צפיפות הדרגתיות שכבת בינוני, ואילו ATCC43816 (מה שהופך את הקפסולה פחות) יועברו לתחתית של השכבה. (Bi) השימוש הדרגתי צפיפות כדי להפריד בין ספריה מוטציה transposon לתוך שלושה שברים. שימו לב כי השבר התחתון מכיל שיעור נמוך של מוטציות, אינה מוצגת בתמונה זו. (Bii) אימות של כמויות שונות קפסולה העליון, האמצעי, שברים התחתון שימוש assay חומצות uronic. תאים מהחלק התחתון העליון, האמצעי ו גדולים מדי שברים היו מבודדים, resuspended ב- PBS יתר600 של 4, ואז קפסולת פוליסכרידים שחולצו ומדד חומצות uronic1. (ג) דוגמה צפיפות-TraDISort תוצאות. מוטציה במיקומים זיהה מוצגים על-ידי קווים כחולים מעל הדיאגרמה כרומוזום. ניתן לזהות מוטציות חסר כמוסה כמו אלה נמצאים בספריה קלט, אך דלה של השבר העליון תוך כדי להיות מועשר השבר התחתון, כמוצג כאן הביוסינתזה קפסולה לוקוס8. (ד) דוגמה של שימוש דחיסות צבע צנטריפוגה כדי להשוות בין כמות קפסולה בין פראי סוג מוטציה זנים של ק' pneumoniae NTUH-K2044 ו- ס' pneumoniae 23F. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
כמוסת הוא גורם חשוב התקפה אלימה במינים חיידקים רבים, כולל ק' pneumoniae3, סטרפטוקוקוס pneumoniae9, Acinetobacter10ו11 Neisseriaמינים. למרות שיטות שונות קיימים עבור כימות והדמיה של קפסולות חיידקים, כיום לא קיימת בשימוש נרחב שיטה להפרדת פיזית תאים capsulated ו- capsulated. במאמר זה, הראו שיטה חזקה מבוססת-קפסולת הפרדה בין אוכלוסיות חיידקים, עם מספר יישומים פוטנציאליים בשיתוף עם פרוטוקולים שונים במעלה או במורד הזרם.
הנוכחות של קפסולה משטח יכול להפחית את צפיפות תא החיידק, אשר מאפשר הפרדה על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות (איור 2D). הבדיקה והאימות בשיטה זו pneumoniae ק' NTUH-K204412 ו- ATCC4381613 וכן pneumoniae סטרפטוקוקוס 23F14 ו מוטנטיםcps 15שלה Δ. שיטה זו משתמשת Percoll16 כמו המכוננת הראשי של המילוי ההדרגתי צפיפות, אשר הוא השעיה של מצופה סיליקה colloidal חלקיקי בעל צמיגות נמוכה, אין הרעלת לכיוון חיידקים - בעקרון, חומרים אחרים ישיבות קריטריונים אלה יכול להיות להשתמש בה כדי לקבוע מעבר הצבע צפיפות.
זה יכול להיות מאתגר כדי להבטיח כי אל תערבב בין שכבות של צפיפות שונה כאשר בונים צפיפות מעברי צבע, אם ערבוב מתרחשות, שיטת ההפרדה לא ייתן תוצאות נקיות. כללנו בשתי שיטות חלופיות למזיגה של מעברי צבע, באמצעות מחט או פיפטה של – שניהם יעילים, באיזו שיטה להשתמש זה פשוט עניין של העדפה. עבור כל השלבים המערבות pipetting חומר (השעיה חיידקי, או שכבה הדרגתיות ובדילול) מעל שכבת צבע, pipetting aliquots מרובים של אמצעי אחסון קטן יותר יכול להקל על מנת להשיג ממשק חד ללא ערבוב של שכבות.
מגבלה של פרוטוקול זה היא כי לא ניתן להבטיח את הביצועים שלו עם מיני חיידקים אחרים. לכן, חיוני בעת בחינת מין חיידקים חדשים או להתאמץ כדי לאמת את ההפרדה מבוססת-צפיפות באמצעות שיטת כימות קפסולה נוספים, עצמאית. להמחיש את החיידקים נוכח כל שבר על ידי מיקרוסקופ עם כתמי קפסולה המתאימה היא שיטה אמינה אשר הם פרוטוקולים מפורט זמין17. לחלופין, ניתן לכמת קפסולות המכילה חומצות uronic (כגון אלה של Escherichia coli וק' pneumoniae) על ידי assay ספציפיים כפי שמוצג באיור 2ב'1. המבדק מבוסס צנטריפוגה mucoviscosity אינה מתאימה כשיטת אימות עצמאית, כמו assay זה גם תלוי הצפיפות של תאים חיידקיים.
הגבלה נוספת של שיטה זו היא ייצור קפסולה היא רגישה מאוד תרבות תנאי, אפילו שינויים קטנים מדיום הגידול, טמפרטורה, או לערבב עשויים להשפיע על התוצאות של זה וזמינותו. כדי למזער את הבעיה, חוקרים יכול להשתמש מדיום הגידול מוגדרים או מדיום מורכבים אצווה-עקבי לשמור פרמטרים אחרים הצמיחה זהים בין ניסויים, כולל זנים הפקד המתאים כדי לאפשר את הפרשנות של תוצאות בלתי צפויות . קפסולות חיידקים מסוימים הם שבירים, ניתן להטות מן התא כאשר תרבויות הם pipetted. כדי למנוע הטיה של קפסולות, תרבויות צריכה להיות centrifuged, resuspended לא יותר מפעמיים במהלך הכנה טעינה במעבר הצבע. אם אובדן של הקפסולה במהלך הריכוז של התרבויות נשאר בעייתי, תרבויות חיידקי ניתן להחיל על מעבר הדרגתי צפיפות ישירות, עם נפח גדול יותר של הבולם חיידקי הוסיף במידת הצורך עבור פריט חזותי.
יישומים עתידיים של שיטה זו הם כדי להחיל אותה על מיני חיידקים אחרים, וכדי להשתמש ההפרדה הזאת בשילוב עם טכנולוגיות שונות ויוצאת. בנוסף צפיפות-TraDISort8, אנו ממליצים כי צפיפות ההפרדה מעבר של חיידקים capsulated יכול לשמש עבור בידוד של מוטציות עם כמוסה מסולף, לטיהור של תאים capsulated תרבויות מעורבות או דוגמאות מורכבות, ועבור מהירה יצירת פרופילים לייצור קפסולה של זנים מרובים. לבסוף, ניתן להשתמש בטכנולוגיה זו לבחון אחרים פנוטיפים חיידקיים כגון צבירת.
המחברים יש אינטרסים כלכליים לא לחשוף.
אנו מודים וואנג ג'ין-טאון, סוזאנה סולטר לאספקת זנים, חברי הקבוצה Parkhill לדיונים מועיל. עבודה זו מומן על ידי המכון סנגר Wellcome (Wellcome גרנט 206194), ועל ידי מלגת פוסט-דוקטורט סר הנרי Wellcome F.L.S. (גרנט 106063/א/14/ת). M.J.D. נתמך על ידי Studentship PhD Wellcome המכון סנגר.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
Centrifuge 5810R with Rotor A-4-81 and 500 mL buckets | Eppendorf | 5810 718.007 | |
Adapters for 15 mL tubes | Eppendorf | 5810 722.004 | |
Fixed andgle rotor F-34-6-38 | Eppendorf | 5804 727.002 | |
2.6 to 7 mL tube adapter | Eppendorf | 5804 739.000 | |
Centrifuge 5424 including Rotor FA-45-24-11 | Eppendorf | 5424 000.460 | |
2 mL tubes | Eppendorf | 0030 120.094 | |
1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | |
5 mL polypropylene round bottom tube | Falcon | 352063 | |
1 mL disposable syringe Luer slip | Becton Dickinson | 300013 | |
AGANI Needle 21G Green x 1.5" | Terumo | AN 2138R1 | |
P1000 pipette and tips | |||
P200 pipette and tips |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved