Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר טכניקות המשמשות לקביעת יון ערוץ מבנים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הקפאה, כולל מערכת baculovirus שנועדה להביע ביעילות גנים בתאים בתרבית של מינימום מאמץ, רעילות, חלבון החילוץ, טיהור, בדיקת איכות, הכנת הדוגמא רשת ו ההקרנה, כמו גם איסוף נתונים, עיבוד.

Abstract

ערוצי פוטנציאלי קולטן ארעי (TRPCs) תת TRP הקנוני הם ערוצים הקטיון nonselective לשחק תפקיד חיוני הומאוסטזיס סידן, ערך סידן במיוחד המופעלים על החנות, אשר חיוני לשמירה על תפקוד תקין של שלפוחית סינפטית שחרור, תאיים איתות המסלולים. בהתאם לכך, ערוצי TRPC היו מעורבים במגוון רחב של מחלות האדם כולל מחלות לב וכלי דם כגון היפרטרופיה, הפרעות ניווניות כגון מחלת פרקינסון, הפרעות רגשיות ונוירולוגיות כגון אטקסיה spinocerebellar. לכן, ערוצי TRPC מייצגים יעד פוטנציאליים תרופתי למחלות אנושיות. עם זאת, המנגנון המולקולרי של gating בערוצים אלה עדיין אינם ברורים. הקושי בהשגת כמויות גדולות של חלבונים מטוהרים, הומוגני ויציב כבר גורם מגביל במחקרים נחישות מבנה, במיוחד עבור ממברנה יונקים חלבונים כגון תעלות היונים TRPC. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור הביטוי בקנה מידה גדול של יון בתרבית של ערוץ קרום חלבונים באמצעות מערכת העברת הגן ששונה baculovirus ולטיהור חלבונים אלה על-ידי זיקה ו כרומטוגרפיה גודל-הדרה. בהמשך נציג פרוטוקול כדי לאסוף יחיד-חלקיקים הקפאה-אלקטרון מיקרוסקופ תמונות של חלבון מטוהרים וכדי להשתמש בתמונות אלה כדי לקבוע את מבנה החלבון. מכשור לקביעת קשיות ומבנה היא שיטה עוצמה להבנת המנגנונים של gating ותפקוד בתוך תעלות יונים.

Introduction

סידן מעורב תהליכים תאיים ביותר כולל איתות אשדים, בקרת שעתוק, שחרור נוירוטרנסמיטר והורמון מולקולה סינתזה1,2,3. קיום cytosolic סידן חינם homeostatic חיוני הבריאות והתפקוד של תאים. אחד המנגנונים העיקריים של הומאוסטזיס סידן תאיים הוא סידן המופעלים באמצעות החנות כניסה (SOCE), תהליך שבו דלדול של הסידן מאוחסנים הגורמים המפעילים (ER) רשתית תוך-פלזמית פתיחת תעלות היונים על קרום פלזמה כדי להקל חידוש מלאי של מיון סידן, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש עוד איתות4,5,6. קולטן ארעי פוטנציאליים ערוצים (TRPCs), אשר ערוצי סידן-חדיר השייכים superfamily TRP, זוהו כמשתתף העיקריים ב- SOCE-7,-8,-9 .

בין חברי שבע ממשפחת TRPC, TRPC3, TRPC6 ו- TRPC7 ליצור קבוצת homologue, והם ייחודי ביכולת להיות מופעל על ידי השומנים שליח משני diacylglycerol (DAG), תוצר השפלה של השומנים איתות phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2)10,11. TRPC3 מתבטאת מאוד שריר חלק, האזורים במוח, אסטרוציטומה של המוח, שבו היא משחקת תפקידים חיוניים ב סידן איתות להשפיע12,עצבית ו נוירוג'נסיס13. תפקוד לקוי של TRPC3 נקשר במערכת העצבים המרכזית, מחלות לב וכלי דם, סרטן מסוימים כגון אדנוקרצינומה השחלות14,15,16. לכן, TRPC3 טומן בחובו הבטחה כמטרה תרופות לטיפול במחלות אלה. הפיתוח של תרופות ממוקדות במיוחד על TRPC3 היה מוגבל בשל חוסר ההבנה של מנגנונים הפעלה המולקולרי שלה, כולל השומנים איגוד אתרי17,18. אנחנו מדווחים על המבנה האטומי ברזולוציה הראשון של הערוץ TRPC3 האנושית (hTRPC3) ואתרי שלה מחייב ליפיד שתי במצב סגור, לספק תובנות חשובות אלה מנגנונים19.

גורם מפתח לקביעת המבנה של חלבון ממברנה ברזולוציה גבוהה הוא לקבל חלבון באיכות גבוהה. ההקרנה המתאימים של ביטוי וטיהור התנאים הדרושים לקבל חלבון איכותי יכול להיות מאמץ זמן רב ויקרות. כאן אנו מציגים פרוטוקול המתארת בפירוט כיצד אנו מזהים את תנאים אופטימליים כדי להפוך את הביטוי טיהור של hTRPC3, אשר התנהגה בצורה עלובה ההקרנה הראשונית שלנו. אנו מציגים מספר נקודות מפתח כיצד לפתור בעיות ולמטב את ההתנהגות חלבון, אשר בסיס יציב שלנו הקפאה-האלקטרון מיקרוסקופ (הקפאה-EM) מחקרים. אנו משתמשים baculoviral שונה של יצירת וקטור (pEG), שפותחה על ידי Gouaux ועמיתיו, אשר ממוטב עבור הקרנה מבחני והפקת יעיל baculovirus תאים בתרבית של20. שיטה זו ביטוי מתאים ביטוי מהירה וחסכונית של חלבונים קרום התא יונקים. אנו משלבים את השימוש הזה וקטור עם זריחה-זיהוי גודל-הדרה מבוססי וואקום (FSEC) prescreening שיטת21. שיטה זו משתמשת תג חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) דבוקה הבונה של עניין ומשפר ויזואליזציה של החלבון היעד בדגימות solubilized קטן, כל תא. זה מאפשר להקרנה של חלבון יציבות בנוכחות חומרי ניקוי שונים, תוספים, עם מוטציות thermostabilizing, והוא מאפשר השימוש של מספר קטן של תאים תקנים ארעי בקנה מידה קטן. בדרך זו, מספר רב של מצבים יכולים להיות במהירות מוקרן לפני שעבר הוא לטיהור חלבון בקנה מידה גדול. בעקבות הביטוי, סינון, טיהור, אנו מציגים פרוטוקול קבלת ועיבוד תמונות מהקפאה-EM כדי להפיק את נחישות דה נובו מבנית של החלבון. אנו מאמינים כי הגישות המתוארות כאן ישמש פרוטוקול להכליל ללימודי מבנית של קולטנים ערוץ TRP וחלבונים אחרים ממברנה.

Protocol

1. שינוי של תאים המוסמכת DH10α כדי לייצר Bacmid דנ א

  1. לסנתז את הגן עניין, subclone אותו לתוך גרסה מותאמת של וקטור פג המכיל טווין דלקת-תג, תג His8 וכן GFP עם אתר המחשוף תרומבין בקו ה N טרמינוס (pFastBacI)20.
  2. להפוך תאים המוסמכת על-ידי הוספת 5 ננוגרם של פלסמיד המכיל גנים הרצוי ב- pFastBacI כדי μL 50 של DH10α בתאים mL 1.5 צינור, תקופת דגירה של 10 דקות על קרח. חום לזעזע את התאים עבור 45 s-42 ° C. להוסיף הצינור μL 200 מרק סופר אופטימלית בינונית מדכא. שבולם קטבולי (SOC), תקופת דגירה של 4-8 h ב- 37 מעלות צלזיוס תפקודי לב / נשימה-225 סל ד.
  3. צלחת 5 μL של תאים על צלחת אגר bacmid ליברות (kanamycin μg/mL 50, 7 גנטמיצין μg/mL, אגר טטרציקלין, μg/mL 100 Bluo-גל ו 40 μg/mL איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside [IPTG], μg/מ"ל).
  4. דגירה את הצלחת. בשביל h 48-37 מעלות צלזיוס.
    הערה: המושבות כתמים של Bluo-גל מחוון זה הם עדיין לבטא lacZ (וקטור ההכנסה לא מוצלח), המאפשר בחירה של המושבות (בהצלחה טרנספורמציה) לבן.
  5. בחר בקפידה המושבה לבן מבודד, הימנעות מכל המושבות לבן נמצאים בקשר עם מושבות כחול ולאחר לגדל תאים לילה ב 6 מ של בינוני bacmid ליברות (kanamycin μg/mL 50, 7 גנטמיצין μg/mL, טטרציקלין μg/מ"ל) ב- 37 מעלות צלזיוס תפקודי לב / נשימה-225 סל ד.

2. חיידקי הכנה עבור בידוד של דנ א Bacmid

  1. כדי לבודד דנ א bacmid, ספין למטה Escherichia coli תאים עבור 10 דקות ב 2880 x g.
  2. להשליך תגובת שיקוע ואת resuspend בגדר ב 200 µL של התא פתרון resuspension של miniprep קיט (ראה טבלה של חומרים) על ידי pipetting. ודא שבגדר מלא, למשל מושהה. אז, העברת התליה תא לתוך צינורות 1.5 mL.
  3. להוסיף 200 µL של הפתרון פירוק התא miniprep ואת תערובת על-ידי היפוך הצינור כמה פעמים. תקופת דגירה של עד 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT) כדי lyse התאים. להוסיף 200 µL של פתרון ניטרול miniprep ואת תערובת על-ידי היפוך צינור כמה פעמים להפסיק את תגובת פירוק.
  4. ספין למטה למשך 10 דקות ב x 21,130 g ומפרידה שולחני. לאסוף 600 μL של תגובת שיקוע צינור 2 מ"ל. הוסף תמיסת כוהל של פנול: כלורופורם: isoamyl μL 600 (ראה טבלה של חומרים) מערבבים ביסודיות כדי לחלץ את ה-DNA של שאר המוצרים פירוק התא.
    התראה: תמיסת כוהל פנול: כלורופורם: isoamyl הוא רעיל באמצעות אינהלציה, במגע עם העור, ואם בלע. זה יכול לגרום כוויות כימיות, עשוי להיות מסרטנים. ללבוש כפפות, חלוק מעבדה מכופתרות. לעבוד בשכונה fume. השלך פסולת מסוכנת זו כראוי.
  5. לסובב את הצינור 10 דקות ב x 21130 g ומפרידה שולחני. לשני שלבים נפרדים נוזלי יהיה גלוי. להעביר בזהירות μL 300 מימית השלב העליון צינור. הוסף 600 μL של 100% אתנול לשטוף את ה-DNA. היפוך בעדינות את הצינור כדי לערבב.
    הערה: תעשה לא מערבולת, זה ניתן להטות bacmid DNA.
  6. צינורות מגניב על-ידי הצבתם במקפיא-20 ° C עבור 10 דקות ספין למטה למשך 10 דקות ב x 21,130 g ומפרידה שולחני. למחוק את תגובת שיקוע ולשמר בגדר ה-DNA.
  7. להוסיף 1 מ"ל אתנול 70% לשטוף את גלולה. היפוך בעדינות את הצינור כדי לערבב. ספין 10 דקות ב x 21,130 g ומפרידה מלמעלה בטבלה. למחוק את תגובת שיקוע ולאפשר בגדר לאוויר יבש במשך כ 5 דקות או עד שאין הוא גלוי בצינור בגדר DNA הופך שקוף.
  8. Resuspend בגדר יבש ב- 50 µL של סטרילי, נטולת DNase, יונים מים. מודדים את ריכוז הדנ א.
    הערה: אין להקפיא bacmid DNA. לאחסן ב 4 ° C עבור ועד מספר ימים.

3. תרביות תאים בתאי חרקים Sf9 עם Bacmid כדי לייצר P1 Baculovirus

  1. זרע 0.9 x 106 תאים/טוב Sf9 ב 2 מ של המדיום המתאים (ראה טבלה של חומרים) בכל טוב של צלחת תרביות רקמה 6-. טוב. דגירה תאים ב 27 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות לקדם את הקובץ המצורף לצלחת.
    התראה: תרביות תאים הן חומרים מסוכנים פוטנציאליים. עבודה מאושרות למינארי באמצעות טכניקות aseptic וסמנו הנחיות מוסדיים וממשלתיים המומלצת ביגוד מגן, סילוק נכון של פסולת לפני ביצוע ניסויים.
  2. לאחר מצורף, להוסיף µL 8 של תרביות תאים ריאגנט (ראה טבלה של חומרים) כדי µL 100 של מדיה עבור כל טוב של 6 טוב צלחת להיות transfected בשפופרת סטרילי. להוסיף μg 6 של bacmid ה-DNA µL 100 של מדיום בשפופרת סטרילי נפרד. דגירה 5 דקות RT. לשלב השני פתרונות, תקופת דגירה של 45 min ב- RT.
  3. החלף את המדיום בבארות 6 2 מיליליטר בינוני טריים. להוסיף את התערובת מהשלב הקודם לכל אחד טוב dropwise (200 µL לכל טוב). רוק בעדינות את הצלחת כדי להבטיח ערבוב של הפתרון תרביות תאים לתוך האמצעי.
    הערה: אל מערבולת או לנער את הצלחת מכיוון שהדבר יגרום תאים לנתק.
  4. דגירה תאים עבור 5 d (120 h) בחממה humidified 27 ° C. בדיקת קרינה פלואורסצנטית GFP לפני הקציר כדי לאמת שאת הוירוס מיוצר ואחוז גדול של תאים; אם האחוז נמוך, ולהאריך את זמן הדגירה כנדרש (ראה איור 1C).
  5. לאסוף את הווירוס P1 המכילים supernatant (בערך 2 מ"ל מכל קידוח). לסנן את המדיום המכיל וירוס P1 לתוך צינורות 2-mL באמצעות מזרק 3 מ ל וקטן-0.2 µm מסנן. להוסיף סרום שור עוברית סטרילי (FBS) ריכוז סופי של 1%.
    הערה: את המניה של P1 וירוס צריך להיות מאוחסן ב 4 ° C, להיות מוגן מפני אור.

4. זיהום של Sf9 תאים חרקים עם P1 Baculovirus לייצר P2 Baculovirus

  1. להכין 200 מ ל (או לנפח הרצוי) של תאים Sf9-ריכוז של 0.8 - 0.9 x 106 תאים למ"ל בינוני המתאים (ראה טבלה של חומרים) בבקבוקון תרבות Erlenmeyer בתחתית שטוח בגודל הרצוי.
    הערה: עבור השעיה תרבות, האחסון בשימוש לא יעלה על 40% מהקיבולת המרבית של הבקבוק.
  2. להוסיף יחס 1:2500 (וי/v) של מניות וירוס P1 3.5 לתרבות התליה תא Sf9. תקופת דגירה של הזמן של הביטוי אופטימלית וירוס (בדרך כלל 48-120 ח בהתאם הבונה חלבון) ב 27 ° C ב שייקר מסלולית-115 סל ד.
    הערה: הביטוי יחסי וירוס יכול להיקבע על-ידי הצגת את פלורסצנטיות GFP של הנגיף במדגם של התרבות.
  3. Centrifuge התליה תא למשך 40 דקות ב 11,520 x g ולאסוף את הוירוס P2 המכיל supernatant. לסנן את תגובת שיקוע באמצעות חד פעמיות-0.2 µm מסננים. להוסיף FBS ריכוז סופי של 0.5%.
    הערה: את המניה של P2 וירוס צריך להיות מאוחסן ב 4 ° C, להיות מוגן מפני אור.
  4. להשיג עם כייל נוגדנים לוירוס P2 באמצעות תאים Sf9easy או מונה וירוס.

5. זיהום של HEK293 בתרבית של תאים עם P2 Baculovirus ביטוי חלבונים בקנה מידה גדול

  1. להכין נפח רצוי של HEK293 בתרבית של תאים ההשעיה תרבות (4-6 L מומלץ להכנה של רשתות קפואים) ריכוז של 3.5-3.8 x 106 תאים למ"ל במדיום הביטוי (ראה טבלה של חומרים) בתוספת 1% (v / v) סטרילי FBS ב Erlenmeyer התחתונה התמלאה תרבות מבחנות בגודל הרצוי.
    הערה: לתרבות ההשעיה, המשמש אמצעי האחסון לא יעלה על 40% מהנפח הכולל של הבקבוק.
  2. הוסף 8% (v/v) של P2 וירוס פתרון מניות מהשלב 4.3 התרבות התליה תא HEK293. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ב שייקר מסלולית-135 סל ד.
  3. להוסיף butyrate נתרן 10 מ מ 12-18 שעות לאחר הפגיעה. תקופת דגירה של הזמן של ביטוי חלבון אופטימלי (בדרך כלל 36-72 h) ב- 30 ° C.
  4. קציר תאים על-ידי צריך שתוציאו בשביל 20 דקות ב 2,880 x g. רחץ תאים על-ידי resuspending בתוך כ 100 מ ל באגירה טריס תמיסת מלח (TBS) לליטר של תאים שנקטפו. צנטריפוגה שוב למשך 20 דקות ב 2,880 x g ולאסוף בגדר התא.
    הערה: הפרוטוקול עשוי להיות עצר כאן. תא כדורי יכול להיות snap-קפוא חנקן נוזלי ומאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס עד טיהור.
    התראה: חנקן נוזלי עלול לגרום כוויות הקפאה או פציעה. הוא עלול לגרום כוויות קור. זה אולי את מקומו של החמצן וגורמות מחנק מהירה. ללבוש כפפות בידוד קר ומגן הפנים.
  5. לאסוף יבול קטן 1 מ"ל בנקודות זמן שונות, solubilize עבור 2 h ב 4 ° C עם נדנדה או ערבוב בנוכחות דטרגנטים שונים ו/או תוספים. דוגמאות קטנות אלה כל-תא solubilized יכול להיות מובהר על ידי ultracentrifugation ב × 235,000 g 10 דקות ב 4 ° C ולהריץ כמדגם 30 μL על עמודה גודל-הדרה כרומטוגרפיה (שניות) (ראה טבלה של חומרים) כדי לקבוע את הזמן הטוב ביותר עבור ביטוי ולאחר את התנאים הטובים ביותר solubilization.
    הערה: במקרה של hTRPC3, הקרנת הסרט הזה כלול מאגרים שונים עם ערכי pH מ 4.0-9.5 ו ריכוזי מלח 50-500 מ מ; יצירות יוניים שונים (כגון MgCl2 או NaCl); דטרגנטים שונים בערכי ריכוז (CMC) מיצלה קריטי של 0.1 - 20 מ מ; הפחתת תוספים כגון dithiothreitol, tris(2-carboxyethyl) פוספין ו β-mercaptoethanol; ו הסידן chelating ethylenediaminetetraacetic תוסף חומצה (EDTA).

6. טיהור של חלבון hTRPC3 מ בגדר תא קפוא

  1. הפשרת בגדר במאגר המכיל 20 מ מ טריס (pH 8.0), 500 מ מ NaCl, 1 מ phenylmethylsulfonyl פלואוריד (PMSF), 0.8 μM aprotinin, 2 leupeptin μg/mL, 2 מ מ pepstatin A, וקצרו digitonin 1%, באמצעות 100 מ של מאגר לליטר של תאים. ברגע הקרת, ודא ההומוגניות של הפתרון על-ידי pipetting או ערבוב. מאפשרים solubilize עבור 2 h-4 מעלות צלזיוס ב גביע שקוע בתוך קרח עם בר מערבבים מסתובבים.
  2. להסיר את שאריות תאים על ידי ultracentrifugation ב × 235,000 g עבור h 1-4 מעלות צלזיוס. לאמת כמות החלבון על ידי הפעלת מדגם 30 μL על עמודת שניה (ראה טבלה של חומרים) על ידי ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) ותנסו לדמיין את חלבון המטרה, פלט אות ה-GFP.
  3. דגירה החלבון solubilized (supernatant) עם קובלט שרף אהדה עבור h 1-2-4 מעלות צלזיוס. ודא חלבון מחייב שרף על-ידי הפעלת מדגם μL 30 על עמודת שניה.
    הערה: אם אירעה חלבון מחייב, המטרה חלבון מתויג GFP יישמרו בעמודה, לא נמצא בקובץ הזרימה דרך. לכן, אין קליטה GFP יהיה נוכח במיקום המתאים לגודל חלבון המטרה כאשר הזרימה דרך תופעל ב- HPLC.
  4. לשטוף את השרף עם 10 כרכים עמודה של מאגר (20 מ מ טריס, pH 8.0, 500 מ מ NaCl, 15 מ מ imidazole ו 0.1% digitonin). בדוק אם אובדן חלבון על-ידי הפעלת מדגם μL 30 על עמודת שניה.
    הערה: אם אירעה אובדן חלבון מן העמודה, המטרה חלבון מתויג GFP יימצא במאגר שטיפת שחלפה על פני העמודה. לכן, אות ה-GFP יהיה נוכח במיקום המתאים לגודל חלבון המטרה כאשר המאגר שטיפת תופעל ב- hplc, קורס. אם אירעה אובדן חלבון, הריכוז imidazole של המאגר שטיפת ייתכן שתצטרך תפחת, כדי למנוע שיבוש שלו מחייב תג עמודת זיקה.
  5. Elute את hTRPC3 שרף מכורך עם מאגר (20 מ מ טריס, pH 8.0, 500 מ מ NaCl, 250 מ מ imidazole ו 0.1% digitonin). להוסיף תרומבין 20:1 יחס טוחנת (כדי לבקע את תג ה-GFP), להוסיף 10 מ מ EDTA (סוכן המייצב של hTRPC3) מדגם eluted, תקופת דגירה של h 3-4 מעלות צלזיוס. בדוק כי חלבון יש כבר eluted על ידי הפעלת μL 90 בטחונות מדגם מדולל על עמודת שניה ואימות הנוכחות של אות ה-GFP במיקום המתאים לגודל חלבון המטרה.
    הערה: בשלב זה, טריפטופן האיתות חלבון הכולל • תנאי ניתן גם להציג. רק חלבון מטוהרים זיקה היעד יישאר • תנאי את, את ה-GFP, טריפטופן אותות יהיה ליד זהה בפרופיל. אם החלבון היעד לא ראיתי כמות גדולה ב • תנאי אך לא אבד זרימה דרך או לשטוף, החלבון יש ככל הנראה נותרו מאוגד לעמודה, יכול להיות eluted באמצעות ריכוז גבוה יותר של imidazole במאגר.
  6. לרכז את eluate כדי 500 μL או פחות במסנן צנטריפוגלי 15 mL 100K צינור (ראה טבלה של חומרים) על ידי ספינינג ב 2,880 x g ב 4 ° C במרווחים של 5 דקות. Resuspend החלבון על ידי pipetting הפתרון מעלה ומטה בין מהדורות כדי להימנע overconcentrating.
    הערה: זמן צנטריפוגה עשויים להתקצר האחסון מתקרב האחסון הסופי הרצוי.
  7. לטעון את התרכז על גבי עמודת שניה במאגר (20 מ מ טריס, pH 8.0, 500 מ מ NaCl, EDTA 1 מ"מ ו 0.1% digitonin). הפעל.
  8. לשלב שברים שיא המכיל את tetramer TRPC3 ללא פגע, כמו על ידי אות ספיגת UV, ולרכז שוב כדי ריכוז סופי לפחות 5 מ"ג/מ"ל.

7. ההקרנה של חלבונים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים שלילית-כתם

  1. הפעל את המכונה זוהר-פריקה. הגדר התוכנית עבור מתרוקנת רשת מצופה פחמן באמצעות ארגון וחמצן לריצה ס' 30 את תוכנית כדי להפוך את הפחמן-הציפוי על רשתות 400-רשת נחושת הידרופילית לפני תוספת של הפתרון חלבון.
  2. הגדרת μL 40 חמש טיפות של מים סטריליים, μL 40 שתי טיפות של 1% uranyl formate פתרון (מעבדה סרט, נייר שעווה או משטח דומה, ראה טבלה של חומרים). . קח את הרשת מהשלב 7.1 ו להוסיף 2.5 μL של חלבון לטעום 5 מ"ג/מ"ל (50-200 μM) אל הצד האפל ולתת לו לשבת במשך 1 דקה.
  3. לאחר 1 דקות, לייבש את רשת נייר סינון. . אל תיגע נייר הסינון ישירות אל פני השטח רשת; במקום זאת, תביא את העיתון על הקצה של ה-droplet נוזלי ולאפשר נימיות למשוך את הנוזל מן הרשת לתוך נייר הסינון.
  4. טבלו את הרשת הראשון בטיפת מים. יבש עם נייר סינון וחזור עם טיפות המים שנותרו, הטיפה הראשונה של uranyl formate. לאפשר הירידה השנייה uranyl לשבת formate עבור 1 דקות, ואז לייבש עם נייר סינון. לאפשר הרשת כדי מלא אוויר יבש (בערך 1 דקות) לפני אחסון.
    הערה: ייתכן פרוטוקול מכתימים זה לא תהיה אידיאלית עבור כל שילובי אבקת חלבון. ריכוזים שונים של uranyl formate כתם, באורכים שונים של זמן חשיפה הכתם צריך להיבדק אם השלבים שלעיל אינם מספקים כתם עם קונטרסט טוב.
  5. תמונה של הרשתות-מיקרוסקופ אלקטרוני (ראה טבלה של חומרים) כדי לבדוק את איכות חלקיק של חלבון. להבטיח כי micrographs להראות חלקיקים רבים כי הם הומוגנית המראה הכללי והפצה, הצג קונטרסט טוב ולאחר תואם לגודל החזוי של החלבון היעד.
  6. צור ראשוני, סיווגים (2D) ברזולוציה נמוכה, מימדי באמצעות micrographs 50-100 (ראה עיבוד נתונים – שלב 10) כדי לבדוק את החלקיקים מייצגים תצוגות שונות של מבנה עקבי יחיד.
    הערה: Micrographs ושיעורי ראשוני 2D באיכות מספיק, כפי שתואר לעיל, הן סימן חזק כי הפרוטוקול מוטבה מספיק לטיהור חלבון. הכנה והקרנת רשתות הקפאה-EM היא מוצדקת בשלב זה.

8. הכנת הדוגמא EM

  1. זוהר-פריקה רשת זהב פחמן חור (ראה טבלה של חומרים) כפי שמתואר בשלב 7.1.
  2. החל μL 2.5 המדגם חלבון מרוכז hTRPC3 (5 מ"ג/מ"ל) על גבי הרשת. כתם ברשת עבור 1.5 s באמצעות אבן חשופה כוח של 1 וזמן המתנה של 5 s ב 100% לחות ו- 4 ° C, ואז מזנקת הרשת אל אתאן נוזל מקורר על ידי חנקן נוזלי, בעזרת מכונה ויטריפיקציה.
    הערה: לחות, טמפרטורה, כתם-כוח, חשופה, וזמן רגע המפורטים כאן שימשו הלימודים מחברי hTRPC319. עליהם להיות שונה כדי לייצר קרח בזגוגית מיטביים אחרים חלבונים וחומרי ניקוי.
  3. מסך קפוא רשתות תנאים אופטימליים קרח באמצעות מיקרוסקופ הקפאה-EM (ראה טבלה של חומרים) באופן ידני תצוגת אזורים של קרח עבה (רשת ריבועים המופיעים קטן וכהה), דק קרח (ריבועים רשת המופיעים גדול יותר ובהיר יותר), בינוני קרח .
    הערה: קרח עבה מחזיקה יותר חלקיקים, לעיתים קרובות בזמן דק מניב לעתים קרובות ניגודיות טובה יותר ורזולוציה. הקרנת תמונות כדי לקבוע אשר קרח ידני שימוש תנאים תוצאות במספר רב של חלקיקים monodispersed עם קונטרסט טוב והרזולוציה. ברגע תנאים טובים מאומתים, להעביר אוסף תמונות במיקרוסקופ הקפאה-EM kV 300.

9. איסוף נתונים EM

  1. באמצעות תוכנית רכישה אוטומטית, להקליט אוספי תמונות במצב סופר סופר רזולוציה עם גודל פיקסל נשברתי של 1.074 Å במיקרוסקופ אלקטרוני המופעל 300 kV עם ההגדלה הנומינלי של 130,000 X לכוון גלאי אלקטרונים.
  2. מינון-fractionate כל תמונה למסגרות 40 עם זמן החשיפה הכולל של 8 s, עם 0.2 s לכל מסגרת שיעור במינון של 6.76 e− Å−2 s− 1 (ערכים defocus בשכבות הנומינלי מגוונות מ 1.0 ל 2.5 μm בניסוי של המחברים).

10. עיבוד נתונים EM

  1. ליישם תנועה תיקון של מסוכם סרט ערימות22 ולהעריך defocus בשכבות ערכים23 שימוש בתוכנת עיבוד נתונים (ראה טבלה של חומרים)24.
  2. לאסוף חלקיקי micrographs. להשתמש אלה בחרה חלקיקים כדי לבנות של סיווג 2D ללא הפניה הראשונית באמצעות תוכנה24. בחר מחלקה 2D אידיאלי הממוצע להשתמש כתבניות עבור איסוף חלקיקים אוטומטיות עבור ערכת הנתונים כולה.
  3. באופן ידני לבדוק את טיב החלקיקים נבחר אוטומטית והסרה של חלקיקים רע. השתמש במספר סבבים של סיווג 2D לנקות את חלקיקי שנאספו.
  4. ליצור מודל ראשוני של25. 2D נושא שבחרו חלקיקים סיווג תלת מימדי (3D) (כ-5 כיתות) באמצעות סימטריה C1 ומסנן נמוך לעבור שחזור ראשוני של 60 Å בתור מודל התייחסות. לקבוע אילו שיעורים יש תכונות ברזולוציה גבוהה ולשלב חלקיקים בתוך מחלקה כזו.
  5. להוסיף ולמקד חלקיקים באמצעות עידון מקומי עם סימטריה C4 (במקרה hTRPC3) חלה והגדר מגבלה ברזולוציה גבוהה של חלקיקים ליישור 4.5 Å26.

11. דגם בניין

  1. לבנות מודל (ראה טבלה של חומרים עבור התוכנה ששימשה). עבור hTRPC3, להשתמש בתחום transmembrane (TMD) של melastatin פוטנציאלי קולטן ארעי 4 (TRPM4) מבנה החלבון בנק מידע (PDB) 5wp6 כמו מדריך27. השתמש שאריות מגושם, חיזוי מבנה שניוני להנחות דה נובו הבניין.
  2. נושא הדגם הראשוני עידון מרחב אמיתי עם מבנה שניוני ריסון28. באופן ידני לבחון את המודל מעודן, remodify כנדרש (ראה טבלה של חומרים עבור התוכנה ששימשה).
  3. החל פורייה מעטפת קורלציה (FSC) עקומות כדי לחשב את ההפרש בין המודל הסופי במפה EM עבור אימות של מבנה מעודן. להעריך את גיאומטריות הדגמים אטומית (ראה טבלה של חומרים עבור התוכנה ששימשה)29,30.

תוצאות

סקירה סכמטי של הפרוטוקול עבור הביטוי ולטיהור hTRPC3 מוצג איור 1A. תמונה של hTRPC3 bacmid לצלחת עם מושבות לבן אידיאלי, הדומה זה שנבחר עבור טיהור DNA bacmid, מוצג איור 1B. . מצאנו שאת 48 שעות הוא אידיאלי עבור Bluo-גל ברור מכתים תוך שמירה על הנוכחות של מושבות המבו?...

Discussion

קביעת מבנה של חלבונים על ידי הקפאה-EM יש מהפכה בתחום ביולוגיה מבנית בשנים האחרונות, בזכות הפיתוח של מצלמות חדשות ואלגוריתמים המזרזת באופן משמעותי את קביעת מבנה של חלבונים שאינם ברצון crystalize, במיוחד קרום חלבונים. למרות כל התפתחויות אחרונות טכניקת הקפאה-EM, הכנת מספקות איכות וכמות מטוהרים חלב?...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים ג'י זאו, אקס מנג לתמיכה באיסוף נתונים ב דוד ואן אנדל מתקדם הקפאה-אלקטרון מיקרוסקופ Suite. אנו מעריכים את הקבוצה VARI מחשוב עם ביצועים גבוהים עבור תמיכה חישובית. אנחנו נותנים את הכרת התודה שלנו כדי ש קלמנטה, דמי ד, ג' Floramo, הואנג י', י' קים, מולר ג, רוט נולד ב ו צ Ruan עבור הערות השתפרה מאוד כתב היד הזה. אנו מודים Nadziejka ד על העריכה תמיכה כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי VARI פנימי מימון.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
pEG BacMam vector (pFastBacI)addgene31488
DH10α cellsLife Technologies10361-012
S.O.C. mediaCorning46003CRfor transformation of DH10α cells for Bacmid
Bacmam culture platesTeknovaL5919for culture of transformed DH10α cells
Incubation shaker for bacterial cellsInfors HTMultitron standard
Incubated orbital shaker for insect cellsThermo-FisherSHKE8000
Reach-in CO2 incubator for mammalian cellsThermo-Fisher3951
Table-top orbital shakerThermo-FisherSHKE416HPused in Reach-in CO2 incubator for mammalian cells
IncubatorVWR1535for bacterial plates
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106for plasmid extraction and purification
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcoholInvitrogen15593031for DNA extraction
Sf9 cellsLife Technologies12659017insect cells for producing virus
Sf-900 mediaGibco12658-027insect cell media
FBSAtlanta BiologicalsS11550
Cellfectin IIGibco10362100for transfecting insect cells
lipofectamine 2000Invitrogen11668-027for transfecting mamalian cells
0.2 mm syringe filterVWR28145-501for filtering P1 virus
0.2 mm filter flasks 500ml resevoirCorning430758for filtering P2 virus
erlenmeyer culture flask (flat bottom 2L)Gene MateF-5909-2000for culturing insect cells
erlenmeyer culture flask (baffled 2L)Gene MateF-5909-2000Bfor culturing mammalian cells
nanodrop 2000 spectrophotometerThermo-FisherND-2000for determining DNA and protein concentrations
HEK293ATCCCRL-3022mammalian cells for producing protein
Freestyle 293 expression MediumGibco1238-018mammalian cell media for protein expression
Butyric Acid Sodium SaltAcros263195000to amplify protein expression
PMSFAcros215740500protease inhibitor
Aprotinin from bovine lungSigma-AldrichA1153-100MGprotease inhibitor
Leupeptin hydrochlorideSigma-Aldrich24125-16-4protease inhibitor
pepstatin AFisher ScientificBP2671-250protease inhibitor
digitoninEMD Millipore300410detergent - to solubilize protein from membrane
imidazoleSigma792527to elute protein from resin column
TALON resinClonetech635504for affinity purification by His-tag
superose6 incease columnsGE29091596; 29091597for HPLC and FPLC
Prominence Modular HPLC SystemShimadzuSee Below
Controller Module"CBM20A
Solvent Delivery System"LC30AD
Fluorescence Detector"RF20AXS
Autosampler with Cooling"SIL20ACHT
Pure FPLC System with FractionatorAkta
thrombin (alpha)Haematologic Technologies IncorporatedHCT-0020 Human alphafor cleaving GFP tag
Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugal filter tubeMilliporeUFC910008for concentrating protein
EDTAFisherE478500for stabilizing protein
400 mesh carbon-coated copper gridsTed Pella Inc.01754-Fgrids for negative stain
Quantifoil holey carbon grid (gold, 1.2/1.3 μm size/hole space, 300 mesh)Electron Microscopy SciencesQ3100AR1.3grids for Cryo-EM
Vitrobot Mark IIIFEIfor preparing sample grids by liquid ethane freezing
liquid nitrogenDura-CylUN1977
ethane gasAirgasUN1035
Solarus Plasma SystemGatanModel 950for cleaning grids before sample freezing
Tecnai Spirit electron microscopeFEIfor negative stain EM imaging
Talos Arctica electron microsocopeFEIfor screening and low resolution imaging of Cryo-EM grids
Titan Krios electron microscopeFEIfor high-resolution Cryo-EM imaging
Software
Gautomatch softwarehttp://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/to pick particles from micrographs
Relion 2.1 softwarehttps://github.com/3dem/relionto construct 2D and 3D classification
CryoSPARC softwarehttps://cryosparc.com/to generate an initial structure model
Frealign softwarehttp://grigoriefflab.janelia.org/frealignto refine particles
Coot softwarehttps://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/to build a model
MolProbity softwarehttp://molprobity.biochem.duke.edu/to evaluate the geometries of the atomic model
SerialEM softwarehttp://bio3d.colorado.edu/SerialEM/for automated serial image stack acquisition
MortionCor2 softwarehttp://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.htmlfor motion correction of summed movie stacks
GCTF softwarehttps://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/for measuring defocus values in movie stacks
Phenix.real_space_refine softwarehttps://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.htmlfor real space refinement of the initial 3D model

References

  1. Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
  2. Kumar, R., Thompson, J. R. The regulation of parathyroid hormone secretion and synthesis. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (2), 216-224 (2011).
  3. Sudhof, T. C. Calcium control of neurotransmitter release. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (1), a011353 (2012).
  4. Ong, H. L., de Souza, L. B., Ambudkar, I. S. Role of TRPC Channels in Store-Operated Calcium Entry. Advances in Experimental Medicine and Biology. 898, 87-109 (2016).
  5. Smyth, J. T., et al. Activation and regulation of store-operated calcium entry. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (10), 2337-2349 (2010).
  6. Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiological Reviews. 95 (4), 1383-1436 (2015).
  7. Liu, X., Singh, B. B., Ambudkar, I. S. TRPC1 is required for functional store-operated Ca2+ channels. Role of acidic amino acid residues in the S5-S6 region. Journal of Biological Chemistry. 278 (13), 11337-11343 (2003).
  8. Zhu, X., Jiang, M., Birnbaumer, L. Receptor-activated Ca2+ influx via human Trp3 stably expressed in human embryonic kidney (HEK)293 cells. Evidence for a non-capacitative Ca2+ entry. Journal of Biological Chemistry. 273 (1), 133-142 (1998).
  9. Zhu, X., et al. trp, a novel mammalian gene family essential for agonist-activated capacitative Ca2+ entry. Cell. 85 (5), 661-671 (1996).
  10. Itsuki, K., et al. Voltage-sensing phosphatase reveals temporal regulation of TRPC3/C6/C7 channels by membrane phosphoinositides. Channels (Austin). 6 (3), 206-209 (2012).
  11. Tang, J., et al. Identification of common binding sites for calmodulin and inositol 1,4,5-trisphosphate receptors on the carboxyl termini of trp channels. Journal of Biological Chemistry. 276 (24), 21303-21310 (2001).
  12. Gonzalez-Cobos, J. C., Trebak, M. TRPC channels in smooth muscle cells. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 15, 1023-1039 (2010).
  13. Li, H. S., Xu, X. Z., Montell, C. Activation of a TRPC3-dependent cation current through the neurotrophin BDNF). Neuron. 24 (1), 261-273 (1999).
  14. Becker, E. B., et al. Candidate screening of the TRPC3 gene in cerebellar ataxia. Cerebellum. 10 (2), 296-299 (2011).
  15. Kitajima, N., et al. TRPC3 positively regulates reactive oxygen species driving maladaptive cardiac remodeling. Scientific Reports. 6, 37001 (2016).
  16. Yang, S. L., Cao, Q., Zhou, K. C., Feng, Y. J., Wang, Y. Z. Transient receptor potential channel C3 contributes to the progression of human ovarian cancer. Oncogene. 28 (10), 1320-1328 (2009).
  17. Oda, K., et al. Transient receptor potential cation 3 channel regulates melanoma proliferation and migration. Journal of Physiological Sciences. 67 (4), 497-505 (2017).
  18. Xia, M., Liu, D., Yao, C. TRPC3: A New Target for Therapeutic Strategies in Chronic Pain-DAG-mediated Activation of Non-selective Cation Currents and Chronic Pain (Mol Pain 2014;10:43). Journal of Neurogastroenterology and Motility. 21 (3), 445-447 (2015).
  19. Fan, C., Choi, W., Sun, W., Du, J., Lu, W. Structure of the human lipid-gated cation channel TRPC3. Elife. 7, e36852 (2018).
  20. Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
  21. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay to identify membrane protein expression and crystallization conditions. Structure (London, England: 1993). 20 (8), 1293-1299 (2012).
  22. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  23. Zhang, K. Gctf: Real-time CTF determination and correction. Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).
  24. Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  25. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  26. Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
  27. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  28. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
  29. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).
  30. Scheres, S. H. W., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature Methods. 9 (9), 853-854 (2012).
  31. Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  32. Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
  33. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 12-21 (2010).
  34. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).
  35. Green, E. M., Au, Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. Journal of Visualized Experiments. (117), e54792 (2016).
  36. Mesa, P., Deniaud, A., Montoya, G., Schaffitzel, C. Directly from the source: endogenous preparations of molecular machines. Current Opinion in Structural Biology. 23 (3), 319-325 (2013).
  37. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane Protein Assembly into Nanodiscs. FEBS letters. 584 (9), 1721-1727 (2010).
  38. Winkler, P. A., Huang, Y., Sun, W., Du, J., Lü, W. Electron cryo-microscopy structure of a human TRPM4 channel. Nature. 552, 200-204 (2017).
  39. Autzen, H. E., et al. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science. 359 (6372), 228-232 (2017).
  40. Guo, J., et al. Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4. Nature. 552 (7684), 205-209 (2017).
  41. Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1860 (2), 378-383 (2018).
  42. Gulati, S., et al. Detergent-free purification of ABC (ATP-binding-cassette) transporters. Biochemical Journal. 461 (2), 269-278 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143EMbaculovirus

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved