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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo descrive le tecniche utilizzate per determinare le strutture di canale ionico di cRIO-microscopia elettronica, compreso un sistema di baculovirus usato per esprimere in modo efficiente geni in cellule di mammiferi con minimo sforzo e tossicità, estrazione della proteina, purificazione, e controllo di qualità, preparazione del campione griglia e screening, nonché raccolta dati ed elaborazione.

Abstract

Canali di potenziale transitorio del ricevitore (TRPC) della sottofamiglia TRP canonica sono canali cationici non selettivi che svolgono un ruolo essenziale nell'omeostasi del calcio, voce negozio-funzionata specialmente del calcio, che è fondamentale per mantenere il corretto funzionamento del rilascio delle vescicole sinaptiche e vie di segnalazione intracellulare. Di conseguenza, canali TRPC sono stati implicati in una varietà di malattie umane, inclusi i disturbi cardiovascolari quali l'ipertrofia cardiaca, malattie neurodegenerative come il morbo di Parkinson e disturbi neurologici come atassia spinocerebellar. Canali TRPC rappresentano quindi un potenziale bersaglio farmacologico in malattie umane. Tuttavia, i meccanismi molecolari del gating in questi canali sono ancora poco chiari. La difficoltà nell'ottenere grandi quantità di proteina purificata, omogenea e stabile è stata un fattore limitante negli studi di determinazione di struttura, particolarmente per le proteine di membrana dei mammiferi quali i canali ionici TRPC. Qui, presentiamo un protocollo per l'espressione su larga scala di proteine di membrana del canale dello ione dei mammiferi utilizzando un sistema di trasferimento del gene di baculovirus modificate e la purificazione di queste proteine di affinità e la cromatografia di esclusione dimensionale. Presentiamo inoltre un protocollo per raccogliere immagini di microscopia di singola particella cryo-elettrone dalla proteina purificata e utilizzare queste immagini per determinare la struttura della proteina. Determinazione della struttura è un metodo potente per la comprensione dei meccanismi di gating e funzione di canali ionici.

Introduzione

Calcio è coinvolto nei processi più cellulari tra cui segnalazione cascades, controllo trascrizione, rilascio di neurotrasmettitori e ormoni molecola sintesi1,2,3. Il mantenimento omeostatico di calcio libero citosolico è cruciale per la salute e la funzione delle cellule. Uno dei principali meccanismi dell'omeostasi intracellulare del calcio è calcio store-operati voce (SOCE), un processo in cui lo svuotamento di calcio memorizzati nei trigger del reticolo endoplasmatico (ER) l'apertura dei canali ionici sulla membrana plasmatica per facilitare la rifornimento di calcio di ER, che può quindi essere utilizzato in ulteriore segnalazione4,5,6. Canali di potenziale transitorio del ricevitore (TRPC), che sono canali calcio-permeabile della superfamiglia di TRP, sono stati identificati come un partecipante importante SOCE7,8,9 .

Tra i sette membri della famiglia di TRPC, TRPC3, TRPC6 e TRPC7 formano un sottogruppo di omologo, e sono unici nella capacità di essere attivato dal lipido messaggero secondario diacilglicerolo (DAG), un prodotto di degradazione del lipido di segnalazione fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato (PIP2)10,11. TRPC3 è altamente espressa nel muscolo liscio e nelle regioni cerebrali e cerebellari del cervello, in cui svolge ruoli essenziali nella segnalazione del calcio che hanno un impatto neurotrasmissione e neurogenesi12,13. Disfunzione di TRPC3 è stata collegata a disturbi del sistema nervoso centrale, disturbi cardiovascolari e alcuni tipi di cancro come adenocarcinoma ovarico14,15,16. Pertanto, TRPC3 tiene la promessa come una destinazione farmaceutica per il trattamento di queste malattie. Lo sviluppo di farmaci specificamente mirati che agiscono sul TRPC3 è stato limitato da una mancanza di comprensione dei suoi meccanismi molecolari di attivazione, tra cui lipidica associazione siti17,18. Abbiamo segnalato la prima struttura di atomico-risoluzione del canale umano di TRPC3 (hTRPC3) e suoi siti di legame di lipido due in uno stato chiuso, fornendo importanti intuizioni questi meccanismi19.

Il fattore chiave per determinare la struttura di una proteina di membrana ad alta risoluzione è quello di ottenere proteine di alta qualità. La proiezione corrispondente espressione e purificazione condizioni necessarie per ottenere proteine di alta qualità può essere uno sforzo lungo e oneroso. Qui presentiamo un protocollo che descrive in dettaglio come identificare le condizioni ottimali per l'espressione e purificazione di hTRPC3, che si è comportato male in nostro screening iniziale. Vi presentiamo alcuni punti chiave su come risolvere i problemi e ottimizzare il comportamento della proteina, che pongono una solida base per il nostro cryo-elettrone studi di microscopia (cryo-EM). Usiamo un baculovirus modificate generando vettoriale (pEG), sviluppato da Gouaux e colleghi, che è ottimizzato per lo screening di analisi e generazione efficiente di baculovirus in cellule di mammifero20. Questo metodo di espressione è appropriato per rapido ed economico iperespressione delle proteine nella membrana delle cellule dei mammiferi. Uniamo l'utilizzo di questo vettore con una rilevazione della fluorescenza esclusione basata su cromatografia (FSEC) prescreening metodo21. Questo metodo utilizza un tag di proteina fluorescente verde (GFP) fuso al costrutto di interesse e migliora la visualizzazione della proteina dell'obiettivo in piccole, cellule intere campioni solubilizzati. Questo permette per lo screening della stabilità proteica in presenza di diversi detergenti e additivi, con mutazioni di thermostabilizing e permette l'uso di un piccolo numero di cellule dalla trasfezione transiente in piccola scala. In questo modo, una moltitudine di condizioni può essere rapidamente proiettata prima di passare ad una purificazione di proteine su larga scala. A seguito di espressione, lo screening e la purificazione, presentiamo un protocollo per ottenere ed elaborare immagini da cryo-EM per generare una de novo determinazione strutturale della proteina. Noi crediamo che gli approcci descritti qui servirà come un protocollo generalizzabile per studi strutturali di recettori canale TRP e altre proteine di membrana.

Protocollo

1. trasformazione delle cellule competenti di DH10α per produrre Bacmid DNA

  1. Sintetizzare il gene di interesse e subclone esso in una versione modificata del vettore pEG contenente un doppia strep-tag, un His8-tag e GFP con un sito di clivaggio della trombina al capolinea (pFastBacI) N20.
  2. Trasformare cellule competenti con l'aggiunta di 5 ng di plasmide contenente un gene desiderato in pFastBacI a 50 μL di DH10α cellule in un 1,5 mL tubo e incubare per 10 minuti in ghiaccio. Le cellule per 45 di scossa di calore s a 42 ° C. Aggiungere 200 μL di brodo super ottima con il mezzo di repressore catabolico (SOC) al tubo e incubare per 4-8 h a 37 ° C in un agitatore orbitale a 225 giri/min.
  3. Piastra 5 μL di cellule su una piastra di agar bacmid LB (kanamicina di 50 μg/mL, 7 μg/mL Gentamicina, agar tetraciclina, 100 μg/mL Bluo-gal e 40 μg/mL isopropilico β-D-1-thiogalactopyranoside [IPTG], 10 μg/mL).
  4. Incubare la piastra per 48 h a 37 ° C.
    Nota: Le colonie di macchie di indicatore Bluo-gal che ancora stanno esprimendo lacZ (vettore inserimento infruttuoso), permettendo per la selezione delle colonie (con successo trasformati) bianchi.
  5. Selezionare con attenzione una colonia bianca isolata, evitando qualsiasi bianchi colonie che sono in contatto con colonie blu e far crescere cellule pernottamento in 6 mL di terreno di bacmid LB (kanamicina di 50 μg/mL, 7 μg/mL Gentamicina, tetracicline 10 μg/mL) a 37 ° C in un agitatore orbitale a 225 giri/min.

2. batterica preparazione per isolamento di DNA Bacmid

  1. Per isolare il DNA bacmid, rotazione verso il basso le cellule di Escherichia coli per 10 min a 2880 x g.
  2. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 200 µ l di soluzione di risospensione delle cellule dal miniprep kit (Vedi Tabella materiali) di pipettaggio. Assicurarsi che il pellet è completamente e omogeneamente sospesa. Poi, trasferire la sospensione cellulare in provette da 1,5 mL.
  3. Aggiungere 200 µ l della soluzione di lisi cellulare dal kit miniprep e mescolare capovolgendo la provetta un paio di volte. Incubare per fino a 5 min a temperatura ambiente (TA) per lisare le cellule. Aggiungere 200 µ l di soluzione di neutralizzazione dal kit miniprep e mescolare capovolgendo la provetta un paio di volte per interrompere la reazione di lisi.
  4. Rotazione verso il basso per 10 min a 21.130 x g in una centrifuga di tavolo. Raccogliere 600 μL del surnatante in una provetta da 2 mL. Aggiungere 600 μL di soluzione di alcol fenolo: cloroformio: isoamilico (Vedi Tabella materiali) e miscelare accuratamente per estrarre il DNA dal resto dei prodotti di lisi delle cellule.
    Attenzione: Fenolo: cloroformio: isoamilico soluzione di alcool è tossico per inalazione, a contatto con la pelle e per ingestione. Può causare ustioni chimiche e può essere cancerogeno. Indossare guanti e un camice da laboratorio polsini. Lavorare in una cappa aspirante. Smaltire in modo appropriato questo rifiuti pericolosi.
  5. Girare il tubo per 10 min a 21130 x g in una centrifuga di tavolo. Due fasi liquide separate saranno visibili. Trasferire con cautela 300 μL della fase acquosa superiore ad un nuovo tubo. Aggiungere 600 µ l di etanolo al 100% per lavare il DNA. Capovolgere delicatamente la provetta per mescolare.
    Nota: Non non vortice, come questo potete inclinare bacmid DNA.
  6. Tubi cool mettendoli in un congelatore a-20 ° C per 10 min. rotazione verso il basso per 10 min a 21.130 x g in una centrifuga di tavolo. Scartare il surnatante e preservare il pellet di DNA.
  7. Aggiungere 1 mL di etanolo al 70% per lavare la pallina. Capovolgere delicatamente la provetta per mescolare. Centrifugare per 10 min a 21.130 x g in una centrifuga di piano d'appoggio. Scartare il surnatante e lasciar il pellet aria secca per circa 5 minuti o fino a quando il liquido non è visibile nel tubo e il pellet di DNA diventa traslucido.
  8. Risospendere il pellet asciutto in 50 µ l di sterile, privo di DNasi, acqua deionizzata. Misurare la concentrazione di DNA.
    Nota: Non congelare bacmid DNA. Conservare a 4 ° C per diversi giorni.

3. transfezione delle cellule di insetto Sf9 con Bacmid per produrre P1 Baculovirus

  1. Seme: 0,9 x 106 Sf9 cellule/pozzetto in 2 mL di terreno appropriato (Vedi Tabella materiali) in ciascun pozzetto di una piastra di coltura del tessuto 6 pozzetti. Incubare le cellule a 27 ° C per 20 min a promuovere attaccamento alla piastra.
    Attenzione: Colture cellulari sono un potenziale rischio biologico. Lavorare in una cappa a flusso laminare approvato utilizzando tecniche asettiche e controllare le linee guida istituzionali e governative per indumenti di protezione consigliati e corretto smaltimento dei rifiuti prima di eseguire gli esperimenti.
  2. Dopo aver allegato, aggiungere 8 µ l di reagente di transfezione (Vedi Tabella materiali) a 100 µ l di media per ciascun pozzetto delle 6 piastra ben essere trasfettato in una provetta sterile. Aggiungere 100 µ l di terreno in una provetta sterile separata 6 μg di bacmid del DNA. Incubare per 5 minuti a RT. combinare le due soluzioni e incubare per 45 minuti a TA.
  3. Sostituire il mezzo a 6 pozzetti con 2 mL di terreno nuovo. Aggiungere la miscela dal passaggio precedente a ogni bene goccia a goccia (200 µ l per pozzetto). Scuotere delicatamente la piastra per garantire la miscelazione della soluzione transfezione nel mezzo.
    Nota: Non agitare o agitare la piastra perché questo farà sì che le cellule staccare.
  4. Incubare le cellule per 5 d (120 h) in un incubatore di 27 ° C. Controllare la fluorescenza di GFP prima della raccolta per verificare che il virus viene prodotta in una grande percentuale delle cellule; Se la percentuale è bassa, estendere il tempo di incubazione come necessario (vedere Figura 1).
  5. Raccogliere il surnatante contenente virus P1 (circa 2 mL da ogni pozzetto). Il supporto contenente virus P1 nelle provette 2 mL utilizzando una siringa da 3 mL e 0,2 µm piccolo filtro del filtro. Aggiungere sterile siero bovino fetale (FBS) ad una concentrazione finale dell'1%.
    Nota: Questo stock di virus P1 deve essere conservato a 4 ° C e protetto dalla luce.

4. infezione di cellule di insetto Sf9 con Baculovirus P1 per produrre P2 Baculovirus

  1. Preparare 200 mL (o volume desiderato) di Sf9 cellule ad una concentrazione di 0,8 - 0,9 x 106 cellule/mL su mezzo adeguato (Vedi Tabella materiali) in una beuta di cultura fondo piatto di dimensioni sufficienti.
    Nota: Per la coltura di sospensione, il volume utilizzato non deve superare il 40% della capacità totale del pallone.
  2. Aggiungere il rapporto di 1: 2500 (v/v) di stock di virus P1 da 3.5 alla coltura di sospensione delle cellule Sf9. Incubare per la volta di espressione ottimale virus (solitamente 48-120 h a seconda del costrutto di proteine) a 27 ° C in un agitatore orbitale a 115 giri/min.
    Nota: L'espressione relativa virus può essere determinato visualizzando la fluorescenza di GFP del virus in un campione della cultura.
  3. Centrifugare la sospensione cellulare per 40 min a 11.520 x g e raccogliere il surnatante contenente virus P2. Filtrare il surnatante utilizzando monouso 0,2 µm filtri. Aggiungere FBS a una concentrazione finale di 0,5%.
    Nota: Questo stock di virus P2 deve essere conservato a 4 ° C e protetto dalla luce.
  4. Ottenere un titolo per il virus di P2 utilizzando un contatore di virus o cellule Sf9easy.

5. infezione di cellule di mammifero HEK293 con Baculovirus P2 per l'espressione della proteina su larga scala

  1. Preparare un volume desiderabile di HEK293 coltura di sospensione su cellule di mammifero (4-6 L è consigliato per la preparazione di griglie congelati) ad una concentrazione di 3.5-3.8 x 106 cellule/mL nel mezzo di espressione (Vedi Tabella materiali) completati con 1% (v / v) sterile FBS in matracci di cultura di Erlenmeyer sconcertato-fondo di dimensioni sufficienti.
    Nota: Per la coltura di sospensione, il volume utilizzato non deve superare il 40% del volume totale del pallone.
  2. Aggiungere 8% (v/v) di soluzione di riserva di virus P2 dal passaggio 4.3 alla coltura di sospensione delle cellule HEK293. Incubare a 37 ° C in un agitatore orbitale a 135 giri/min.
  3. Aggiungere del butirrato del sodio 10 mM post-all'infezione 12-18 h. Incubare per la volta dell'espressione proteica ottimale (di solito 36-72 h) a 30 ° C.
  4. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione per 20 min a 2.880 x g. Lavare le cellule di risospensione in circa 100 mL soluzione fisiologica tamponata (TBS) per litro di cellule raccolte. Centrifugare nuovamente per 20 min a 2.880 x g e raccogliere il pellet cellulare.
    Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Palline delle cellule possono essere snap-congelati in azoto liquido e conservati a-80 ° C fino alla purificazione.
    Attenzione: Azoto liquido può causare lesioni o ustioni criogeniche. Può causare congelamento. Si può spostare l'ossigeno e causare il soffocamento rapida. Indossare guanti isolanti freddi e visiera.
  5. Raccogliere raccolti 1ml piccoli intervalli di tempo variabili e solubilizzare per 2 h a 4 ° C con dondolo o mescolando in presenza di diversi detergenti e/o additivi. Questi piccoli campioni di cellule intere solubilizzati possono essere chiariti dall'ultracentrifugazione a 235.000 × g per 10 min a 4 ° C ed eseguire come un campione di 30 μL su una colonna di cromatografia di esclusione dimensionale (SEC) (Vedi Tabella materiali) per determinare il momento migliore per espressione e le migliori condizioni di solubilizzazione.
    Nota: Nel caso di hTRPC3, questo screening incluso diversi buffer con valori di pH da 4.0-9.5 e concentrazioni saline del 50-500 mM; diverse composizioni ionici (ad esempio MgCl2 o NaCl); diversi detergenti con micellare critica (CMC) valori di concentrazione 0,1 - 20 mM; ridurre gli additivi come dithiothreitol, tris(2-carboxyethyl) fosfina e β-mercaptoetanolo; e il calcio-chelante acido etilendiamminotetracetico additivo (ed).

6. la purificazione della proteina di hTRPC3 dal Pellet congelati

  1. Scongelare il pellet in tampone contenente 20 mM Tris (pH 8.0), 500 mM NaCl, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF), 0,8 μM aprotinina, 2 μg/mL leupeptina, 2 mM pepstatina A, e 1% digitonina, utilizzando 100 mL di tampone per litro di cellule raccolte. Una volta scongelato, assicurare l'omogeneità della soluzione pipettando o agitazione. Permettono di solubilizzare per 2 h a 4 ° C in un becher immerso nel ghiaccio con un stir bar rotante.
  2. Rimuovere i detriti cellulari dall'ultracentrifugazione a 235.000 × g per 1 h a 4 ° C. Verificare la quantità di proteina mediante l'esecuzione di un campione di 30 μL su una colonna di SEC (Vedi Tabella materiali) mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e visualizzare la proteina dell'obiettivo con l'uscita del segnale GFP.
  3. Incubare le proteine solubilizzate (surnatante) con resina di affinità di cobalto per 1-2 ore a 4 ° C. Verificare il legame alle proteine alla resina eseguendo un 30 μL di campione in una colonna di SEC.
    Nota: Se si è verificato un legame con le proteine, la destinazione di tagged proteina GFP viene trattenuta sulla colonna, non trovata il flusso continuo. Di conseguenza, nessun segnale GFP sarà presente nella posizione corrispondente alla dimensione di proteina bersaglio quando il flusso continuo viene eseguito su HPLC.
  4. Lavare la resina con 10 volumi di colonna del buffer (20 mM Tris, pH 8.0, 500 mM NaCl, imidazolo di 15 mM e 0,1% digitonina). Controllare per perdita della proteina eseguendo un 30 μL di campione in una colonna di SEC.
    Nota: Se si è verificato la perdita di proteine dalla colonna, il bersaglio con tag proteina GFP si troverà nel tampone di lavaggio che è passato sopra la colonna. Di conseguenza, GFP segnale sarà presente nella posizione corrispondente alla dimensione di proteina bersaglio quando il tampone di lavaggio viene eseguito su HPLC. Se si è verificato la perdita di proteine, la concentrazione di imidazolo del tampone di lavaggio potrebbe essere necessario essere abbassata per evitare di interrompere la sua associazione di tag per la colonna di affinità.
  5. Eluire il hTRPC3 associato a resina con buffer (20 mM Tris, pH 8.0, 500 mM NaCl, imidazolo di 250 mM e 0,1% digitonina). Aggiungere trombina a un 01:20 rapporto molare (a fendere il tag GFP) e aggiungere 10 mM EDTA (un agente di stabilizzazione hTRPC3) nell'esempio eluito e incubare per 3 ore a 4 ° C. Verifica che la proteina ha stata eluita eseguendo 90 μL di un campione diluito 1: 100 su una colonna di SEC e verificando la presenza di un segnale GFP nella posizione corrispondente alla dimensione della proteina bersaglio.
    Nota: A questo punto, il segnale di triptofano dal tenore totale di proteine l'eluizione possa anche essere visualizzato. Solo la proteina bersaglio purificato per affinità rimarrà nell'eluizione e la GFP e triptofano segnali saranno vicino a identici nel profilo. Se la proteina dell'obiettivo non è visto in gran quantità nell'eluizione ma non è stato perso in flusso continuo o lavare, la proteina probabilmente è rimasto legata alla colonna e può essere eluita utilizzando una maggiore concentrazione di imidazolo nel buffer.
  6. Concentrare l'eluato a 500 μL o meno in un filtro centrifugo 15ml 100K tube (Vedi Tabella materiali) di filatura a 2.880 x g a 4 ° C in incrementi di 5 min. Risospendere la proteina pipettando su e giù la soluzione tra giri per evitare overconcentrating.
    Nota: Il tempo di centrifugazione può essere abbreviato come il volume si avvicina il volume finale desiderato.
  7. Caricare il concentrato su una colonna SEC nel buffer (20 mM Tris, pH 8.0, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA e della digitonina 0.1%). Correre.
  8. Combinare le frazioni di picco contenente il tetramero TRPC3 intatto, come visualizzati da segnale di assorbanza UV e concentrare nuovamente a una concentrazione finale di almeno 5 mg/mL.

7. screening della proteina da microscopia elettronica negativo-macchia

  1. Accendere la macchina effluvio. Impostare il programma per lo scarico di una griglia rivestita di carbonio utilizzando argon e ossigeno per 30 s. Esegui il programma per rendere il rivestimento di carbonio su rame 400-maglia griglie idrofila prima dell'aggiunta della soluzione della proteina.
  2. Impostare gocce cinque 40 μL di acqua sterile e gocce di due 40 μL di soluzione di formiato di uranile 1% (il film lab, carta oleata o una superficie simile, Vedi Tabella materiali). Prendere la griglia dal punto 7.1 e aggiungere 2,5 µ l di proteina campione 5 mg/mL (50-200 μM) sul lato oscuro e lasciate riposare per 1 min.
  3. Dopo 1 min, asciugare la griglia utilizzando carta da filtro. Non toccare la carta da filtro direttamente alla superficie della griglia; invece, portare la carta al bordo della goccia di liquido e azione capillare per estrarre il liquido dalla griglia in carta da filtro.
  4. Immergere la griglia nella prima goccia d'acqua. Asciugare con carta da filtro e ripetere l'operazione con le restanti gocce d'acqua e la prima goccia di formiato di uranile. Consentire la seconda goccia di uranile formiato sit per 1 min e poi asciugare con carta da filtro. Consentire la griglia completamente aria secca (circa 1 min) prima di riporlo.
    Nota: Questo protocollo di colorazione può non essere ideale per tutte le combinazioni di proteine-detergente. Differenti concentrazioni di formiato di uranile macchia e varie lunghezze di tempo per l'esposizione di macchia dovrebbero essere testate se i passaggi precedenti non forniscono una macchia con un buon contrasto.
  5. Le griglie su un microscopio elettronico di immagine (Vedi Tabella materiali) per controllare la qualità delle particelle della proteina. Garantire che le micrografie mostrano numerose particelle che sono omogenee nella distribuzione e nell'aspetto generale, buon contrasto del display e corrisponde alla dimensione prevista della proteina bersaglio.
  6. Preliminare di generare, a bassa risoluzione, bidimensionale (2D) classificazioni utilizzando micrografie di 50-100 (Vedi elaborazione dati – passaggio 10) per verificare che le particelle rappresentano diversi punti di vista di un'unica struttura coerenza.
    Nota: Micrografie e preliminare classi 2D di qualità sufficiente, come descritto in precedenza, sono un forte indicatore che il protocollo è stato sufficientemente ottimizzato per purificazione della proteina. Preparazione e screening di griglie di cryo-EM è autorizzata a questo punto.

8. preparazione del campione EM

  1. Bagliore-scarico una griglia di carbonio holey oro (Vedi Tabella materiali) come descritto al punto 7.1.
  2. Applicare 2.5 μL del campione concentrato hTRPC3 proteina (5 mg/mL) sulla griglia. Macchia della griglia per 1,5 s utilizzando una macchia della forza di 1 e un tempo di attesa di 5 s a 4 ° C e 100% umidità quindi immergersi nella griglia etano liquido raffreddato con azoto liquido, utilizzando una macchina di vetrificazione.
    Nota: L'umidità, temperatura, macchia-forza, macchia tempo e tempo di attesa elencati qui sono stati utilizzati per hTRPC3 Studio19 degli autori. Si potrebbe essere necessario essere modificato per produrre ghiaccio vitreo ottima per altre proteine e detergenti.
  3. Schermo congelato griglie per condizioni ottimali di ghiaccio utilizzando un microscopio di cryo-EM (Vedi Tabella materiali) e manualmente Vedi regioni di ghiaccio spessa (quadrati della griglia che appaiono più piccole e più scure), sottile di ghiaccio (quadrati della griglia che appaiono più grandi e più brillanti) e mezzo di ghiaccio .
    Nota: Più spesso ghiaccio contiene spesso più particelle, mentre ghiaccio sottile produce spesso ad alta risoluzione e contrasto migliore. La selezione manuale uso di immagini per determinare quale ghiaccio condizioni risultati in un gran numero di particelle di monodispersed con buon contrasto e risoluzione. Una volta verificate le condizioni buone, spostare alla collezione di immagini su un microscopio di cryo-EM 300 kV.

9. raccolta dei dati EM

  1. Utilizzando un programma di acquisizione automatizzata, registrare la serie di immagini in modalità Super-risoluzione di conteggio con una dimensione di pixel binned di 1.074 Å su un microscopio elettronico operati a 300 kV con un ingrandimento nominale di 130.000 X diretto rivelatore di elettroni.
  2. Dose-frazionare ogni immagine a 40 fotogrammi con un tempo di esposizione totale di 8 s, con 0,2 s per telaio e un tasso di dose di 6,76 e− Å s− 2 − 1 (valori di defocus nominale variano da 1,0 a 2,5 μm in esperimento degli autori).

10. EM informatica

  1. Implementare il movimento correzione del riassunto film pile22 e stimare valori defocus23 utilizzando il software di elaborazione dati (Vedi Tabella materiali)24.
  2. Raccogliere particelle dai micrografi. Utilizzare queste raccolte particelle per costruire una classificazione iniziale privo di riferimento 2D utilizzando il software di24. Medie di selezionare classe 2D ideale da utilizzare come modelli per il prelievo delle particelle automatizzati per l'intero set di dati.
  3. Controllare la qualità delle particelle raccolte a auto e rimuovere le particelle di cattive manualmente. Utilizzare vari cicli di classificazione 2D per ripulire le particelle raccolte.
  4. Generare un modello iniziale di25. 2D di soggetto scelto particelle tridimensionali (3D) classificazione (circa 5 classi) utilizzando C1 simmetria e un filtro passa-basso di ricostruzione iniziale di 60 Å come modello di riferimento a. Determinare quali classi hanno caratteristiche ad alta risoluzione e combinano le particelle all'interno di tale classe.
  5. Raffinare ulteriormente particelle usando la raffinatezza locale con simmetria C4 (nel caso di hTRPC3) applicato e impostato un limite ad alta risoluzione per l'allineamento delle particelle a 4.5 Å26.

11. modello di costruzione

  1. Costruire un modello (Vedi Tabella materiali per il software utilizzato). Per hTRPC3, utilizzare il dominio transmembrana (TMD) della melastatin potenziale transitorio del ricevitore 4 (TRPM4) struttura protein data bank (PDB) 5wp6 come una guida27. Utilizzare ingombranti residui e previsione della struttura secondaria per guidare la costruzione de novo .
  2. Soggetto il modello iniziale alla raffinatezza di spazio reale con struttura secondaria restrizioni28. Esaminare il modello raffinato e remodify come necessario (vedere Tabella materiali per il software utilizzato) manualmente.
  3. Applicare Fourier coperture curve di correlazione (FSC) per calcolare la differenza tra il modello finale e la mappa di EM per la convalida della struttura raffinata. Valutare le geometrie dei modelli atomici (Vedi Tabella materiali per il software utilizzato)29,30.

Risultati

Una descrizione schematica del protocollo per l'espressione e purificazione di hTRPC3 è mostrati in Figura 1A. Un'immagine della hTRPC3 bacmid piastra con colonie bianchi ideale, simile a quella selezionata per purificazione del DNA di bacmid, è mostrata in Figura 1B. Abbiamo trovato che 48 ore è ideale per la colorazione chiara Bluo-gal mantenendo la presenza di colonie isolate. Picco della produzione di virus P2 per hTRPC3, ...

Discussione

Determinazione strutturale delle proteine da cryo-EM ha rivoluzionato il campo della biologia strutturale negli ultimi anni, grazie allo sviluppo delle nuove telecamere e algoritmi che velocizza notevolmente la determinazione della struttura delle proteine che non prontamente cristallizzarsi, in particolare proteine di membrana. Nonostante tutti i recenti progressi nella tecnica di cryo-EM, la preparazione delle proteine purificate in qualità e quantità sufficiente per facilitare ad alta-qualità delle immagini spesso ...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Si ringraziano G. Zhao e X. Meng per il supporto con raccolta di dati presso il David Van Andel Advanced Cryo-Electron microscopia Suite. Apprezziamo il team VARI High-Performance Computing per supporto computazionale. Noi diamo la nostra gratitudine a N. Clemente, D. debiti, J. Floramo, Y. Huang, Y. Kim, C. Mueller, B. Roth e Ruan z per i commenti che ha notevolmente migliorato questo manoscritto. Si ringrazia D. Nadziejka per supporto editoriale per questo manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da interno VARI finanziamenti.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
pEG BacMam vector (pFastBacI)addgene31488
DH10α cellsLife Technologies10361-012
S.O.C. mediaCorning46003CRfor transformation of DH10α cells for Bacmid
Bacmam culture platesTeknovaL5919for culture of transformed DH10α cells
Incubation shaker for bacterial cellsInfors HTMultitron standard
Incubated orbital shaker for insect cellsThermo-FisherSHKE8000
Reach-in CO2 incubator for mammalian cellsThermo-Fisher3951
Table-top orbital shakerThermo-FisherSHKE416HPused in Reach-in CO2 incubator for mammalian cells
IncubatorVWR1535for bacterial plates
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106for plasmid extraction and purification
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcoholInvitrogen15593031for DNA extraction
Sf9 cellsLife Technologies12659017insect cells for producing virus
Sf-900 mediaGibco12658-027insect cell media
FBSAtlanta BiologicalsS11550
Cellfectin IIGibco10362100for transfecting insect cells
lipofectamine 2000Invitrogen11668-027for transfecting mamalian cells
0.2 mm syringe filterVWR28145-501for filtering P1 virus
0.2 mm filter flasks 500ml resevoirCorning430758for filtering P2 virus
erlenmeyer culture flask (flat bottom 2L)Gene MateF-5909-2000for culturing insect cells
erlenmeyer culture flask (baffled 2L)Gene MateF-5909-2000Bfor culturing mammalian cells
nanodrop 2000 spectrophotometerThermo-FisherND-2000for determining DNA and protein concentrations
HEK293ATCCCRL-3022mammalian cells for producing protein
Freestyle 293 expression MediumGibco1238-018mammalian cell media for protein expression
Butyric Acid Sodium SaltAcros263195000to amplify protein expression
PMSFAcros215740500protease inhibitor
Aprotinin from bovine lungSigma-AldrichA1153-100MGprotease inhibitor
Leupeptin hydrochlorideSigma-Aldrich24125-16-4protease inhibitor
pepstatin AFisher ScientificBP2671-250protease inhibitor
digitoninEMD Millipore300410detergent - to solubilize protein from membrane
imidazoleSigma792527to elute protein from resin column
TALON resinClonetech635504for affinity purification by His-tag
superose6 incease columnsGE29091596; 29091597for HPLC and FPLC
Prominence Modular HPLC SystemShimadzuSee Below
Controller Module"CBM20A
Solvent Delivery System"LC30AD
Fluorescence Detector"RF20AXS
Autosampler with Cooling"SIL20ACHT
Pure FPLC System with FractionatorAkta
thrombin (alpha)Haematologic Technologies IncorporatedHCT-0020 Human alphafor cleaving GFP tag
Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugal filter tubeMilliporeUFC910008for concentrating protein
EDTAFisherE478500for stabilizing protein
400 mesh carbon-coated copper gridsTed Pella Inc.01754-Fgrids for negative stain
Quantifoil holey carbon grid (gold, 1.2/1.3 μm size/hole space, 300 mesh)Electron Microscopy SciencesQ3100AR1.3grids for Cryo-EM
Vitrobot Mark IIIFEIfor preparing sample grids by liquid ethane freezing
liquid nitrogenDura-CylUN1977
ethane gasAirgasUN1035
Solarus Plasma SystemGatanModel 950for cleaning grids before sample freezing
Tecnai Spirit electron microscopeFEIfor negative stain EM imaging
Talos Arctica electron microsocopeFEIfor screening and low resolution imaging of Cryo-EM grids
Titan Krios electron microscopeFEIfor high-resolution Cryo-EM imaging
Software
Gautomatch softwarehttp://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/to pick particles from micrographs
Relion 2.1 softwarehttps://github.com/3dem/relionto construct 2D and 3D classification
CryoSPARC softwarehttps://cryosparc.com/to generate an initial structure model
Frealign softwarehttp://grigoriefflab.janelia.org/frealignto refine particles
Coot softwarehttps://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/to build a model
MolProbity softwarehttp://molprobity.biochem.duke.edu/to evaluate the geometries of the atomic model
SerialEM softwarehttp://bio3d.colorado.edu/SerialEM/for automated serial image stack acquisition
MortionCor2 softwarehttp://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.htmlfor motion correction of summed movie stacks
GCTF softwarehttps://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/for measuring defocus values in movie stacks
Phenix.real_space_refine softwarehttps://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.htmlfor real space refinement of the initial 3D model

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