Autores
Entre em contato

Entrar

É necessária uma assinatura da JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou comece sua avaliação gratuita.

Neste Artigo

  • Resumo
  • Resumo
  • Introdução
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discussão
  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Este protocolo descreve técnicas utilizadas para determinar as estruturas do canal de íon pela microscopia cryo-elétron, incluindo um sistema de baculovirus usado eficientemente expressar genes em células de mamíferos, com esforço mínimo e toxicidade, extração de proteínas, purificação, e verificação de qualidade, preparação da amostra grade e triagem, bem como coleta de dados e processamento.

Resumo

Transiente do receptor potencial canais (TRPCs) da subfamília TRP canônica são canais de cátion não seletivo que desempenham um papel essencial na homeostase do cálcio, entrada de cálcio particularmente operada a loja, que é fundamental para manter a função adequada de lançamento da vesícula sináptica e vias de sinalização intracelulares. Por conseguinte, canais TRPC têm sido implicados em uma variedade de doenças humanas, incluindo distúrbios cardiovasculares, tais como hipertrofia cardíaca, doenças neurodegenerativas como a doença de Parkinson e distúrbios neurológicos como ataxia espinocerebelar. Portanto, canais TRPC representam um potencial alvo farmacológico em doenças humanas. No entanto, os mecanismos moleculares de gating nesses canais são ainda pouco claras. A dificuldade na obtenção de grandes quantidades de proteína purificada, homogênea e estável tem sido um fator limitante em estudos de determinação de estrutura, particularmente para proteínas de membrana de mamíferos como os canais de íon TRPC. Aqui, apresentamos um protocolo para a expressão em larga escala de proteínas de membrana de canal íon mamíferos usando um sistema de transferência do gene de baculovirus modificados e a purificação destas proteínas por afinidade e cromatografia de exclusão de tamanho. Apresentamos mais um protocolo para coletar imagens de microscopia cryo-elétron da único-partícula de proteína purificada e usar estas imagens para determinar a estrutura da proteína. Determinação da estrutura é um método poderoso para compreender os mecanismos de retenção e função em canais iônicos.

Introdução

Cálcio está envolvido em processos mais celulares, incluindo a sinalização, cascatas, controle de transcrição, liberação de neurotransmissor e hormônio molécula síntese1,2,3. A manutenção homeostática do cálcio citosólico livre é crucial para a saúde e a função das células. Um dos principais mecanismos de homeostase de cálcio intracelular é operada a loja cálcio entrada (SOCE), um processo no qual depleção de cálcio armazenado em disparadores o retículo endoplasmático (ER) a abertura de canais iônicos na membrana plasmática, para facilitar a reposição de cálcio ER, que pode ser usado na sinalização mais4,5,6. Canais potencial receptor transitória (TRPCs), que são canais de cálcio-permeável pertencentes à Superfamília TRP, identificaram-se como um participante importante em SOCE7,8,9 .

Entre os sete membros da família TRPC, TRPC3, TRPC6 e TRPC7 formam um subgrupo homólogo, e eles são únicos na habilidade de ser ativado pelo Mensageiro secundário lipídico diacilglicerol (DAG), um produto de degradação de lipídios a sinalização fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2)10,11. TRPC3 é altamente expresso no músculo liso e nas regiões do cérebro, onde ele tem um papel essencial na sinalização de cálcio que afetam a neurotransmissão e neurogênese12,13cerebrais e cerebelares. Disfunção de TRPC3 tem sido associada a distúrbios do sistema nervoso central, distúrbios cardiovasculares e certos tipos de câncer como adenocarcinoma ovariano14,15,16. Portanto, TRPC3 é uma promessa como um destino de farmacêutico para o tratamento destas doenças. Desenvolvimento de fármacos direcionados especificamente atuando na TRPC3 tem sido limitado pela falta de compreensão de seus mecanismos de ativação molecular, incluindo lipídios vinculação sites17,18. Informamos a primeira estrutura atômica-resolução do canal de TRPC3 humano (hTRPC3) e os seus sítios de ligação de lipídios dois em um estado fechado, proporcionando insights importantes sobre esses mecanismos de19.

O fator chave para determinar a estrutura de uma proteína de membrana em alta resolução é obter proteína de alta qualidade. O rastreio correspondente de expressão e purificação de condições necessárias para obter a proteína de alta qualidade pode ser uma tarefa demorada e dispendiosa. Aqui nós apresentamos um protocolo descrevendo em detalhe como identificamos as condições ideais para a expressão e purificação de hTRPC3, que se comportou mal na nossa seleção inicial. Apresentamos vários pontos-chave sobre como solucionar problemas e otimizar o comportamento da proteína, que colocam uma base sólida para nossa cryo-elétron estudos de microscopia (cryo-EM). Nós usamos um baculoviral modificado gerando vetor (pEG), desenvolvido pela Gouaux e colegas, que é otimizado para a seleção de ensaios e eficiente geração de baculovirus em células de mamíferos,20. Este método de expressão é apropriado para rápida e econômica a superexpressão de proteínas na membrana celular dos mamíferos. Podemos combinar o uso deste vetor com uma tamanho de fluorescência-deteção-exclusão baseada em cromatografia (FSEC) prescreening método21. Esse método usa uma tag de proteína verde fluorescente (GFP) fundida-se para a construção de interesse e melhora a visualização da proteína alvo em amostras pequenas, células inteiras de solubilizado. Isto permite a análise de estabilidade de proteína na presença de diferentes detergentes e aditivos, com mutações thermostabilizing e permite o uso de um pequeno número de células de transfecção transiente em pequena escala. Desta forma, uma infinidade de condições pode ser rastreada rapidamente antes de se mudar para uma purificação de proteínas em larga escala. Após a triagem, expressão e purificação, apresentamos um protocolo para obtenção e processamento de imagens de cryo-EM gerar uma determinação estrutural de novo da proteína. Acreditamos que as abordagens descritas aqui vão servir como um protocolo generalizável para estudos estruturais de receptores de canal TRP e outras proteínas de membrana.

Protocolo

1. transformação de células competentes de DH10α para produzir Bacmid DNA

  1. Sintetizar o gene de interesse e subclone-lo em uma versão modificada do vetor pEG contendo uma gêmeo estreptococos-marca, uma marca His8 e GFP com um local de clivagem de trombina nas N terminal (pFastBacI)20.
  2. Transformar células competentes adicionando 5 ng do plasmídeo contendo o gene desejado em pFastBacI de 50 μL de DH10α células em um 1,5 mL tubo e incubam durante 10 min no gelo. Choque de calor das células para 45 s a 42 ° C. Adicionar 200 µ l de caldo super ideal com meio repressor catabólicos (SOC) ao tubo e incubar durante 4-8 h a 37 ° C em um agitador orbital a 225 rpm.
  3. Placa de 5 μL de células numa placa de ágar bacmid LB (50 canamicina μg/mL, 7 gentamicina μg/mL, ágar de tetraciclina, 100 μg/mL Bluo-gal e 40 μg/mL isopropílico β-D-1-thiogalactopyranoside [IPTG], de 10 μg/mL).
  4. Incubar a placa por 48 h a 37 ° C.
    Nota: As colônias de manchas de indicador de Bluo-gal que ainda estão expressando lacZ (vetor inserção malsucedida), permitindo a seleção das colônias (transformadas com êxito) brancas.
  5. Selecione cuidadosamente uma colônia branca isolada, evitando qualquer colônias brancas que estão em contacto com as colónias azuis e desenvolvem-se células durante a noite em 6 mL de meio de bacmid LB (50 canamicina μg/mL, 7 gentamicina μg/mL, tetraciclina 10 μg/mL) a 37 ° C em um agitador orbital a 225 rpm.

2. bacteriana preparação para isolamento de Bacmid DNA

  1. Para isolar o DNA bacmid, spin para baixo de células de Escherichia coli por 10 min a 2880 x g.
  2. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 200 µ l de solução de ressuspensão celular a partir do miniprep kit (ver Tabela de materiais) por pipetagem. Certifique-se de que a pelota é homogênea e totalmente suspenso. Em seguida, transferi a suspensão de eritrócitos para tubos de 1,5 mL.
  3. Adicione 200 µ l da solução de lise celular de miniprep kit e misture por inversão do tubo algumas vezes. Incube durante até 5 min. à temperatura ambiente (RT) para lisar as células. Adicione 200 µ l de solução de neutralização do kit de miniprep e mistura por inversão do tubo algumas vezes para parar a reação de Lise.
  4. Spin para baixo por 10 min a 21.130 x g em uma centrífuga de mesa. Colete 600 μL do sobrenadante em um tubo de 2 mL. Adicionar a solução-600 μL de fenol: clorofórmio: isoamílico álcool (ver Tabela de materiais) e misture bem para extrair o DNA do restante dos produtos da lise celular.
    Atenção: A solução de fenol: clorofórmio: isoamílico álcool é tóxica por inalação, em contacto com a pele e se ingerido. Ele pode causar queimaduras químicas e pode ser cancerígeno. Use luvas e avental abotoado. Trabalho em uma coifa. Descarte de resíduos perigosos devidamente.
  5. Gire o tubo para 10 min a 21130 x g em uma centrífuga de mesa. Duas fases líquidas separadas será visíveis. Transferi com cuidado, 300 µ l da fase aquosa superior para um novo tubo. Adicione 600 μL de etanol 100% para lavar o DNA. Inverta suavemente o tubo para misturar.
    Nota: Fazer não vórtice, como isto pode distorcer o DNA bacmid.
  6. Tubos de legais, colocando-os no congelador-20 ° C durante 10 min. Spin para baixo por 10 min a 21.130 x g em uma centrífuga de mesa. Desprezar o sobrenadante e preservar a pelota do ADN.
  7. Adicione 1 mL de etanol a 70% para lavar o sedimento. Inverta suavemente o tubo para misturar. Girar para 10 min a 21.130 x g em uma centrífuga de mesa. Desprezar o sobrenadante e permitir que a pelota para o ar seco por aproximadamente 5 minutos ou até que o líquido não é visível no tubo e o pellet de DNA torna-se translúcido.
  8. Resuspenda o pellet seco em 50 µ l de estéril, livre de DNase, água desionizada. Medir a concentração de DNA.
    Nota: Não congele bacmid DNA. Armazenar a 4 ° C por até vários dias.

3. transfecção de células de inseto Sf9 com Bacmid para produzir Baculovirus P1

  1. Semente 0,9 x 106 células/poço de Sf9 em 2 mL de meio apropriado (consulte a Tabela de materiais) em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 6-poços. Incube as células a 27 ° C por 20 min promover a ligação com a placa.
    Cuidado: As culturas celulares são um risco biológico potencial. Trabalhar em um capô aprovado fluxo laminar com técnicas assépticas e verifique as orientações institucionais e governamentais para roupas de proteção recomendada e destinação adequada de resíduos antes de realizar experimentos.
  2. Após a fixação, adicionar 8 µ l de reagente de transfeccao (ver Tabela de materiais) para 100 µ l de mídia para cada poço dos 6 placa bem sendo transfectadas em um tubo estéril. Adicione 100 µ l de meio em um tubo estéril separado 6 μg de bacmid DNA. Incubar a 5 min à RT. Combine as duas soluções e incubar durante 45 min à RT
  3. Substitua o medium em 6 poços com 2 mL de meio fresco. Adicione a mistura da etapa anterior para cada um bem gota a gota (200 µ l por alvéolo). Agitar suavemente a placa para garantir a mistura da solução do transfection no meio de.
    Nota: Não agite ou agitar a placa porque isso fará com que as células desanexar.
  4. Incube as células para a 5D (120 h) numa incubadora umidificado de 27 ° C. Verifique a fluorescência de GFP antes da colheita para verificar que o vírus está sendo produzido em uma grande porcentagem de células; se a porcentagem é baixa, estender o tempo de incubação, se necessário (ver Figura 1).
  5. Recolha o sobrenadante contendo vírus de P1 (cerca de 2 mL de cada poço). Filtre o meio contendo vírus P1 para tubos de 2 mL, usando uma seringa de 3 mL e pequeno filtro de 0,2 µm. Adicione estéreis de soro fetal bovino (FBS) a uma concentração final de 1%.
    Nota: Este estoque de vírus P1 deve ser armazenada a 4 ° C e ser protegido da luz.

4. infecção das células de inseto Sf9 com Baculovirus P1 para produzir Baculovirus P2

  1. Preparar 200 mL (ou volume desejado) de células Sf9 em uma concentração de 0,8 - 0,9 x 106 células/mL em meio adequado (ver Tabela de materiais) em um Erlenmeyer de cultura inferior plana de tamanho suficiente.
    Nota: Para a cultura de suspensão, a quantidade utilizada não deve ultrapassar 40% da capacidade total do frasco.
  2. Adicione 1:2500 ratio (v/v) de estoque de vírus P1 do 3.5 para a cultura de suspensão celular Sf9. Incube durante o tempo de expressão ideal vírus (geralmente 48-120 h dependendo a construção de proteínas) a 27 ° C em um agitador orbital a 115 rpm.
    Nota: A expressão vírus relativo pode ser determinada através da visualização da fluorescência de GFP do vírus em uma amostra da cultura.
  3. Centrifugar a suspensão de eritrócitos por 40 min a 11.520 x g e recolher o sobrenadante contendo vírus de P2. Filtre o sobrenadante usando filtros descartáveis de 0,2 µm. Adicione FBS para uma concentração final de 0,5%.
    Nota: Este estoque de vírus P2 deve ser armazenado a 4 ° C e ser protegido da luz.
  4. Obter um título para o P2 vírus usando células Sf9easy ou um contador de vírus.

5. infecção das células de mamíferos HEK293 com Baculovirus P2 na expressão de proteínas em larga escala

  1. Preparar um volume desejável de HEK293 suspensão cultura de pilha mamífera (4-6 L é recomendado para preparação de grades congelados) com uma concentração de 3,5-3,8 x 106 células/mL em meio de expressão (veja a Tabela de materiais) suplementado com 1% (v / v) FBS estéril em perplexo-fundo cultura Erlenmeyers de tamanho suficiente.
    Nota: Para a cultura de suspensão, o volume utilizado não deve exceder 40% do volume total do frasco.
  2. Adicione 8% (v/v) de solução-mãe de vírus P2 da etapa 4.3 para a cultura de suspensão de células HEK293. Incube a 37 ° C em um agitador orbital a 135 rpm.
  3. Adicione o butirato de sódio de 10 mM a pós-infecção 12-18 h. Incubar durante o tempo da expressão da proteína ideal (geralmente 36-72 h) a 30 ° C.
  4. Recolher as células por centrifugação por 20 min a 2.880 x g. Lave as células por resuspending em aproximadamente 100 mL salino tris (TBS) por litro de células colhidas. Centrifugue novamente por 20 min a 2.880 x g e coletar o centrifugado.
    Nota: O protocolo pode ser uma pausa aqui. Pelotas de célula podem ser snap-congelado em nitrogênio líquido e armazenadas a-80 ° C até a purificação.
    Cuidado: Nitrogênio líquido pode causar queimaduras criogênicas ou lesão. Pode causar queimaduras. Pode deslocar o oxigênio e causar sufocamento rápido. Use luvas isolantes frias e protetor facial.
  5. Colheitas de pequenas 1 mL em diferentes pontos do tempo de recolher e solubilizar durante 2 h a 4 ° C, com o balanço ou mexendo na presença de detergentes diferentes e/ou aditivos. Estas pequenas amostras solubilized de células inteiras podem ser esclarecidas por ultracentrifugação a 235.000 × g por 10 min a 4 ° C e executar como uma amostra de 30 μL em uma coluna de cromatografia de exclusão-tamanho (SEC) (consulte a Tabela de materiais) para determinar o melhor momento para expressão e as melhores condições de solubilização.
    Nota: No caso de hTRPC3, esta seleção incluía buffers diferentes com valores de pH de 4.0-9,5 e concentrações de sal de 50-500 mM; diferentes composições iónicas (como MgCl2 ou NaCl); detergentes diferentes com valores de concentração (CMC) micelle crítico de 0.1 - 20 mM; redução de aditivos tais como ditiotreitol, tris(2-carboxyethyl) fosfina e β-Mercaptoetanol; e os quelantes de cálcio ácido aditivo ácido etilenodiaminotetracético (EDTA).

6. purificação da proteína de hTRPC3 do centrifugado congelado

  1. Descongelar a pelota em tampão contendo 20 mM Tris (pH 8.0), 500 mM de NaCl, fluoreto de phenylmethylsulfonyl de 1 mM (PMSF) 0,8 μM aprotinina, 2 μg/mL leupeptin, pepstatin 2mm A, e 1% de digitonin, usando 100 mL de tampão por litro de células colhidas. Uma vez descongelado, assegure a homogeneidade da solução por pipetagem ou mexendo. Permita para solubilizar durante 2 h a 4 ° C em um béquer imergido no gelo com uma celeuma barra rotativa.
  2. Remover os resíduos de célula por ultracentrifugação a 235.000 × g durante 1 h a 4 ° C. Verifique a quantidade de proteína executando uma amostra de 30 μL em uma coluna da SEC (ver Tabela de materiais) por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e visualizar a proteína alvo pela saída de sinal de GFP.
  3. Incubar a proteína solubilized (sobrenadante) com resina de afinidade de cobalto para 1-2 h a 4 ° C. Verifique se o emperramento da proteína à resina executando uma amostra de 30 μL em uma coluna do SEC.
    Nota: Se tiver ocorrido a ligação às proteínas, o alvo de etiquetado proteína GFP será retido na coluna, não consta a passagem. Portanto, nenhum sinal GFP estará presente na posição correspondente ao tamanho da proteína alvo quando o escoamento é executado em HPLC.
  4. Lave a resina com 10 volumes de coluna do buffer (20 mM Tris, pH 8.0, 500 mM de NaCl, imidazol 15 mM e 0,1% digitonin). Verificar a perda de proteína executando uma amostra de 30 μL em uma coluna do SEC.
    Nota: Se tiver ocorrido a perda de proteína da coluna, o alvo de etiquetado proteína GFP se encontrarão no tampão de lavagem que tem passado sobre a coluna. Portanto, sinal GFP estará presente na posição correspondente ao tamanho da proteína alvo quando o tampão de lavagem é executado em HPLC. Se ocorreu a perda de proteína, a concentração de imidazole do tampão de lavagem pode precisar ser reduzido para evitar perturbar sua vinculação de marca para a coluna de afinidade.
  5. Eluir o limite a resina hTRPC3 com buffer (20 mM Tris, pH 8.0, 500 mM de NaCl, imidazol 250 mM e 0,1% digitonin). Adicionar a trombina em um 01:20 razão molar (para cravar a marca GFP) e adicionar 10 mM EDTA (um agente estabilizador de hTRPC3) para a amostra eluted e incubar durante 3 h a 4 ° C. Verifica que a proteína tem sido eluída executando 90 μL de uma amostra diluída 1: 100 em uma coluna de SEC e verificação da presença de um sinal GFP na posição correspondente ao tamanho da proteína alvo.
    Nota: neste ponto, o sinal de triptofano da proteína total na eluição pode também ser visto. Somente a proteína alvo de afinidade-purified permanecerão na eluição e o GFP e triptofano sinais serão perto de idêntico no perfil. Se a proteína do alvo não é vista em grande quantidade na eluição, mas não foi perdida no escoamento ou lavagem, a proteína provavelmente manteve-se ligado à coluna e pode ser eluída usando uma concentração mais elevada de imidazol no buffer.
  6. Concentrar-se o eluato de 500 µ l ou menos em um filtro de centrífuga de 15 mL 100K tubo (ver Tabela de materiais) por fiação a 2.880 x g a 4 ° C, em incrementos de 5 min. Resuspenda as proteínas pipetando a solução acima e para baixo entre spins para evitar overconcentrating.
    Nota: Tempo de centrifugação pode ser encurtado, como o volume aproxima-se o volume final desejado.
  7. Carrega o concentrado em uma coluna da SEC em buffer (20 mM Tris, pH 8.0, 500 mM de NaCl, 1 mM EDTA e 0,1% digitonin). Execute.
  8. Combinar as frações de pico contendo o tetrâmero TRPC3 intacto, como visualizado pelo sinal de absorbância UV e concentrar-se novamente para uma concentração final de pelo menos 5 mg/mL.

7. a despistagem da proteína por microscopia de elétron negativo-mancha

  1. Liga a máquina brilho da descarga. Defina o programa para descarregar uma grade de carbono revestido usando argônio e oxigênio por 30 s. executar o programa para fazer o revestimento de carbono nas grades de 400-malha cobre hidrofílico antes da adição da solução da proteína.
  2. Configurar μL de cinco 40 gotas de água estéril e gotas duas 40 μL de solução de formiato de uranilo 1% (no filme de laboratório, papel de cera ou uma superfície similar, consulte Tabela de materiais). Tirar a grade da etapa 7.1 e adicionar 2,5 μL de proteína da amostra 5 mg/mL (50-200 μM) sobre o lado escuro e deixe descansar por 1 min.
  3. Depois de 1 min, seque a grade usando papel de filtro. Não toque o filtro de papel diretamente para a superfície da grade; em vez disso, levar o papel para a borda da gota líquida e permitem a ação capilar puxar o líquido da grade para o papel de filtro.
  4. Mergulhe a grade na primeira gota de água. Seque com papel de filtro e repita com as restante de gotas de água e a primeira gota de formiato de uranilo. Permitir que a segunda gota de uranilo formiato sentar-se por 1 min e depois seque com papel de filtro. Permitir que a grade de ar seco (cerca de 1 min) antes de guardar.
    Nota: Este protocolo de coloração pode não ser ideal para todas as combinações de proteína-detergente. Diferentes concentrações de formiato de uranilo mancham e diferentes comprimentos de tempo para exposição de mancha devem ser testados se os passos acima não fornecem uma mancha com bom contraste.
  5. As grades em um microscópio eletrônico de imagem (consulte a Tabela de materiais) para verificar a qualidade de partícula de proteína. Certifique-se de que o micrografias mostram inúmeras partículas que são homogêneas na distribuição e no aspecto geral, exibir bom contraste e igualar o tamanho previsto da proteína alvo.
  6. Gerar preliminar, baixa resolução, bidimensionais (2D) classificações usando micrografias de 50-100 (veja processamento de dados – etapa 10) para verificar que as partículas representam diferentes pontos de vista de uma única estrutura consistente.
    Nota: Micrografias e classes 2D preliminares de qualidade suficiente, como descrito acima, são um forte indicador de que o protocolo foi suficientemente otimizado para purificação de proteínas. Preparação e triagem de grades EM crio-se justifica neste momento.

8. preparação da amostra EM

  1. Brilho da descarga-uma grade de ouro holey carbono (ver Tabela de materiais), conforme descrito no passo 7.1.
  2. Aplica 2,5 μL da amostra proteína concentrada hTRPC3 (5 mg/mL) para o grid. Borre a grade para 1.5 s usando uma mancha forçar de 1 e um tempo de espera de 5 s a 100% de umidade e 4 ° C, em seguida mergulhe a grade etano líquido refrigerado por nitrogênio líquido, usando uma máquina de vitrificação.
    Nota: A umidade, temperatura, força-borrão, borrão tempo e tempo de espera listados aqui foram usados para hTRPC3 de estudo19 dos autores. Eles talvez precise ser alterado para produzir gelo vítreo ideal para detergentes e outras proteínas.
  3. Tela congelada grades para condições de gelo ideal usando um microscópio de cryo-EM (ver Tabela de materiais) e manualmente vista fina de regiões de gelo grosso (quadrados de grade que aparecem menores e mais escuras), gelo (quadrados de grade que aparecem maiores e mais brilhantes) e meio de gelo .
    Nota: Gelo mais grosso, muitas vezes tem mais partículas, enquanto o gelo mais fino muitas vezes produz a resolução e melhor contraste. Triagem manual de uso de imagens para determinar qual gelo condições resulta em um grande número de partículas monodispersas com bom contraste e resolução. Uma vez que boas condições são verificadas, mova a coleção de imagem em um microscópio de cryo-EM 300 kV.

9. coleta de dados EM

  1. Usando um programa de aquisição automatizada, gravar pilhas de imagem no modo de contagem de super-resolução com um tamanho de pixel binned de 1.074 Å em um microscópio eletrônico operado em 300 kV com uma ampliação nominal de 130.000 X direto detector de elétrons.
  2. Dose-fractionate cada imagem a 40 quadros com um tempo total de exposição de 8 s, com 0.2 s por frame e uma taxa de dose de 6,76 e− Å s− 2 − 1 (valores nominais desfocagem variadas de 1,0 a 2,5 μm na experiência dos autores).

10. EM informática

  1. Implementar o movimento de correção de resumiu filme pilhas22 e estimar valores de desfocagem23 usando o software de processamento de dados (ver Tabela de materiais)24.
  2. Partículas das micrografias de escolher. Estas partículas de escolheu use para construir uma classificação inicial livre de referência 2D usando o software24. Médias de selecionar classe 2D ideal para usar como modelos para a colheita de partículas automatizado para todo o conjunto de dados.
  3. Verificar a qualidade das partículas autoescolheu e remover partículas maus manualmente. Use várias rodadas de classificação 2D para limpar partículas escolhidas.
  4. Gere um modelo inicial de25. Objecto 2D escolheu partículas tridimensionais (3D) classificação (cerca de 5 classes) usando simetria C1 e um filtro passa-baixas de reconstrução inicial de 60 Å como um modelo de referência. Determine quais classes têm características de alta resolução e combinam as partículas dentro de uma classe.
  5. Refinar as partículas usando o refinamento local com simetria do C4 (no caso hTRPC3) aplicada e um limite de alta resolução para alinhamento de partícula definido para 4.5 Å26.

11. modelo de edifício

  1. Construir um modelo (consulte a Tabela de materiais para o software utilizado). Para hTRPC3, use o domínio transmembrana (DTM) do transiente do receptor potencial melastatin 4 (TRPM4) 5wp6 de banco de dados (PDB) de proteína de estrutura como um guia de27. Utilização de resíduos volumosos e predição da estrutura secundária para guiar de novo edifício.
  2. O modelo inicial para refinamento do espaço real com estrutura secundária restrições28de assunto. Examine o modelo refinado e remodify conforme necessário (ver Tabela de materiais para o software utilizado) manualmente.
  3. Aplicam-se curvas de correlação (FSC) de casca de Fourier para calcular a diferença entre o modelo final e o mapa EM para validação da estrutura refinada. Avaliar as geometrias dos modelos atômicos (consulte Tabela de materiais para o software utilizado)29,30.

Resultados

Uma visão esquemática do protocolo para a expressão e purificação de hTRPC3 são mostrados na figura 1A. Uma imagem da placa de bacmid de hTRPC3 com colônias brancas ideais, semelhantes àquele selecionado para a purificação de DNA de bacmid, é mostrada na figura 1B. Descobrimos que 48 h é ideal para coloração de Bluo-gal clara, mantendo a presença de colônias isoladas. Picos de produção de vírus de P2 para hTRPC...

Discussão

Determinação estrutural de proteínas por cryo-EM tem revolucionado o campo da biologia estrutural nos últimos anos, graças ao desenvolvimento de novas câmeras e algoritmos que acelera significativamente a determinação da estrutura das proteínas que não prontamente crystalize, particularmente as proteínas da membrana. Apesar de todos os avanços recentes na técnica de cryo-EM, a preparação de proteínas purified em qualidade e quantidade suficiente para facilitar a alta qualidade de imagem muitas vezes conti...

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos G. Zhao e X. Meng o apoio com coleta de dados para o David Van Andel Cryo-elétron microscopia conjunto avançado. Agradecemos a equipe VARI de computação de alto desempenho para suporte computacional. Nós damos nossa gratidão a s. Clemente, D. dívidas, J. Floramo, Y. Huang, Y. Kim, C. Mueller, B. Roth e Ruan z para comentários que melhoraram muito este manuscrito. Agradecemos a D. Nadziejka de apoio editorial para este manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela VARI interno financiamento.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
pEG BacMam vector (pFastBacI)addgene31488
DH10α cellsLife Technologies10361-012
S.O.C. mediaCorning46003CRfor transformation of DH10α cells for Bacmid
Bacmam culture platesTeknovaL5919for culture of transformed DH10α cells
Incubation shaker for bacterial cellsInfors HTMultitron standard
Incubated orbital shaker for insect cellsThermo-FisherSHKE8000
Reach-in CO2 incubator for mammalian cellsThermo-Fisher3951
Table-top orbital shakerThermo-FisherSHKE416HPused in Reach-in CO2 incubator for mammalian cells
IncubatorVWR1535for bacterial plates
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106for plasmid extraction and purification
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcoholInvitrogen15593031for DNA extraction
Sf9 cellsLife Technologies12659017insect cells for producing virus
Sf-900 mediaGibco12658-027insect cell media
FBSAtlanta BiologicalsS11550
Cellfectin IIGibco10362100for transfecting insect cells
lipofectamine 2000Invitrogen11668-027for transfecting mamalian cells
0.2 mm syringe filterVWR28145-501for filtering P1 virus
0.2 mm filter flasks 500ml resevoirCorning430758for filtering P2 virus
erlenmeyer culture flask (flat bottom 2L)Gene MateF-5909-2000for culturing insect cells
erlenmeyer culture flask (baffled 2L)Gene MateF-5909-2000Bfor culturing mammalian cells
nanodrop 2000 spectrophotometerThermo-FisherND-2000for determining DNA and protein concentrations
HEK293ATCCCRL-3022mammalian cells for producing protein
Freestyle 293 expression MediumGibco1238-018mammalian cell media for protein expression
Butyric Acid Sodium SaltAcros263195000to amplify protein expression
PMSFAcros215740500protease inhibitor
Aprotinin from bovine lungSigma-AldrichA1153-100MGprotease inhibitor
Leupeptin hydrochlorideSigma-Aldrich24125-16-4protease inhibitor
pepstatin AFisher ScientificBP2671-250protease inhibitor
digitoninEMD Millipore300410detergent - to solubilize protein from membrane
imidazoleSigma792527to elute protein from resin column
TALON resinClonetech635504for affinity purification by His-tag
superose6 incease columnsGE29091596; 29091597for HPLC and FPLC
Prominence Modular HPLC SystemShimadzuSee Below
Controller Module"CBM20A
Solvent Delivery System"LC30AD
Fluorescence Detector"RF20AXS
Autosampler with Cooling"SIL20ACHT
Pure FPLC System with FractionatorAkta
thrombin (alpha)Haematologic Technologies IncorporatedHCT-0020 Human alphafor cleaving GFP tag
Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugal filter tubeMilliporeUFC910008for concentrating protein
EDTAFisherE478500for stabilizing protein
400 mesh carbon-coated copper gridsTed Pella Inc.01754-Fgrids for negative stain
Quantifoil holey carbon grid (gold, 1.2/1.3 μm size/hole space, 300 mesh)Electron Microscopy SciencesQ3100AR1.3grids for Cryo-EM
Vitrobot Mark IIIFEIfor preparing sample grids by liquid ethane freezing
liquid nitrogenDura-CylUN1977
ethane gasAirgasUN1035
Solarus Plasma SystemGatanModel 950for cleaning grids before sample freezing
Tecnai Spirit electron microscopeFEIfor negative stain EM imaging
Talos Arctica electron microsocopeFEIfor screening and low resolution imaging of Cryo-EM grids
Titan Krios electron microscopeFEIfor high-resolution Cryo-EM imaging
Software
Gautomatch softwarehttp://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/to pick particles from micrographs
Relion 2.1 softwarehttps://github.com/3dem/relionto construct 2D and 3D classification
CryoSPARC softwarehttps://cryosparc.com/to generate an initial structure model
Frealign softwarehttp://grigoriefflab.janelia.org/frealignto refine particles
Coot softwarehttps://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/to build a model
MolProbity softwarehttp://molprobity.biochem.duke.edu/to evaluate the geometries of the atomic model
SerialEM softwarehttp://bio3d.colorado.edu/SerialEM/for automated serial image stack acquisition
MortionCor2 softwarehttp://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.htmlfor motion correction of summed movie stacks
GCTF softwarehttps://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/for measuring defocus values in movie stacks
Phenix.real_space_refine softwarehttps://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.htmlfor real space refinement of the initial 3D model

Referências

  1. Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
  2. Kumar, R., Thompson, J. R. The regulation of parathyroid hormone secretion and synthesis. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (2), 216-224 (2011).
  3. Sudhof, T. C. Calcium control of neurotransmitter release. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (1), a011353 (2012).
  4. Ong, H. L., de Souza, L. B., Ambudkar, I. S. Role of TRPC Channels in Store-Operated Calcium Entry. Advances in Experimental Medicine and Biology. 898, 87-109 (2016).
  5. Smyth, J. T., et al. Activation and regulation of store-operated calcium entry. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (10), 2337-2349 (2010).
  6. Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiological Reviews. 95 (4), 1383-1436 (2015).
  7. Liu, X., Singh, B. B., Ambudkar, I. S. TRPC1 is required for functional store-operated Ca2+ channels. Role of acidic amino acid residues in the S5-S6 region. Journal of Biological Chemistry. 278 (13), 11337-11343 (2003).
  8. Zhu, X., Jiang, M., Birnbaumer, L. Receptor-activated Ca2+ influx via human Trp3 stably expressed in human embryonic kidney (HEK)293 cells. Evidence for a non-capacitative Ca2+ entry. Journal of Biological Chemistry. 273 (1), 133-142 (1998).
  9. Zhu, X., et al. trp, a novel mammalian gene family essential for agonist-activated capacitative Ca2+ entry. Cell. 85 (5), 661-671 (1996).
  10. Itsuki, K., et al. Voltage-sensing phosphatase reveals temporal regulation of TRPC3/C6/C7 channels by membrane phosphoinositides. Channels (Austin). 6 (3), 206-209 (2012).
  11. Tang, J., et al. Identification of common binding sites for calmodulin and inositol 1,4,5-trisphosphate receptors on the carboxyl termini of trp channels. Journal of Biological Chemistry. 276 (24), 21303-21310 (2001).
  12. Gonzalez-Cobos, J. C., Trebak, M. TRPC channels in smooth muscle cells. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 15, 1023-1039 (2010).
  13. Li, H. S., Xu, X. Z., Montell, C. Activation of a TRPC3-dependent cation current through the neurotrophin BDNF). Neuron. 24 (1), 261-273 (1999).
  14. Becker, E. B., et al. Candidate screening of the TRPC3 gene in cerebellar ataxia. Cerebellum. 10 (2), 296-299 (2011).
  15. Kitajima, N., et al. TRPC3 positively regulates reactive oxygen species driving maladaptive cardiac remodeling. Scientific Reports. 6, 37001 (2016).
  16. Yang, S. L., Cao, Q., Zhou, K. C., Feng, Y. J., Wang, Y. Z. Transient receptor potential channel C3 contributes to the progression of human ovarian cancer. Oncogene. 28 (10), 1320-1328 (2009).
  17. Oda, K., et al. Transient receptor potential cation 3 channel regulates melanoma proliferation and migration. Journal of Physiological Sciences. 67 (4), 497-505 (2017).
  18. Xia, M., Liu, D., Yao, C. TRPC3: A New Target for Therapeutic Strategies in Chronic Pain-DAG-mediated Activation of Non-selective Cation Currents and Chronic Pain (Mol Pain 2014;10:43). Journal of Neurogastroenterology and Motility. 21 (3), 445-447 (2015).
  19. Fan, C., Choi, W., Sun, W., Du, J., Lu, W. Structure of the human lipid-gated cation channel TRPC3. Elife. 7, e36852 (2018).
  20. Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
  21. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay to identify membrane protein expression and crystallization conditions. Structure (London, England: 1993). 20 (8), 1293-1299 (2012).
  22. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  23. Zhang, K. Gctf: Real-time CTF determination and correction. Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).
  24. Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  25. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  26. Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
  27. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  28. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
  29. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).
  30. Scheres, S. H. W., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature Methods. 9 (9), 853-854 (2012).
  31. Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  32. Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
  33. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 12-21 (2010).
  34. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).
  35. Green, E. M., Au, Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. Journal of Visualized Experiments. (117), e54792 (2016).
  36. Mesa, P., Deniaud, A., Montoya, G., Schaffitzel, C. Directly from the source: endogenous preparations of molecular machines. Current Opinion in Structural Biology. 23 (3), 319-325 (2013).
  37. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane Protein Assembly into Nanodiscs. FEBS letters. 584 (9), 1721-1727 (2010).
  38. Winkler, P. A., Huang, Y., Sun, W., Du, J., Lü, W. Electron cryo-microscopy structure of a human TRPM4 channel. Nature. 552, 200-204 (2017).
  39. Autzen, H. E., et al. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science. 359 (6372), 228-232 (2017).
  40. Guo, J., et al. Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4. Nature. 552 (7684), 205-209 (2017).
  41. Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1860 (2), 378-383 (2018).
  42. Gulati, S., et al. Detergent-free purification of ABC (ATP-binding-cassette) transporters. Biochemical Journal. 461 (2), 269-278 (2014).

Reimpressões e Permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE

Solicitar Permissão

Explore Mais Artigos

Bioqu micaedi o 143canal i nicoprote na de membranapurifica o de prote nasdetermina o da estruturacrio microscopiacryo EMbaculovirus

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Entre em contato

recomende à biblioteca

Newsletter

Pesquisa

Educação

Autores

Bibliotecários

SOBRE A JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados