Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ويصف هذا البروتوكول التقنيات المستخدمة لتحديد هياكل قناة أيون بالميكروسكوب cryo-الإلكتروني، بما في ذلك نظام باكولوفيروس لكفاءة التعبير عن الجينات في خلايا الثدييات مع الحد الأدنى من الجهد وسمية واستخراج البروتين وتنقية، والتحقق من الجودة، وإعداد شبكة العينة والفحص، فضلا عن جمع البيانات وتجهيزها.

Abstract

عابر مستقبلات القنوات المحتملة (تربكس) من فصيلة الراديكالي المتعارف عليه هي قنوات الأيونات الموجبة نونسيليكتيفي التي تلعب دوراً أساسيا في التوازن الكالسيوم، دخول خاصة تعمل على تخزين الكالسيوم، هو أمر حيوي للحفاظ على وظيفة مناسبة من الإصدار حويصلة متشابك ومسارات الإشارات داخل الخلايا. وبناء على ذلك، قد تورط القنوات TRPC في مجموعة متنوعة من الأمراض البشرية بما في ذلك اضطرابات القلب والأوعية الدموية، مثل تضخم القلب واضطرابات الأعصاب مثل مرض باركنسون، واضطرابات الجهاز العصبي مثل ترنح spinocerebellar. ولذلك، تمثل قنوات TRPC هدفا دوائية محتملة في الأمراض التي تصيب الإنسان. بيد أن آليات الجزيئية النابضة في هذه القنوات لا تزال غير واضحة. كانت صعوبة الحصول على كميات كبيرة من البروتين مستقرة ومتجانسة، وتنقية عاملاً مقيداً في هيكل تصميم الدراسات، خاصة بالنسبة للبروتينات الغشاء الثدييات مثل قنوات أيون TRPC. نقدم هنا، على بروتوكول للتعبير على نطاق واسع من الثدييات أيون قناة بروتينات الغشاء باستخدام نظام نقل جينات باكولوفيروس معدلة وتنقية هذه البروتينات بالنسب وحجم الاستبعاد اللوني. ونقدم كذلك بروتوكولا لجمع الصور مجهرية واحدة-الجسيمات cryo-إلكترون من البروتين المنقي واستخدام هذه الصور لتحديد بنية البروتين. تصميم الهيكل وسيلة قوية لفهم آليات النابضة والدالة في قنوات أيون.

Introduction

ويشارك الكالسيوم في العمليات الأكثر الخلوية بما في ذلك إشارات التحكم النسخ والإفراج العصبي، الشلالات وهرمون جزيء توليف1،،من23. الحفاظ على التماثل الساكن سيتوسوليك الكالسيوم الحرة أمر حاسم لصحة ووظيفة الخلايا. إحدى الآليات الرئيسية لاستتباب الكالسيوم داخل الخلية هو الكالسيوم تعمل بمخزن الإدخال (سوسي)، المخزنة في المشغلات هيولى (ER) على استنزاف الكالسيوم الذي فتح قنوات أيون في غشاء البلازما لتسهيل عملية تجديد ER الكالسيوم، التي يمكن استخدامها بعد ذلك في زيادة الإشارات4،،من56. وقد حددت عابر مستقبلات القنوات المحتملة (تربكس)، وقنوات الكالسيوم نفاذية تنتمي إلى فوق عائلة الراديكالي، كمشارك رئيسي في سوسي7،،من89 .

من بين سبعة أعضاء في الأسرة TRPC، TRPC3، TRPC6، و TRPC7 تشكيل فريق فرعي المناظرة، وفريدة من نوعها في القدرة على تنشيط بواسطة دهن diacylglycerol رسول الثانوي (همرشولد)، منتج التحلل من الدهون مما يشير إلى فوسفاتيديلينوسيتول 4، 5-بيسفوسفاتي (PIP2)10،11. وتعرب TRPC3 عاليا في العضلات الملساء وفي مناطق المخ والدماغ في الدماغ، حيث تقوم بأدوار أساسية في الكالسيوم مما يشير إلى أن تأثير كبيرة والخلايا،من1213. ارتبط ضعف TRPC3 لاضطرابات الجهاز العصبي المركزي، واضطرابات القلب والأوعية الدموية، وبعض أنواع السرطان مثل غدية المبيض14،،من1516. ولذلك، يبشر TRPC3 كهدف الأدوية لعلاج هذه الأمراض. وقد حدت استحداث أدوية تستهدف على وجه التحديد بناء على TRPC3 عدم فهم آلياتها التنشيط الجزيئي، بما في ذلك الدهن ملزم مواقع17،18. أبلغنا بنية الذرية القرار الأولى للقناة TRPC3 البشرية (hTRPC3) ومواقع اثنين الدهن ملزمة في حالة مغلقة، توفير معلومات هامة عن هذه الآليات19.

العامل الرئيسي لتحديد هيكل بروتين الغشاء بدقة عالية للحصول على البروتين ذات جودة عالية. ويمكن فحص المقابلة للتعبير وتنقية من الشروط اللازمة للحصول على جودة عالية البروتين مسعى تستغرق وقتاً طويلاً ومكلفا. وهنا يقدم بروتوكول تصف بالتفصيل كيف يمكننا تحديد الظروف المثلى للتعبير وتنقية hTRPC3، التي تصرفت بشكل ضعيف في الفحص الأولى لدينا. نحن نقدم العديد من النقاط الرئيسية حول كيفية استكشاف أخطاء وإصلاحها وتحسين سلوك البروتين، التي ترسي أساسا متينا للبرد-إلكترون لدينا دراسات مجهرية (cryo-م). ونحن نستخدم باكولوفيرال معدلة توليد متجه (شماعة)، التي وضعتها جو والزملاء، والذي هو الأمثل للفحص فحوصات وكفاءة توليد باكولوفيروس في خلايا الثدييات20. هذا أسلوب التعبير من المناسب أوفيريكسبريشن سريعة وفعالة من حيث التكلفة للبروتينات في غشاء خلايا الثدييات. ونحن الجمع بين استخدام هذه المتجهات مع الأسفار-الكشف عن حجم استبعاد اللوني القائم (فسك) فرز طريقة21. هذا الأسلوب يستخدم علامة البروتينات فلورية خضراء (بروتينات فلورية خضراء) تنصهر فيها بناء تهم ويحسن تصور البروتين المستهدف في عينات سولوبيليزيد الصغيرة، وكامل الخلية. هذا يسمح لفحص البروتين الاستقرار حضور مختلف المنظفات والمواد المضافة، مع الطفرات ثيرموستابيليزينج، ويسمح باستخدام عدد صغير من الخلايا من تعداء عابر الصغيرة. وبهذه الطريقة، يمكن فحص العديد من الظروف سريعاً قبل أن ينتقل إلى تنقية بروتين على نطاق واسع. في أعقاب التعبير، والفرز، وتنقية، نقدم بروتوكول للحصول على ومعالجة الصور من البرد-م لتوليد تصميم هيكلي حيثياته من البروتين. ونحن نعتقد أن النهج الموصوفة هنا سيكون بمثابة بروتوكول التعميم لدراسات هيكلية الحزب قناة المستقبلات والبروتينات الغشاء الأخرى.

Protocol

1-تحويل الخلايا المختصة DH10α لإنتاج باكميد الحمض النووي

  1. توليف في الجينات للفائدة وسوبكلون أنه في نسخة معدلة من ناقلات الوتد الذي يحتوي على علامة بكتيريا توأم، His8--الوسم، والتجارة والنقل مع موقع انقسام ثرومبين في المحطة النهائية (بفاستباسي) ن20.
  2. تحويل الخلايا المختصة بإضافة 5 نانوغرام بلازميد المحتوية على جين المرغوب في بفاستباسي إلى 50 ميكروليتر من DH10α الخلايا في 1.5 مل أنبوب واحتضان لمدة 10 دقائق على الجليد. صدمة الحرارة الخلايا ل 45 ثانية في 42 درجة مئوية. إضافة 200 ميكروليتر من مرق سوبر الأمثل مع المتوسطة قامع تقويضي (شركة نفط الجنوب) إلى الأنبوبة واحتضانها ح 4-8 في 37 درجة مئوية في شاكر مداري 225 لفة في الدقيقة.
  3. لوحة 5 ميكروليتر من الخلايا على طبق أجار باكميد رطل (50 ميكروغرام/مل كاناميسين، 7 ميكروغرام/مل الجنتاميسين، أجار التتراسيكلين و 100 ميكروغرام/مل بلوو-غال 40 ميكروغرام/مل الأيزوبروبيل β-د-1-ثيوجالاكتوبيرانوسيدي [إيبتج]، 10 ميكروغرام/مل).
  4. احتضان لوحة ل 48 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: بلو-غال مؤشر المستعمرات البقع التي لا تزال تعرب عن لاكز (ناقل الإدراج غير الناجحة)، والسماح للتحديد الأبيض المستعمرات (محولة بنجاح).
  5. حدد بعناية مستعمرة بيضاء معزولة، تجنب أي مستعمرات البيضاء التي هي على اتصال بالمستعمرات الزرقاء، وتنمو خلايا بين عشية وضحاها في 6 مل متوسطة باكميد رطل (50 ميكروغرام/مل كاناميسين، 7 ميكروغرام/مل الجنتاميسين، التتراسيكلين 10 ميكروغرام/مل) في 37 درجة مئوية في شاكر مداري 225 لفة في الدقيقة.

2-البكتيرية أعدادا لعزل باكميد الحمض النووي

  1. لعزل الحمض النووي باكميد، تدور أسفل خلايا الإشريكيّة القولونية لمدة 10 دقائق في 2880 x ز.
  2. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 200 ميليلتر الحل استثارة خلية من مينيبريب كيت (انظر الجدول للمواد) التي بيبيتينج. تأكد من أن تعليق بيليه هو تماما والمتجانس. ثم قم بنقل تعليق خلية في أنابيب 1.5 مل.
  3. إضافة 200 ميليلتر من الحل تحلل الخلية من مجموعة مينيبريب ومزيج بعكس الأنبوبة عدة مرات. احتضان لمدة تصل إلى 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) في الخلايا. إضافة 200 ميليلتر لتحييد الحل من مجموعة مينيبريب ومزيج بعكس الأنبوبة عدة مرات لوقف رد الفعل تحلل.
  4. تدور إلى أسفل لمدة 10 دقيقة في س 21,130 ز في أجهزة الطرد مركزي في أعلى الجدول. جمع 600 ميكروليتر من المادة طافية في أنبوب 2 مل. إضافة 600 حل الكحول الفينول: كلوروفورم: إيسواميل ميكروليتر (انظر الجدول للمواد)، ومزيج دقيق لاستخراج الحمض النووي من الجزء المتبقي منتجات تحلل الخلية.
    تنبيه: الفينول: كلوروفورم: إيسواميل الكحول الحل السمية بالاستنشاق، على اتصال بالجلد، وإذا ابتلع. أنها يمكن أن تسبب الحروق الكيميائية، وقد تكون مسببة للسرطان. ارتداء القفازات ومعطف مختبر زرر. ويعمل في غطاء دخان. التخلص من هذه النفايات الخطرة على النحو المناسب.
  5. تدور أنبوب لمدة 10 دقيقة في 21130 س ز في أجهزة الطرد مركزي في أعلى الجدول. مرحلتين السائل منفصلة ستكون مرئية. نقل 300 ميكروليتر المرحلة المائية العليا بعناية إلى أنبوب جديد. إضافة 600 ميكروليتر من الإيثانول 100% يغسل الحمض النووي. عكس أنبوب للمزيج بلطف.
    ملاحظة: لا دوامة، كهذا يمكن قص الحمض النووي باكميد.
  6. أنابيب باردة بوضعها في ثلاجة-20 درجة مئوية للحد الأدنى 10 تدور إلى أسفل لمدة 10 دقيقة في س 21,130 ز في أجهزة الطرد مركزي في أعلى الجدول. تجاهل المادة طافية والحفاظ على بيليه الحمض النووي.
  7. أضف 1 مل إيثانول 70% لغسل بيليه. عكس أنبوب للمزيج بلطف. تدور لمدة 10 دقيقة في س 21,130 ز في الطرد مركزي جدول أعلى. تجاهل المادة طافية وتسمح بيليه للهواء الجاف لمدة 5 دقائق تقريبا أو حتى أي سائل غير مرئية في الأنبوب وبيليه الحمض النووي يصبح شفاف.
  8. ريسوسبيند بيليه الجافة في 50 ميكروليتر معقمة وخالية من الدناز، منزوع الماء. قياس تركيز الحمض النووي.
    ملاحظة: لا تجميد الحمض النووي باكميد. تخزين في 4 درجات مئوية ليصل إلى عدة أيام.

3-تعداء الخلايا Sf9 الحشرات مع باكميد لإنتاج باكولوفيروس P1

  1. بذور 0.9 × 106 الخلايا Sf9/بئر في 2 مل الوسيلة المناسبة (انظر الجدول للمواد) في كل من لوحة زراعة الأنسجة 6-جيدا جيدا. احتضان الخلايا عند 27 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لتعزيز مرفق اللوحة.
    تنبيه: الثقافات الخلية هي الإخطار محتملة. العمل في هود الاندفاق الصفحي معتمدة استخدام تقنيات العقيم والتحقق من المبادئ التوجيهية للملابس الواقية الموصى بها والتخلص السليم من النفايات قبل إجراء التجارب المؤسسية والحكومية.
  2. بعد الإلحاق، إضافة 8 ميليلتر من تعداء كاشف (انظر الجدول للمواد) إلى 100 ميليلتر لوسائل الإعلام لكل بئر من 6 أيضا لوحة يجري transfected في أنبوب عقيم. إضافة 6 ميكروغرام من باكميد الحمض النووي إلى 100 ميليلتر من المتوسطة في أنبوب عقيم منفصلة. احتضان 5 دقيقة في حلول الرايت الجمع بين الاثنين، واحتضان لمدة 45 دقيقة في الرايت
  3. يستعاض عن المتوسط في الآبار 6 مع 2 مل متوسطة جديدة. إضافة الخليط من الخطوة السابقة لكل منهما جيدا دروبويسي (200 ميليلتر للبئر الواحد). روك بلطف لوحة لضمان خلط الحل تعداء في المتوسط.
    ملاحظة: لا عباب أو اهتزاز اللوحة لأن هذا سوف يسبب الخلايا لفصل.
  4. احتضان خلايا لمد 5 (120 ساعة) في حاضنة هوميديفيد 27 درجة مئوية. تحقق من الأسفار بروتينات فلورية خضراء قبل الحصاد للتحقق من أن الفيروس يتم إنتاجه في نسبة كبيرة من الخلايا؛ في حالة انخفاض النسبة المئوية، تمديد فترة الحضانة حسب الضرورة (انظر الشكل 1).
  5. جمع الفيروس P1 تتضمن طافية (حوالي 2 مل من كل بئر). تصفية المتوسطة التي تحتوي على الفيروسات P1 إلى أنابيب 2 مل باستخدام حقنه 3 مل والصغيرة من 0.2 ميكرون تصفية. إضافة المصل البقري الجنين العقيمة (FBS) إلى تركيز نهائي من 1%.
    ملاحظة: هذا المخزون من الفيروسات P1 يجب تخزينها في 4 درجات مئوية، وتكون محمية من الضوء.

4-عدوى خلايا الحشرات Sf9 مع باكولوفيروس P1 لإنتاج باكولوفيروس P2

  1. إعداد 200 مل (أو المجلد المطلوب) من الخلايا Sf9 بتركيز 0.8-0.9 × 106 خلايا/مل في المتوسط المناسبة (انظر الجدول للمواد) في قارورة ثقافة Erlenmeyer مسطحة قاع ذات حجم كاف.
    ملاحظة: لتعليق الثقافة، لا ينبغي أن يتجاوز حجم يستخدم 40% السعة الإجمالية لقارورة.
  2. إضافة نسبة مساحية (v/v) من مخزون فيروس P1 من 3.5 إلى ثقافة تعليق خلية Sf9. احتضانها لوقت التعبير الأمثل الفيروس (عادة 48-120 ح اعتماداً على بناء البروتين) عند 27 درجة مئوية في شاكر مداري في 115 دورة في الدقيقة.
    ملاحظة: يمكن تحديد التعبير النسبي الفيروس عن طريق عرض fluorescence بروتينات فلورية خضراء من الفيروس في عينة من الثقافة.
  3. الطرد المركزي من تعليق خلية لمدة 40 دقيقة في 11,520 س ز وجمع الفيروس P2 يتضمن طافية. تصفية المادة طافية باستخدام المتاح من 0.2 ميكرون مرشحات. إضافة FBS إلى تركيز نهائي من 0.5 في المائة.
    ملاحظة: هذا المخزون من الفيروسات P2 يجب تخزينها في 4 درجات مئوية، وتكون محمية من الضوء.
  4. الحصول على من عيار الفيروس P2 استخدام الخلايا Sf9easy أو عداد فيروس.

5-عدوى خلايا الثدييات HEK293 مع باكولوفيروس P2 للتعبير البروتين على نطاق واسع

  1. إعداد وحدة تخزين المرغوب فيه HEK293 خلية الثدييات تعليق الثقافة (مستحسن ل 4-6 لإعداد شبكات المجمدة) بتركيز x 3.5-3.86 10 خلايا/مل في الأجلين المتوسط والتعبير (انظر الجدول للمواد) تستكمل مع 1% (v/ v) العقيمة FBS في قوارير الثقافة Erlenmeyer السفلي في حيرة من حجم كاف.
    ملاحظة: لتعليق الثقافة، لا ينبغي أن يتجاوز حجم يستخدم 40% الحجم الإجمالي لقارورة.
  2. إضافة 8% (v/v) من الفيروسات P2 الحل الأسهم من الخطوة 4، 3 إلى ثقافة تعليق خلية HEK293. احتضان عند 37 درجة مئوية في شاكر مداري 135 لفة في الدقيقة.
  3. إضافة butyrate الصوديوم 10 ملم في ح 12-18 ما بعد الإصابة. احتضانها لوقت التعبير الأمثل من البروتين (عادة ح 36-72) في 30 درجة مئوية.
  4. حصاد الخلايا من سينتريفوجينج لمدة 20 دقيقة في 2,880 س ز. تغسل الخلايا التي ريسوسبيندينج في حوالي 100 مل تريس مخزنة المالحة (تبس) للتر الواحد من الخلايا تحصد. الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 20 دقيقة في 2,880 س ز وجمع بيليه الخلية.
    ملاحظة: قد يكون مؤقتاً في البروتوكول هنا. يمكن تجميد المفاجئة في النتروجين السائل الكريات الخلية وتخزينها في-80 درجة مئوية حتى تنقية.
    تنبيه: قد يسبب نيتروجين سائل بيرنز المبردة أو الإصابة. فقد يتسبب قضمه الصقيع. وقد تحل محل الأكسجين ويسبب الاختناق السريع. ارتداء القفازات العازلة الباردة ودرع الوجه.
  5. جمع المحاصيل صغيرة 1 مل في نقاط زمنية مختلفة، وجعل ح 2 في 4 درجات مئوية مع هزاز أو إثارة حضور المنظفات المختلفة و/أو إضافات. يمكن توضيح هذه العينات solubilized كامل الخلية الصغيرة تنبيذ فائق في × 235,000 ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية وتشغيل كعينة ميكروليتر 30 على عمود حجم الاستبعاد لوني (ثانية) (انظر الجدول للمواد) لتحديد أفضل وقت بالنسبة التعبير وفي أفضل ظروف سولوبيليزيشن.
    ملاحظة: في حالة hTRPC3، شمل هذا الفحص مخازن مختلفة مع قيم الأس الهيدروجيني من 4.0-9.5 وتركيزات الملح من 50-500 مم؛ التراكيب الأيونية مختلفة (مثل مجكل2 أو كلوريد الصوديوم)؛ المنظفات المختلفة مع قيم تركيز (CMC) مذيل الحرجة من 0.1-20 مم؛ تقليل المواد المضافة مثل ديثيوثريتول، tris(2-carboxyethyl) الفوسفين، وبيتا-ميركابتوثانول؛ والكالسيوم خالب حمض الإيثيلين المضافة (يدتا).

6-تنقية البروتين hTRPC3 من "بيليه خلية مجمدة"

  1. ذوبان الجليد بيليه في المخزن المؤقت الذي يحتوي على 20 مم تريس (pH 8.0)، 500 ملم كلوريد الصوديوم، 1 مم فينيلميثيلسولفونيل الفلوريد (بمسف)، 0.8 ميكرومتر aprotinin، 2 ميكروغرام/مل ليوبيبتين، بيبستاتين 2 مم أ، وحصاد ديجيتونين 1%، باستخدام 100 مل من المخزن المؤقت للتر الواحد من الخلايا. بمجرد إذابة، ضمان التجانس للحل قبل بيبيتينج أو إثارة. السماح لجعل ح 2 في 4 درجات مئوية في كوب مغمورة في الثلج بالتناوب شريط إثارة.
  2. إزالة الحطام خلية بواسطة تنبيذ فائق في × 235,000 ز ح 1 في 4 درجات مئوية. التحقق من كمية البروتين عن طريق تشغيل عينة ميكروليتر 30 على عمود ثانية (انظر الجدول للمواد) من كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ([هبلك]) وتمثيل البروتين المستهدف بإخراج إشارة التجارة والنقل.
  3. احتضان solubilized البروتين (طافية) مع الراتنج تقارب الكوبالت ح 1-2 في 4 درجات مئوية. التحقق من البروتين ملزمة إلى الراتنج بتشغيل عينة ميكروليتر 30 عمود ثانية.
    ملاحظة: إذا حدث ملزمة البروتين، سيتم الاحتفاظ هدف المعلمة البروتين بروتينات فلورية خضراء في العمود، لم يتم العثور على في التدفق عبر. ولذلك، لا توجد إشارة بروتينات فلورية خضراء سيكون حاضرا في الموضع المقابل لحجم البروتين المستهدف عند تشغيل على [هبلك] التدفق من خلال.
  4. أغسل الراتنج مع 10 العمود حجم المخزن المؤقت (20 مم تريس و pH 8.0، 500 ملم كلوريد الصوديوم، ايميدازول 15 ملم وديجيتونين 0.1%). الاختيار لفقدان البروتين عن طريق تشغيل عينة ميكروليتر 30 على عمود ثانية.
    ملاحظة: إذا حدث فقدان البروتين من العمود، سوف تبين الهدف المعلمة البروتين بروتينات فلورية خضراء في المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي التي تم تمريرها عبر العمود. ولذلك، إشارة بروتينات فلورية خضراء سيكون حاضرا في الموضع المقابل لحجم البروتين الهدف عندما يتم تشغيل المخزن المؤقت الغسيل على [هبلك]. إذا حدث فقدان البروتين، قد تحتاج تركيز ايميدازول يغسل المخزن المؤقت إلى تخفيضها لمنع تعطيل له ملزمة علامة على عمود النسب.
  5. الوت hTRPC3 الراتنج زمنياً مع المخزن المؤقت (20 مم تريس و pH 8.0، 500 ملم كلوريد الصوديوم، ايميدازول 250 ملم وديجيتونين 0.1%). إضافة ثرومبين في 01:20 نسبة المولى (تهزم العلامة التجارة والنقل) وإضافة 10 مم يدتا (عامل استقرار hTRPC3) للعينة التيد واحتضانها ح 3 في 4 درجات مئوية. تحقق من أنه قد تم التيد البروتين بتشغيل ميكروليتر 90 من 1: 100 عينة مخففة على عمود ثانية والتحقق من وجود إشارة بروتينات فلورية خضراء في الموضع المقابل لحجم البروتين الهدف.
    ملاحظة: عند هذه النقطة، إشارة التربتوفان من مجموع البروتين في شطف يمكن أيضا أن ينظر إلى. فقط البروتين المنقي تقارب الهدف سيبقى في شطف وفي التجارة والنقل، وسوف تكون إشارات التربتوفان قرب متطابقة في الشخصية. إذا كان لا ينظر في كمية كبيرة في شطف البروتين المستهدف لكن انقطع لا في التدفق من خلال أو الغسيل، البروتين ظلت يرجح أن منضمة إلى العمود ويمكن أن تكون التيد استخدام تركيز أعلى من ايميدازول في المخزن المؤقت.
  6. تركز النذرة إلى 500 ميكروليتر أو أقل من ذلك في عامل تصفية الطرد مركزي 15 مل ك 100 أنبوب (انظر الجدول للمواد) من الغزل في س 2,880 ز في 4 درجات مئوية في تزايدات 5 دقيقة. ريسوسبيند البروتين قبل بيبيتينج الحل صعودا وهبوطاً بين يدور لتجنب أوفيركونسينتراتينج.
    ملاحظة: يجوز تقصير وقت الطرد المركزي مع اقتراب الحجم وحدة التخزين النهائية المطلوبة.
  7. تحميل تركز على عمود ثانية في المخزن المؤقت (20 مم تريس و pH 8.0، 500 ملم كلوريد الصوديوم، يدتا 1 مم وديجيتونين 0.1%). قم بتشغيل.
  8. الجمع بين ذروة الكسور التي تحتوي على تيترامير TRPC3 سليمة، كتصور بإشارة امتصاص الأشعة فوق البنفسجية، والتركيز مرة أخرى إلى نهائي تركز على الأقل 5 ملغ/مل.

7-فحص البروتين بالميكروسكوب الإلكتروني السلبي-وصمة عار

  1. قم بتشغيل الجهاز توهج التفريغ. وضع البرنامج لأداء شبكة المغلفة بالكربون باستخدام الأرجون والأكسجين لتشغيل س. 30 البرنامج جعل الكربون-الطلاء على النحاس 400-شبكة شبكات ماء قبل إضافة الحل البروتين.
  2. إعداد ميكروليتر 40 خمس قطرات من الماء المعقم وقطرات اثنين 40 ميكروليتر من 1% فورمات اليورانيل (في مختبر الفيلم أو ورق الشمع أو سطح مماثلة، انظر الجدول للمواد). تأخذ الشبكة من الخطوة 7، 1 وإضافة نموذج ميكروليتر 2.5 من البروتين 5 ملغ/مل (50-200 ميكرومتر) على الجانب المظلم والسماح لها الجلوس لمدة 1 دقيقة.
  3. وبعد 1 دقيقة، الجاف للشبكة باستخدام ورق الترشيح. لا تلمس ورقة تصفية مباشرة على سطح الشبكة؛ بدلاً من ذلك، تقديم الورقة إلى حافة الحبرية السائل والسماح بعمل شعري سحب السائل من الشبكة في ورق الترشيح.
  4. تراجع الشبكة في أول قطره ماء. جاف مع ورق الترشيح وكرر مع قطرات المتبقية من المياه وهو أول انخفاض فورمات اليورانيل. السماح بانخفاض الثانية اليورانيل فورمات الجلوس لمدة 1 دقيقة والجاف ثم مع أوراق الترشيح. تسمح الشبكة بالكامل الهواء الجاف (حوالي 1 دقيقة) قبل تخزينها.
    ملاحظة: قد لا يكون هذا البروتوكول المصبوغة مثالية لجميع تركيبات المنظفات البروتين. تركيزات مختلفة من فورمات اليورانيل وصمة عار وينبغي اختبار أطوال مختلفة من الوقت للتعرض وصمة عار إذا الخطوات المذكورة أعلاه لا توفر وصمة عار مع تباين جيد.
  5. صورة الشبكات في مجهر الإلكتروني (انظر الجدول للمواد) للتحقق من جودة البروتين الجسيمات. التأكد من أن ميكروجرافس إظهار العديد من الجزيئات التي متجانسة في المظهر العام، وتوزيع وعرض تباين جيد ويتطابق مع حجم المتوقعة من البروتين الهدف.
  6. توليد الأولية، والتصنيفات (2D) منخفضة الجودة، وثنائي الأبعاد باستخدام 50-100 ميكروجرافس (انظر تجهيز البيانات – الخطوة 10) للتأكد من أن الجزيئات تمثل وجهات نظر مختلفة من هيكل متسق واحد.
    ملاحظة: ميكروجرافس وفئات 2D الأولية ذات نوعية كافية، كما هو موضح أعلاه، مؤشرا قويا على أن البروتوكول قد الأمثل بما فيه الكفاية لتنقية البروتين. إعداد وفحص الشبكات cryo-م مطلوب في هذه المرحلة.

8. إعداد نموذج م

  1. وهج-أداء شبكة الكربون المخرمة الذهب (انظر الجدول للمواد) كما هو موضح في الخطوة 7، 1.
  2. تطبيق 2.5 ميكروليتر من العينة البروتين تتركز hTRPC3 (5 ملغ/مل) على الشبكة. لطخة الشبكة من أجل 1.5 s باستخدام اسطوانة قوة 1 ووقت انتظار من 5 s بالرطوبة 100% و 4 درجات مئوية، ثم إغراق الشبكة في الإيثان سائل التبريد بالنتروجين السائل باستخدام آلة التزجيج.
    ملاحظة: استخدمت الرطوبة، ودرجة الحرارة، ووصمة عار-القوة، وقت وصمة عار ووقت الانتظار المدرجة هنا لصاحبي hTRPC3 الدراسة19. قد تحتاج إلى تغيير إلى إنتاج الجليد الزجاجي الأمثل للبروتينات والمنظفات الأخرى.
  3. الشاشة المجمدة شبكات لأحوال الجليد الأمثل باستخدام مجهر cryo-م (انظر الجدول للمواد) والجليد يدوياً عرض مناطق الجليد السميك (شبكة المربعات التي تظهر أصغر حجماً وأكثر قتامة)، رقيقة الجليد (شبكة المربعات التي تظهر أكبر حجماً وأكثر إشراقا) والمتوسطة .
    ملاحظة: غالباً ما يحمل الجليد أكثر سمكا على جزيئات أكثر، حين الجليد أرق كثيرا ما تعطي تباين أفضل والقرار. شروط استخدام الفرز اليدوي للصور لتحديد الجليد التي النتائج في عدد كبير من الجسيمات مونوديسبيرسيد مع تباين جيد والقرار. حالما يتم التحقق من ظروف جيدة، الانتقال إلى مجموعة الصور مجهر cryo-م 300 كيلو فولت.

9. جمع بيانات م

  1. باستخدام برنامج اقتناء الآلي، تسجيل رصات الصور في وضع عد دقة فائقة مع حجم بكسل إهمال 1.074 في مجهر الإلكتروني تعمل على 300 كيلو فولت مع تكبير اسمي 000 130 دولار X مباشرة كاشف إلكترون.
  2. الجرعة-يجزئ كل الصورة إلى إطارات 40 مع وقت تعرض إجمالي 8 ق، مع 0.2 ثانية لكل إطار ومعدل جرعة 6.76 e− s2 1 (القيم الاسمية يزيل التباؤر تختلف من 1.0 إلى 2.5 ميكرومتر في التجربة صاحبي).

10. تجهيز البيانات م

  1. تنفيذ حركة تصحيح قد لخص الفيلم مكدسات22 وتقدير القيم يزيل التباؤر23 باستخدام برامج معالجة البيانات (انظر الجدول للمواد)24.
  2. التقاط جزيئات من ميكروجرافس. استخدم هذه التقطت الجسيمات لبناء تصنيف 2D خالية من الإشارة أولى استخدام البرمجيات24. حدد فئة 2D المثالي المتوسطات لاستخدامها كقوالب للانتقاء الجسيمات الآلي لمجموعة البيانات بالكامل.
  3. التحقق من جودة الجسيمات اختار السيارات وإزالة جسيمات سيئة يدوياً. استخدام جولات متعددة لتصنيف 2D لتنظيف جزيئات المنتقاة.
  4. إنشاء نموذج أولى25. التقطت 2D موضوع الجسيمات للتصنيف (3D) ثلاثي الأبعاد (حوالي 5 فصول دراسية) باستخدام التناظر C1 وتعمير أولية منخفضة تمرير مرشح من 60 Å كنموذج مرجعي. تحديد الفئات التي لها ميزات عالية الدقة، والجمع بين الجسيمات داخل هذه فئة.
  5. زيادة صقل الجسيمات باستخدام صقل المحلية مع التماثل C4 (في حالة hTRPC3) المطبقة وتعيين حد ذات الدقة عالية للجسيمات المحاذاة إلى 4.526.

11-نموذج بناء

  1. بناء نموذج (انظر الجدول للمواد للبرمجيات المستخدمة). ل hTRPC3، استخدام المجال ترانسميمبراني (TMD) ميلاستاتين مستقبلات عابر المحتملة 4 (TRPM4) هيكل البروتين مصرف بيانات (PDB) 5wp6 ك دليل27. استخدام مخلفات ضخمة والتنبؤ بهيكل الثانوية لتوجيه بناء حيثياته .
  2. النموذج الأولى لصقل الفضاء الحقيقية مع الهيكل الثانوي القيود28من هذا الموضوع. دراسة نموذج المكرر و remodify حسب الحاجة (انظر الجدول للمواد للبرمجيات المستخدمة) يدوياً.
  3. تطبيق المنحنيات الارتباط (FSC) شل فورييه لحساب الفرق بين النموذج النهائي وخريطة م للتحقق هيكل المكرر. تقييم الهندسات النماذج الذرية (انظر الجدول للمواد للبرمجيات المستخدمة)29،30.

النتائج

ويبين الشكل 1Aنظرة تخطيطية للبروتوكول للتعبير وتنقية hTRPC3. صورة للوحة باكميد hTRPC3 مع مستعمرات بيضاء مثالية، مماثلة لتلك التي اختيرت لتنقية الحمض النووي باكميد، يرد في الشكل 1 باء. لقد وجدنا أن ح 48 ومثالي لتلطيخ غال بلو واضحة مع الحفاظ على وجو...

Discussion

التصميم الهيكلي للبروتينات بالبرد-م قد أحدث ثورة في مجال البيولوجيا الهيكلي في السنوات القليلة الماضية، بفضل تطوير خوارزميات والكاميرات الجديدة أن يسرع إلى حد كبير على تصميم بنية البروتينات التي لا سهولة تتبلور، لا سيما غشاء بروتينات. على الرغم من كل أوجه التقدم الأخيرة في تقنية م البرد?...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

ونشكر تشاو زاي وعاشرا منغ للدعم بجمع البيانات على ديفيد فإن اندل متقدمة Cryo-إلكترون "مجهرية جناح". ونحن نقدر أيضا فريق "فاري الحوسبة" عالية الأداء لدعم الحسابية. ونحن نقدم امتناننا كليمنتي، "مستحقات دال"، أ. ج. فلورامو، هوانغ Y. ويوسف كيم، جيم مولر، روث باء وروان Z. للتعليقات التي تحسنت كثيرا هذه المخطوطة. ونشكر "نادزيجكا د" لدعم التحرير لهذه المخطوطة. هذا العمل كان يدعمها فاري الداخلية التمويل.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
pEG BacMam vector (pFastBacI)addgene31488
DH10α cellsLife Technologies10361-012
S.O.C. mediaCorning46003CRfor transformation of DH10α cells for Bacmid
Bacmam culture platesTeknovaL5919for culture of transformed DH10α cells
Incubation shaker for bacterial cellsInfors HTMultitron standard
Incubated orbital shaker for insect cellsThermo-FisherSHKE8000
Reach-in CO2 incubator for mammalian cellsThermo-Fisher3951
Table-top orbital shakerThermo-FisherSHKE416HPused in Reach-in CO2 incubator for mammalian cells
IncubatorVWR1535for bacterial plates
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106for plasmid extraction and purification
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcoholInvitrogen15593031for DNA extraction
Sf9 cellsLife Technologies12659017insect cells for producing virus
Sf-900 mediaGibco12658-027insect cell media
FBSAtlanta BiologicalsS11550
Cellfectin IIGibco10362100for transfecting insect cells
lipofectamine 2000Invitrogen11668-027for transfecting mamalian cells
0.2 mm syringe filterVWR28145-501for filtering P1 virus
0.2 mm filter flasks 500ml resevoirCorning430758for filtering P2 virus
erlenmeyer culture flask (flat bottom 2L)Gene MateF-5909-2000for culturing insect cells
erlenmeyer culture flask (baffled 2L)Gene MateF-5909-2000Bfor culturing mammalian cells
nanodrop 2000 spectrophotometerThermo-FisherND-2000for determining DNA and protein concentrations
HEK293ATCCCRL-3022mammalian cells for producing protein
Freestyle 293 expression MediumGibco1238-018mammalian cell media for protein expression
Butyric Acid Sodium SaltAcros263195000to amplify protein expression
PMSFAcros215740500protease inhibitor
Aprotinin from bovine lungSigma-AldrichA1153-100MGprotease inhibitor
Leupeptin hydrochlorideSigma-Aldrich24125-16-4protease inhibitor
pepstatin AFisher ScientificBP2671-250protease inhibitor
digitoninEMD Millipore300410detergent - to solubilize protein from membrane
imidazoleSigma792527to elute protein from resin column
TALON resinClonetech635504for affinity purification by His-tag
superose6 incease columnsGE29091596; 29091597for HPLC and FPLC
Prominence Modular HPLC SystemShimadzuSee Below
Controller Module"CBM20A
Solvent Delivery System"LC30AD
Fluorescence Detector"RF20AXS
Autosampler with Cooling"SIL20ACHT
Pure FPLC System with FractionatorAkta
thrombin (alpha)Haematologic Technologies IncorporatedHCT-0020 Human alphafor cleaving GFP tag
Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugal filter tubeMilliporeUFC910008for concentrating protein
EDTAFisherE478500for stabilizing protein
400 mesh carbon-coated copper gridsTed Pella Inc.01754-Fgrids for negative stain
Quantifoil holey carbon grid (gold, 1.2/1.3 μm size/hole space, 300 mesh)Electron Microscopy SciencesQ3100AR1.3grids for Cryo-EM
Vitrobot Mark IIIFEIfor preparing sample grids by liquid ethane freezing
liquid nitrogenDura-CylUN1977
ethane gasAirgasUN1035
Solarus Plasma SystemGatanModel 950for cleaning grids before sample freezing
Tecnai Spirit electron microscopeFEIfor negative stain EM imaging
Talos Arctica electron microsocopeFEIfor screening and low resolution imaging of Cryo-EM grids
Titan Krios electron microscopeFEIfor high-resolution Cryo-EM imaging
Software
Gautomatch softwarehttp://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/to pick particles from micrographs
Relion 2.1 softwarehttps://github.com/3dem/relionto construct 2D and 3D classification
CryoSPARC softwarehttps://cryosparc.com/to generate an initial structure model
Frealign softwarehttp://grigoriefflab.janelia.org/frealignto refine particles
Coot softwarehttps://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/to build a model
MolProbity softwarehttp://molprobity.biochem.duke.edu/to evaluate the geometries of the atomic model
SerialEM softwarehttp://bio3d.colorado.edu/SerialEM/for automated serial image stack acquisition
MortionCor2 softwarehttp://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.htmlfor motion correction of summed movie stacks
GCTF softwarehttps://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/for measuring defocus values in movie stacks
Phenix.real_space_refine softwarehttps://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.htmlfor real space refinement of the initial 3D model

References

  1. Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
  2. Kumar, R., Thompson, J. R. The regulation of parathyroid hormone secretion and synthesis. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (2), 216-224 (2011).
  3. Sudhof, T. C. Calcium control of neurotransmitter release. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (1), a011353 (2012).
  4. Ong, H. L., de Souza, L. B., Ambudkar, I. S. Role of TRPC Channels in Store-Operated Calcium Entry. Advances in Experimental Medicine and Biology. 898, 87-109 (2016).
  5. Smyth, J. T., et al. Activation and regulation of store-operated calcium entry. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (10), 2337-2349 (2010).
  6. Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiological Reviews. 95 (4), 1383-1436 (2015).
  7. Liu, X., Singh, B. B., Ambudkar, I. S. TRPC1 is required for functional store-operated Ca2+ channels. Role of acidic amino acid residues in the S5-S6 region. Journal of Biological Chemistry. 278 (13), 11337-11343 (2003).
  8. Zhu, X., Jiang, M., Birnbaumer, L. Receptor-activated Ca2+ influx via human Trp3 stably expressed in human embryonic kidney (HEK)293 cells. Evidence for a non-capacitative Ca2+ entry. Journal of Biological Chemistry. 273 (1), 133-142 (1998).
  9. Zhu, X., et al. trp, a novel mammalian gene family essential for agonist-activated capacitative Ca2+ entry. Cell. 85 (5), 661-671 (1996).
  10. Itsuki, K., et al. Voltage-sensing phosphatase reveals temporal regulation of TRPC3/C6/C7 channels by membrane phosphoinositides. Channels (Austin). 6 (3), 206-209 (2012).
  11. Tang, J., et al. Identification of common binding sites for calmodulin and inositol 1,4,5-trisphosphate receptors on the carboxyl termini of trp channels. Journal of Biological Chemistry. 276 (24), 21303-21310 (2001).
  12. Gonzalez-Cobos, J. C., Trebak, M. TRPC channels in smooth muscle cells. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 15, 1023-1039 (2010).
  13. Li, H. S., Xu, X. Z., Montell, C. Activation of a TRPC3-dependent cation current through the neurotrophin BDNF). Neuron. 24 (1), 261-273 (1999).
  14. Becker, E. B., et al. Candidate screening of the TRPC3 gene in cerebellar ataxia. Cerebellum. 10 (2), 296-299 (2011).
  15. Kitajima, N., et al. TRPC3 positively regulates reactive oxygen species driving maladaptive cardiac remodeling. Scientific Reports. 6, 37001 (2016).
  16. Yang, S. L., Cao, Q., Zhou, K. C., Feng, Y. J., Wang, Y. Z. Transient receptor potential channel C3 contributes to the progression of human ovarian cancer. Oncogene. 28 (10), 1320-1328 (2009).
  17. Oda, K., et al. Transient receptor potential cation 3 channel regulates melanoma proliferation and migration. Journal of Physiological Sciences. 67 (4), 497-505 (2017).
  18. Xia, M., Liu, D., Yao, C. TRPC3: A New Target for Therapeutic Strategies in Chronic Pain-DAG-mediated Activation of Non-selective Cation Currents and Chronic Pain (Mol Pain 2014;10:43). Journal of Neurogastroenterology and Motility. 21 (3), 445-447 (2015).
  19. Fan, C., Choi, W., Sun, W., Du, J., Lu, W. Structure of the human lipid-gated cation channel TRPC3. Elife. 7, e36852 (2018).
  20. Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
  21. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay to identify membrane protein expression and crystallization conditions. Structure (London, England: 1993). 20 (8), 1293-1299 (2012).
  22. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  23. Zhang, K. Gctf: Real-time CTF determination and correction. Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).
  24. Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  25. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  26. Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
  27. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  28. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
  29. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).
  30. Scheres, S. H. W., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature Methods. 9 (9), 853-854 (2012).
  31. Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  32. Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
  33. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 12-21 (2010).
  34. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).
  35. Green, E. M., Au, Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. Journal of Visualized Experiments. (117), e54792 (2016).
  36. Mesa, P., Deniaud, A., Montoya, G., Schaffitzel, C. Directly from the source: endogenous preparations of molecular machines. Current Opinion in Structural Biology. 23 (3), 319-325 (2013).
  37. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane Protein Assembly into Nanodiscs. FEBS letters. 584 (9), 1721-1727 (2010).
  38. Winkler, P. A., Huang, Y., Sun, W., Du, J., Lü, W. Electron cryo-microscopy structure of a human TRPM4 channel. Nature. 552, 200-204 (2017).
  39. Autzen, H. E., et al. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science. 359 (6372), 228-232 (2017).
  40. Guo, J., et al. Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4. Nature. 552 (7684), 205-209 (2017).
  41. Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1860 (2), 378-383 (2018).
  42. Gulati, S., et al. Detergent-free purification of ABC (ATP-binding-cassette) transporters. Biochemical Journal. 461 (2), 269-278 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved