저자
연락처

로그인

JoVE 비디오를 활용하시려면 도서관을 통한 기관 구독이 필요합니다. 전체 비디오를 보시려면 로그인하거나 무료 트라이얼을 시작하세요.

기사 소개

  • 요약
  • 초록
  • 서문
  • 프로토콜
  • 결과
  • 토론
  • 공개
  • 감사의 말
  • 자료
  • 참고문헌
  • 재인쇄 및 허가

요약

이 프로토콜 cryo 전자 현미경 검사 법, 효율적으로 최소한의 노력 및 독성, 단백질 추출, 정화, 포유류 세포에 있는 유전자를 표현 하는 데 사용 되는 잠재 시스템을 포함 하 여 이온 채널 구조를 결정 하는 데 사용 하는 기법을 설명 합니다. 그리고 품질 검사, 샘플 그리드 준비 및 심사, 뿐만 아니라 데이터 수집 및 처리.

초록

정식 TRP subfamily의 일시적인 수용 체 잠재력 채널 (TRPCs)은 비선택적 양이온 채널 칼슘 항상성 기능을 유지 하기 위해 중요 한 특히 저장소 운영 칼슘 항목에서에서 필수적인 역할을 시 냅 시스 소포 방출 하 고 세포내 신호 통로입니다. 따라서, TRPC 채널 다양 한 심장 비 대 등 심장 혈관 질환, 파 킨 슨 병 같은 신경 퇴행 성 질환, 척 증과 같은 신경학 적 장애 등 인간의 질병에에서 연루 되었습니다. 따라서, TRPC 채널 인간의 질병에 잠재적인 pharmacologic 대상을 나타냅니다. 그러나,이 채널에서 게이팅의 분자 메커니즘 여전히 명확 하지 않다. 균질, 안정적이 고 순화 된 단백질의 대량 취득에 어려움 특히 TRPC 이온 채널 등 포유류 막 단백질에 대 한 구조 결정 연구에 제한 요인이 되었습니다. 여기, 선물이 포유류 이온 채널 막 단백질 선호도 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 수정 된 잠재 유전자 전달 시스템 및 이러한 단백질의 정화를 사용 하 여 대규모 표현 위한 프로토콜. 선물이 더 순화 된 단백질에서 단일 입자 cryo 전자 현미경 이미지를 수집 하 고 이러한 이미지를 사용 하 여 단백질 구조를 결정 하는 프로토콜. 구조 결정 게이팅 및 기능 이온 채널의 메커니즘을 이해 하는 강력한 방법입니다.

서문

칼슘 신호 폭포, 녹음 제어, 신경 전달 물질 방출, 및 호르몬 분자 합성1,2,3등 가장 세포질 과정에서 포함 된다. 무료 cytosolic 칼슘의 항상성 유지 건강 및 세포의 기능에 결정적 이다. 세포내 칼슘 항상성의 주요 메커니즘 중 하나는 칼슘 저장소 운영 항목 (SOCE)는 칼슘의 소모에에서 저장 된 바인딩과 그물 (응급실) 트리거 이온 채널 개방 촉진 하기 위하여 플라즈마 멤브레인에 프로세스는 4,,56더 신호에 사용할 수 있는 ER 칼슘 보충 TRP superfamily 속하는 칼슘 침투성 채널은 일시적인 수용 체 잠재력 채널 (TRPCs), SOCE7,,89 에 주요 참여자로 확인 되었습니다.

TRPC 가족에서 7 멤버 중 TRPC3, TRPC6, 및 TRPC7 homologue 하위 그룹을 형성 하 고 지질 보조 메신저 diacylglycerol (DAG)의 신호 지질 저하 제품에 의해 활성화 될 수 있는 고유 phosphatidylinositol 4, 5 bisphosphate (PIP2)10,11. TRPC3은 매우 부드러운 근육에 영향 neurotransmission 및 성체12,13칼슘 신호에서 필수적인 역할을 재생 하는 두뇌의 대뇌와 소 뇌 영역에 표시 됩니다. TRPC3의 부전 중앙 신 경계 질환, 심혈 관 질환 및 난소 선 암14,,1516등 특정 암에 연결 되었습니다. 따라서, TRPC3는 이러한 질병의 치료에 대 한 제약 대상으로 약속을 보유 하고있다. TRPC3에 특별히 대상된 약물의 개발 등 지질 바인딩 사이트17,18, 분자 활성화 메커니즘의 이해의 부족에 의해 제한 되었습니다. 우리 보고 인간 TRPC3 채널 (hTRPC3)와 닫힌된 상태에 그것의 2 개의 지질 바인딩 사이트의 첫 번째 원자 해결책 구조19이러한 메커니즘 대 한 중요 한 통찰력을 제공.

높은 해상도에서 막 단백질의 구조를 결정 하기 위한 핵심 요소는 높은 품질의 단백질을 얻을 것입니다. 표현과 정화 조건 고품질 단백질을 얻기 위해 필요한의 해당 검사는 시간과 비용이 많이 드는 노력 될 수 있습니다. 여기 우리는 어떻게 우리가 식별 표현과 hTRPC3, 우리의 초기 심사에서 가난 하 게 행동의 정화에 대 한 최적의 조건을 자세히 설명 하는 프로토콜을 제시. 우리는 해결 하 고 누워 우리의 cryo 전자에 대 한 견고한 기초 현미경 (cryo-EM) 연구 하는 단백질 동작을 최적화 하는 방법에 몇 가지 핵심 포인트를 제시. 수정된 baculoviral 생성 하는 벡터 (pEG), Gouaux와 동료에 의해 개발 된 심사 분석 및 포유류 세포20에 잠재의 효율적인 생성에 대 한 최적화를 사용 합니다. 이 식은 메서드는 포유류 세포 막에 있는 단백질의 신속 하 고 비용 효율적인 overexpression에 적합 합니다. 우리는의 사용이 형광 검출 크기-배제 크로마토그래피 기반이 벡터 (FSEC) 방법21prescreening를 결합 한다. 이 메서드와 관심의 구조를 융합 하는 녹색 형광 단백질 (GFP) 태그를 사용 하 여 작은, 전체 셀 solubilized 샘플에서 대상 단백질의 시각화를 향상 시킵니다. 이 다른 세제 및 첨가물, thermostabilizing 돌연변이와 단백질 안정성의 심사 가능 하며 소규모 과도 transfection에서 세포의 작은 숫자의 사용을 허용 한다. 이 방법에서는, 다양 한 조건 수 빠르게 상영 대규모 단백질 정화로 이동 하기 전에. 다음 식, 심사, 그리고 정화, 선물이 및 곳을 알아내는-EM 생성 단백질의 de novo 구조 결심 하에서 이미지를 처리 하는 프로토콜. 우리는 여기에 설명 된 방법을 일반화할 프로토콜 TRP 채널 수용 체와 다른 막 단백질의 구조 연구로 될 것입니다 믿습니다.

프로토콜

1. DH10α Bacmid DNA를 생산 하기 위해 유능한 세포의 변화

  1. 관심사의 유전자를 합성 하 고 N terminus (pFastBacI)20에서 트 롬 빈 분열 사이트와 트윈 strep 태그, His8-태그 및 GFP를 포함 하는 말뚝 벡터의 수정된 된 버전으로 그것을 subclone.
  2. 5 추가 하 여 유능한 세포를 변형 세포 1.5 ml에서 튜브와 얼음에 10 분 동안 품 어 DH10α의 50 μ에 pFastBacI에 원하는 유전자를 포함 하는 플라스 미드의 ng. 열 충격 45 셀 42 ° c.에 s 튜브에 catabolic 진압 (SOC) 매체와 슈퍼 최적의 국물의 200 μ를 추가 하 고 4-8 h 225 rpm에서 궤도 셰이 커에서 37 ° C에서 품 어.
  3. 플레이트 bacmid 파운드 한 천 배지 (50 μ g/mL 대, 7 μ g/mL gentamicin, 10 μ g/mL 항생물질, 100 μ g/mL Bluo-여자, 및 40 μ g/mL 이소프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside [IPTG], 한 천)에 있는 셀의 5 μ.
  4. 37 ° c.에서 48 h에 대 한 접시를 품 어
    참고: 여전히 lacZ (벡터 삽입 실패), 표현 하는 Bluo-여자 표시기 얼룩 식민지 흰색 (성공적으로 변환된) 식민지의 선택에 대 한 허용.
  5. 신중 하 게 블루 식민지, 접촉 하 고 bacmid 파운드 매체 (50 μ g/mL 대, 7 μ g/mL gentamicin, 10 μ g/mL 항생물질) 225 rpm에서 궤도 셰이 커에서 37 ° C에서의 6 mL에서 하룻밤 세포 성장 어떤 백색 식민지를 피하고 고립 된 백색 식민지를 선택 합니다.

2. 세균 대비 Bacmid DNA의 분리

  1. Bacmid DNA를 분리, 2880 x g에서 10 분 동안 대장균 세포 아래로 회전 합니다.
  2. Resuspend는 miniprep에서 셀 물의 resuspension 솔루션의 200 µ L에서 펠 릿 하 고 상쾌한 키트 ( 재료의 표참조) pipetting으로 삭제 합니다. 펠 릿은 완전히 그리고 homogenously 일시 중단 해야 합니다. 그런 다음, 1.5 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 전송.
  3. 몇 번 튜브를 거꾸로 하 여 miniprep 키트 및 혼합에서 세포 세포의 용 해 솔루션의 200 µ L를 추가 합니다. 최대 5 분 실 온 (RT) 세포를 lyse에서 품 어. 중화 솔루션의 200 µ L에서 추가 miniprep 키트 및 혼합 몇 번 튜브를 거꾸로 하 여 세포 반응을 중지 하.
  4. 탁상 원심 분리기에서 21,130 x g 에서 10 분 동안 아래로 회전 합니다. 2 mL 튜브에 상쾌한의 600 μ를 수집 합니다. 600 μ 페 놀: 클로 프롬: isoamyl 알콜 해결책을 추가 하십시오 ( 재료의 표참조) 및 혼합 철저 하 게 세포 세포의 용 해 제품의 나머지에서 DNA를 추출.
    주의: 페 놀: 클로 프롬: isoamyl 알콜 해결책은 흡입, 피부 접촉에 의해 독성을 삼 킨 경우. 그것은 화학 화상을 일으킬 수 있습니다. 있으며 발암 성 수 있습니다. 착용 장갑 및 buttoned 연구실 코트. 증기 두건에서 작동 합니다. 이 유해 폐기물의 적절 하 게 처분.
  5. 탁상 원심 분리기에서 21130 x g 에서 10 분 동안 튜브를 회전 합니다. 액체 단계에 표시 됩니다. 신중 하 게 새로운 튜브를 위 수성 단계의 300 μ를 전송 합니다. DNA를 씻어 100% 에탄올의 600 μ를 추가 합니다. 부드럽게 혼합 튜브 반전.
    참고:이 bacmid DNA 전단 수로 소용돌이 하지 마십시오.
  6. 10 분-20 ° C 냉장고에 배치 하 여 멋진 튜브 탁상 원심 분리기에서 21,130 x g 에서 10 분 동안 아래로 회전 합니다. 삭제는 상쾌한 고 DNA 펠 릿을 보존 한다.
  7. 펠 릿을 세척을 70% 에탄올의 1 mL를 추가 합니다. 부드럽게 혼합 튜브 반전. 탁상용 원심 분리기에서 21,130 x g 에서 10 분에 대 한 스핀. 삭제는 상쾌한 고 아무 액체 튜브에서 볼 수 있으며 DNA 펠 릿 반투명 됩니다 때까지 약 5 분 또는 건조 공기에 펠 릿을 허용.
  8. 살 균, DNase 무료 50 µ L에서 건조 펠 릿 resuspend, 저온. DNA 농도 측정 합니다.
    참고: bacmid DNA를 고정 하지 마십시오. 몇 일까지 4 ° C에서 저장 합니다.

3. P1 잠재 생산 하는 Bacmid와 Sf9 곤충 세포의 transfection

  1. 시드 0.9 x 106 Sf9 셀/잘 적절 한 매체의 2 ml에서 ( 재료의 표참조)에 6 잘 조직 배양 플레이트의 각 잘. 셀 20 분 접시에 부착 홍보 27 ° C에서 품 어.
    주의: 세포 배양은 잠재적인 생물. 무 균 기술을 사용 하 여 승인 된 층 류 두건 및 권장된 보호 의류와 실험을 수행 하기 전에 폐기물의 적절 한 처리에 대 한 기관 및 정부 지침을 확인 합니다.
  2. 첨부 파일, 후 8 µ L transfection 시 약의 추가 ( 재료의 표참조)는 6의 각 음에 대 한 미디어의 100 µ L을 무 균 튜브에 페 되 고 접시 잘. 별도 무 균 튜브에 매체의 100 µ L를 bacmid DNA의 6 μ g를 추가 합니다. 실시간 결합 두 솔루션에서 5 분을 품 어 및 실시간에 45 분 동안 품 어
  3. 6 우물에서 매체를 2 mL 신선한 매체의 바꿉니다. 혼합 추가 이전 단계에서 각각 잘 dropwise (잘 당 200 µ L). 부드럽게 transfection 솔루션의 매체에 혼합 되도록 접시 바위.
    참고: 소용돌이 하거나 분리 하려면 셀이 때문에 접시를 흔들 없습니다.
  4. 27 ° C 습도 인큐베이터에서 5 d (120 h)에 대 한 셀을 품 어. 그 바이러스는 세포;의 큰 비율에 생산 되는 확인 하려면 수확 전에 GFP 형광을 확인 비율이 낮은 경우에, 필요에 따라 보육 시간을 연장 ( 그림 1C참조).
  5. 표면에 뜨는 포함 P1 바이러스 (각 우물에서 약 2 mL)를 수집 합니다. P1 바이러스 3 mL 주사기와 작은 0.2 µ m 필터를 사용 하 여 2 mL 튜브에 들어 있는 매체를 필터링 합니다. 1%의 최종 농도에 메 마른 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)를 추가 합니다.
    참고: P1 바이러스의이 주식 4 ° C에서 저장 되어야 하 고 빛 으로부터 보호.

4. P2 잠재 생산 P1 잠재 된 Sf9 곤충 세포의 감염

  1. 200 mL (또는 원하는 볼륨) 0.8의 농도에서 Sf9 셀의-적절 한 매체에서 106 셀/mL x 0.9 준비 ( 재료의 표참조)에 충분 한 크기의 평면 하단 삼각 문화 플라스 크.
    참고: 서 스 펜 션 문화에 대 한 사용 하는 볼륨 넘지 말아야 한다 40% 총 용량의 플라스 크의.
  2. Sf9 셀 서 스 펜 션 문화를 3.5에서 P1 바이러스 주식의 1: 2500 비율 (v/v)를 추가 합니다. 최적의 바이러스 식 (단백질 구조에 따라 보통 48-120 h)의 시간에 대 한 115 rpm에서 궤도 셰이 커에 27 ° C에서 품 어.
    참고: 상대 바이러스 식 문화권의 샘플에서 바이러스의 GFP 형광을 확인 하 여 확인할 수 있습니다.
  3. 11,520 x g 에서 40 분 동안 세포 현 탁 액을 원심을 표면에 뜨는 포함 P2 바이러스를 수집 합니다. 상쾌한 일회용 0.2 µ m 필터를 사용 하 여 필터링 합니다. 0.5%의 최종 농도에 FBS를 추가 합니다.
    참고: P2 바이러스의이 주식 4 ° C에서 저장 되어야 하 고 빛 으로부터 보호.
  4. Sf9easy 셀 또는 바이러스 카운터를 사용 하 여 P2 바이러스 titer를 가져옵니다.

5. 대규모 단백질 표정에 대 한 P2 잠재 HEK293 포유류 세포의 감염

  1. HEK293 포유류 세포 현 탁 액 문화 (4-6 L 냉동된 격자의 준비에 대 한 권장) 3.5-3.8 x의 농도에서 바람직한 볼륨 준비 106 셀/mL 식 중간에 1%와 보충 ( 재료의 표참조) (v / v) 살 균 FBS 당황 하단 삼각에 충분 한 크기의 플라스 크 문화.
    참고: 서 스 펜 션 문화에 대 한 사용 하는 볼륨 넘지 말아야 한다 플라스 크의 총 볼륨의 40%.
  2. HEK293 세포 현 탁 액 문화 단계 4.3에서에서 P2 바이러스 재고 솔루션의 8% (v/v)를 추가 합니다. 135 rpm에서 궤도 셰이 커에서 37 ° C에서 품 어.
  3. 감염 된 후 12-18 h에 10mm 나트륨 낙 산 염을 추가 합니다. 최적의 단백질 식 (보통 36 ~ 72 h) 30 ° c.의 동안 품 어
  4. 2880 x g에서 20 분 동안 centrifuging 여 세포를 수확. 약 100 mL tris 버퍼 염 분 (TBS) 수확 하는 셀의 리터 당에 resuspending에 의해 세포를 씻어. 2880 x g 에서 20 분 동안 다시 원심 고 셀 펠 릿을 수집 합니다.
    참고: 프로토콜 수 있습니다 수 일시 중지 여기. 셀 펠 릿 스냅-액체 질소에서 냉동 고 정화까지-80 ° C에서 저장 될 수 있습니다.
    주의: 액체 질소는 저온 화상 이나 상해를 일으킬 수 있습니다. 그것은 동상을 발생할 수 있습니다. 그것은 산소를 치환 하 고 급속 한 질을 일으킬 수 있습니다. 차가운 보 온 장갑과 얼굴 방패를 착용.
  5. 다양 한 시간 지점에서 작은 1 mL 수확을 수집 하 고 락 또는 다른 세제 및 첨가물의 교 반 4 ° C에서 2 h solubilize. 이러한 작은 전체 셀 solubilized 샘플 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 열에 30 μ 견본으로 4 ° C와 실행에서 10 분 동안 235000 × g 에서 ultracentrifugation에 의해 명확히 ( 재료의 표참조)에 대 한 최고의 시간을 결정 하 식 하 고 최고의 가용 화 조건입니다.
    참고: hTRPC3, 경우이 검사 포함 4.0-9.5와 50-500 m m;의 소금 농도 pH 값을 가진 다른 버퍼 다른 이온 구성 (예: MgCl2 또는 NaCl); 다른 세제 임계 micelle 농도 (CMC) 값은 0.1-20 m m; dithiothreitol, 등 첨가물을 줄이는 tris(2-carboxyethyl) phosphine, 및 β-mercaptoethanol; 칼슘-킬레이트 화와 첨가제 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA).

6. 냉동 셀 펠 릿에서 hTRPC3 단백질의 정화

  1. 500 mM NaCl, 1 m m phenylmethylsulfonyl 불 (PMSF), 0.8 μ M aprotinin, 2 μ g/mL leupeptin, 2 mM pepstatin A, 20 mM Tris (pH 8.0)를 포함 하는 버퍼에 펠 릿을 녹여 그리고 1 %digitonin, 셀의 리터 당 버퍼의 100 mL를 사용 하 여 수확. 일단 해 동, pipetting 또는 교 반에 의해 솔루션의 동질성을 확인 합니다. 저 어 바 회전 얼음에 비 커에 4 ° C에서 2 h solubilize 허용 합니다.
  2. 4 ° c.에서 1 h 235000 × g 에서 ultracentrifugation에 의해 세포 파편을 제거 SEC 열에서 30 μ 샘플을 실행 하 여 단백질 수량 확인 ( 재료의 표참조) 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 대상 단백질 GFP 신호 출력으로 시각화.
  3. 1-2 h 4 ° c.에 대 한 코발트 선호도 수 지 (표면에 뜨는) solubilized 단백질을 품 어 SEC 열에서 30 μ 샘플을 실행 하 여 수 지에 단백질의 바인딩을 확인 합니다.
    참고: 단백질 바인딩 발생 하면 GFP 태그 단백질 대상 통해 흐름에 없는 열에 유지 됩니다. 따라서, GFP 신호 흐름 통해 HPLC에서 실행 될 때 대상 단백질 크기에 해당 하는 위치에 현재 있을 것입니다.
  4. 워시 버퍼 (20 mM Tris, pH 8.0, 500 mM NaCl, 15mm 이미, 및 0.1 %digitonin)의 10 열 량 수 지. SEC 열에서 30 μ 샘플을 실행 하 여 단백질 손실에 대 한 확인 합니다.
    참고: 열에서 단백질 손실, 발생 하는 경우 GFP 태그 단백질 대상 동안 열 지나간 워시 버퍼에서 찾을 수 있습니다. 따라서, GFP 신호에 워시 버퍼 HPLC에서 실행 될 때 대상 단백질 크기에 해당 하는 위치에 있을 것입니다. 단백질 손실, 발생 하는 경우 이미 농도 워시 버퍼의 선호도 열 태그 바인딩 그의 방해를 방지 하기 위해 인하 될 필요가 있습니다.
  5. 버퍼 (20 mM Tris, pH 8.0, 500 mM NaCl, 250mm 이미, 및 0.1 %digitonin) 수 지 바인딩된 hTRPC3 elute 1시 20분에서 트 롬 빈을 추가 (다니엘 GFP 태그)에 어 금 니 비율 eluted 샘플 10 mM EDTA (hTRPC3 안정화 에이전트)를 추가 하 고 3 h 4 ° c.에 대 한 품 어 그 단백질은 되었습니다 eluted 샘플 희석 1: 100의 90 μ SEC 열에 실행 하 고 대상 단백질 크기에 해당 하는 위치에 GFP 신호의 존재를 확인 하 여 확인 합니다.
    참고:이 시점에서, 총 단백질은 차입에서에서 트립토판 신호 또한 볼 수 있습니다. 대상 선호도 정화 단백질은 차입에는 GFP 유지 됩니다 및 트립토판 신호 됩니다만 근처 프로필에 동일. 대상 단백질은 차입에 대량에서 나타나지 않습니다 하지만 흐름을 통해 또는 세척에 손실 되지 했다, 단백질 열에 바인딩된 남아 가능성이 있다 고 이미의 높은 농도 사용 하 여 버퍼에 eluted 될 수 있습니다.
  6. 500 μ 하 eluate 집중이 15 mL 100 K 원심 필터 튜브 ( 재료의 표참조) 5 분 단위로 4 ° C에서 동작 하는 2880 x g 에서 회전 하 여. Overconcentrating을 피하기 위해 회전 사이 아래로 솔루션 pipetting으로 단백질을 resuspend.
    참고: 볼륨에 근접할 때 원하는 마지막 볼륨 원심 분리기 시간이 단축 될 수 있습니다.
  7. 로드 (20 mM Tris, pH 8.0, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 그리고 0.1 %digitonin) 버퍼에 SEC 열에 집중. 실행 합니다.
  8. 포함 된 UV 흡 광도 신호에 의해 시각으로 그대로 TRPC3 tetramer 피크 분수를 결합 하 고 적어도 5 mg/mL의 최종 농도에 다시 집중.

7. 부정적인 얼룩 전자 현미경 검사 법에 의해 단백질의 심사

  1. 글로우 방전 기계 켜십시오. 30 미 실행에 대 한 아르곤과 산소를 사용 하 여 탄소 코팅 그리드 출력을 위한 프로그램 수 있도록 탄소 코팅 구리 400 메쉬 격자에 친수성 단백질 솔루션을 추가 하기 전에 프로그램을 설정 합니다.
  2. 멸 균 물 드랍 스 5 40 μ 및 2 개의 40 μ 1 %uranyl 편대 솔루션의 설정 (랩 필름, 왁 스 종이, 또는 유사한 표면에 재료의 표참조). 7.1 단계에서 격자를가지고 고 어두운 면에 단백질의 2.5 μ 샘플 5 mg/mL (50-200 μ M)를 추가 하 고 1 분 동안 앉아 보자.
  3. 1 분 후 필터 종이 사용 하 여 그리드를 건조. 그리드 화면;으로 직접 필터 종이 만지지 마십시오 대신, 액체 작은 물방울의 가장자리에 종이 하 고 필터 종이에 그리드에서 액체를 모 세관 작업을 허용.
  4. 물의 첫 번째 드롭 다운에는 그리드를 찍어. 건조 한 종이 필터 및 물의 나머지 방울과 uranyl 편대의 첫 번째 드롭 다운 반복. Uranyl 편대 앉아 1 분의 두 번째 드롭 허용 하 고 필터 종이 건조. 저장 하기 전에 완전히 건조 공기 (약 1 분)에 그리드를 허용 합니다.
    참고:이 얼룩 프로토콜 모든 단백질 세제 조합에 대 한 이상적인 않을 수 있습니다. Uranyl 편대의 다른 농도 얼룩 하 고 위의 단계 좋은 콘트라스트와 얼룩을 제공 하지 않으면 얼룩 노출 시간이 서로 다른 길이 테스트 해야 합니다.
  5. 전자 현미경에 격자를 이미지 ( 재료의 표참조) 단백질 입자 품질을 확인 하기. 현미경 수많은 입자 들 일반적인 외관 및 유통에 균질 성 표시 확인 하 고 좋은 대조, 표시 대상 단백질의 예측 된 크기와 일치.
  6. 예비 생성, 저해상도, 2 차원 (2D) 분류를 사용 하 여 50-100 현미경 (데이터 처리-10 단계 참조)을 확인 하는 입자는 단일 일관 된 구조를의 다른 뷰를 나타냅니다.
    참고: 현미경 그리고으로 서, 위에서 설명한 프로토콜 충분히 단백질 정화에 대 한 최적화 된 강력한 표시기 충분 한 품질의 예비 2D 클래스. 준비 및 곳을 알아내는-EM 격자의 시점에서 보증 된다.

8. EM 샘플 준비

  1. 글로우 방전 골드 홀리 탄소 격자 ( 재료의 표참조) 7.1 단계에서 설명한 대로.
  2. 눈금에 집중된 hTRPC3 단백질 샘플 (5 mg/mL)의 2.5 μ를 적용 합니다. 1.5에 대 한 그리드 오 점 오를 사용 하 여 s 1과 5의 대기 시간의 힘 100% 습도에서 4 ° C, s 다음 급락 그리드 vitrification 기계를 사용 하 여 액체 질소에 의해 냉각 하는 액체 탄.
    참고: 습도, 온도, 오-포스, 오 점, 시간과 대기 시간 여기에 나열 된 저자 hTRPC3 연구19사용 되었다. 그들은 다른 단백질 및 세제에 대 한 최적의 유리 얼음을 생산 하기 위해 변경 될 필요가 있습니다.
  3. 곳을 알아내는-EM 현미경을 사용 하 여 최적의 얼음 상태에 대 한 격자를 고정 화면 ( 재료의 표참조) 얼음과 수동으로 보기 두꺼운 얼음 (작고 어두운 표시 되는 그리드 사각형)의 얇은 얼음 (크고 밝게 표시 되는 그리드 사각형)와 매체 .
    참고: 얇은 얼음 종종 더 나은 명암비와 해상도 생성 하는 동안 두꺼운 얼음은 종종 더 많은 입자를 보유 합니다. 이미지는 얼음 결정의 사용 수동 심사 조건 좋은 콘트라스트와 해상도 monodispersed 입자의 많은 수에서 결과. 일단 좋은 조건 확인은 300 kV cryo-EM 현미경 이미지 컬렉션으로 이동 합니다.

9. EM 데이터 수집

  1. 슈퍼 해상도 1.074의 범주화 된 픽셀 크기 계산 모드에서 이미지 스택을 기록 자동된 수집 프로그램을 사용 하 여 Å 전자 현미경에 운영 300 kV X 130, 000의 명목상 확대와 함께 직접 전자 탐지기.
  2. 8의 총 노출 시간 40 프레임에 모든 이미지를 복용량 충분치 s, 0.2 s 프레임과 6.76 e− Å−2의 − 1 (공칭 defocus 값 저자의 실험에 2.5 μ m 1.0에서 변화)의 복용량 비율.

10. 엠 데이터 처리

  1. 영화 스택22 를 표현 하는 교정의 모션을 구현 하 고 defocus23 데이터 처리 소프트웨어를 사용 하 여 값을 추정 (참조 테이블의 재료)24.
  2. 입자를 현미경에서 선택 하십시오. 이러한 고른 입자를 사용 하 여 초기 참조 무료 2D 분류 소프트웨어24를 사용 하 여 구성. 전체 데이터 집합에 대 한 자동화 된 입자 따기에 대 한 템플릿으로 사용 하 여 선택 이상적인 2D 클래스 평균.
  3. 수동으로 자동 고른 입자의 품질을 확인 하 고 나쁜 입자를 제거 합니다. 2 차원 분류의 여러 라운드를 사용 하 여 고른된 입자를 청소.
  4. 초기 모델25를 생성 합니다. 주제 2D a 참조 모델로 C1 대칭 및 60 Å의 초기 재구성 저역 통과 필터를 사용 하 여 3 차원 (3D) 분류 (약 5 클래스) 입자를 선택. 어떤 고해상도 기능 있고 같은 클래스 내에서 입자를 결합 하 여 결정 합니다.
  5. C4 대칭의 경우 (hTRPC3) 적용 지역 상세를 사용 하 여 입자를 더욱 구체화 하 고 입자 정렬에 대 한 고해상도 4.5 Å26설정 합니다.

11. 모델 구축

  1. 모델 구축 (사용 하는 소프트웨어에 대 한 재료의 표 참조). HTRPC3를 사용 하 여 막 횡단 도메인 (TMD) 일시적인 수용 체 잠재력 melastatin 4 (TRPM4)의 구조 단백질 데이터 은행 (PDB) 5wp6 가이드27. 부피가 잔류물 및 이차 구조 예측에 사용 하 여 안내 드 노 보 건물.
  2. 주제 이차 구조 억제28와 실제 공간 수정 하 초기 모델. 수동으로 세련 된 모델을 검토 하 고 (사용 하는 소프트웨어에 대 한 재료의 표 참조)을 필요에 따라 remodify.
  3. 최종 모델과 세련 된 구조의 유효성 검사에 대 한 EM 지도 간의 차이 계산을 푸리에 셸 상관 (FSC) 곡선을 적용 합니다. (사용 하는 소프트웨어에 대 한 재료의 표 참조) 원자 모델의 형상 평가29,30.

결과

식에 대 한 프로토콜의 도식 개요 및 hTRPC3의 정화 그림 1A에 표시 됩니다. HTRPC3 bacmid 플레이트 bacmid DNA 정화, 선정 하는 나와 비슷한 이상적인 백색 식민지와의 이미지는 그림 1B에서 표시 됩니다. 우리는 그 48 h는 분명 Bluo 여자 고립 된 식민지의 존재를 유지 하면서 얼룩을 발견. GFP 형광에 의해 시각으로 hTRPC3에 대 한 P2 바이러?...

토론

곳을 알아내는-그들에 의해 단백질의 구조 결정은 지난 몇 년 동안, 새로운 카메라와 알고리즘의 개발을 크게 하지 않는 단백질 구조 결정 속도 덕분에 구조 생물학 분야 혁명 쉽게 정보, 특히 막 단백질. 모든 cryo-EM 기술에서 최근의 진보에도 불구 하 고 높은-품질 종종 이미지를 촉진 하기 위하여 순화 된 단백질의 품질과 수량에 충분 한 준비 시간이 걸리는, 비용이 많이 드는, 그리고 도전 남아 ?...

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

우리 데이터 수집에는 데이비드 밴 Andel 고급 Cryo 전자 현미경 검사 법에 대 한 지원에 대 한 G. 자오와 X. 멩 감사합니다. VARI-고성능 컴퓨팅 팀을 전산 지원 부탁 드립니다. 우리는이 원고를 크게 개선 하는 의견에 대 한 명. 클레 멘 테, 디 비, 제이 Floramo, 영 황, Y. 김, C. 뮬러, B. 로스, 그리고 Z. Ruan 우리의 감사를 제공 합니다. 이 원고에 대 한 편집 지원에 감사 디 Nadziejka 하 고. 이 작품은 내부 바리에서 지 원하는 자금.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
pEG BacMam vector (pFastBacI)addgene31488
DH10α cellsLife Technologies10361-012
S.O.C. mediaCorning46003CRfor transformation of DH10α cells for Bacmid
Bacmam culture platesTeknovaL5919for culture of transformed DH10α cells
Incubation shaker for bacterial cellsInfors HTMultitron standard
Incubated orbital shaker for insect cellsThermo-FisherSHKE8000
Reach-in CO2 incubator for mammalian cellsThermo-Fisher3951
Table-top orbital shakerThermo-FisherSHKE416HPused in Reach-in CO2 incubator for mammalian cells
IncubatorVWR1535for bacterial plates
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106for plasmid extraction and purification
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcoholInvitrogen15593031for DNA extraction
Sf9 cellsLife Technologies12659017insect cells for producing virus
Sf-900 mediaGibco12658-027insect cell media
FBSAtlanta BiologicalsS11550
Cellfectin IIGibco10362100for transfecting insect cells
lipofectamine 2000Invitrogen11668-027for transfecting mamalian cells
0.2 mm syringe filterVWR28145-501for filtering P1 virus
0.2 mm filter flasks 500ml resevoirCorning430758for filtering P2 virus
erlenmeyer culture flask (flat bottom 2L)Gene MateF-5909-2000for culturing insect cells
erlenmeyer culture flask (baffled 2L)Gene MateF-5909-2000Bfor culturing mammalian cells
nanodrop 2000 spectrophotometerThermo-FisherND-2000for determining DNA and protein concentrations
HEK293ATCCCRL-3022mammalian cells for producing protein
Freestyle 293 expression MediumGibco1238-018mammalian cell media for protein expression
Butyric Acid Sodium SaltAcros263195000to amplify protein expression
PMSFAcros215740500protease inhibitor
Aprotinin from bovine lungSigma-AldrichA1153-100MGprotease inhibitor
Leupeptin hydrochlorideSigma-Aldrich24125-16-4protease inhibitor
pepstatin AFisher ScientificBP2671-250protease inhibitor
digitoninEMD Millipore300410detergent - to solubilize protein from membrane
imidazoleSigma792527to elute protein from resin column
TALON resinClonetech635504for affinity purification by His-tag
superose6 incease columnsGE29091596; 29091597for HPLC and FPLC
Prominence Modular HPLC SystemShimadzuSee Below
Controller Module"CBM20A
Solvent Delivery System"LC30AD
Fluorescence Detector"RF20AXS
Autosampler with Cooling"SIL20ACHT
Pure FPLC System with FractionatorAkta
thrombin (alpha)Haematologic Technologies IncorporatedHCT-0020 Human alphafor cleaving GFP tag
Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugal filter tubeMilliporeUFC910008for concentrating protein
EDTAFisherE478500for stabilizing protein
400 mesh carbon-coated copper gridsTed Pella Inc.01754-Fgrids for negative stain
Quantifoil holey carbon grid (gold, 1.2/1.3 μm size/hole space, 300 mesh)Electron Microscopy SciencesQ3100AR1.3grids for Cryo-EM
Vitrobot Mark IIIFEIfor preparing sample grids by liquid ethane freezing
liquid nitrogenDura-CylUN1977
ethane gasAirgasUN1035
Solarus Plasma SystemGatanModel 950for cleaning grids before sample freezing
Tecnai Spirit electron microscopeFEIfor negative stain EM imaging
Talos Arctica electron microsocopeFEIfor screening and low resolution imaging of Cryo-EM grids
Titan Krios electron microscopeFEIfor high-resolution Cryo-EM imaging
Software
Gautomatch softwarehttp://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/to pick particles from micrographs
Relion 2.1 softwarehttps://github.com/3dem/relionto construct 2D and 3D classification
CryoSPARC softwarehttps://cryosparc.com/to generate an initial structure model
Frealign softwarehttp://grigoriefflab.janelia.org/frealignto refine particles
Coot softwarehttps://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/to build a model
MolProbity softwarehttp://molprobity.biochem.duke.edu/to evaluate the geometries of the atomic model
SerialEM softwarehttp://bio3d.colorado.edu/SerialEM/for automated serial image stack acquisition
MortionCor2 softwarehttp://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.htmlfor motion correction of summed movie stacks
GCTF softwarehttps://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/for measuring defocus values in movie stacks
Phenix.real_space_refine softwarehttps://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.htmlfor real space refinement of the initial 3D model

참고문헌

  1. Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
  2. Kumar, R., Thompson, J. R. The regulation of parathyroid hormone secretion and synthesis. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (2), 216-224 (2011).
  3. Sudhof, T. C. Calcium control of neurotransmitter release. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (1), a011353 (2012).
  4. Ong, H. L., de Souza, L. B., Ambudkar, I. S. Role of TRPC Channels in Store-Operated Calcium Entry. Advances in Experimental Medicine and Biology. 898, 87-109 (2016).
  5. Smyth, J. T., et al. Activation and regulation of store-operated calcium entry. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (10), 2337-2349 (2010).
  6. Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiological Reviews. 95 (4), 1383-1436 (2015).
  7. Liu, X., Singh, B. B., Ambudkar, I. S. TRPC1 is required for functional store-operated Ca2+ channels. Role of acidic amino acid residues in the S5-S6 region. Journal of Biological Chemistry. 278 (13), 11337-11343 (2003).
  8. Zhu, X., Jiang, M., Birnbaumer, L. Receptor-activated Ca2+ influx via human Trp3 stably expressed in human embryonic kidney (HEK)293 cells. Evidence for a non-capacitative Ca2+ entry. Journal of Biological Chemistry. 273 (1), 133-142 (1998).
  9. Zhu, X., et al. trp, a novel mammalian gene family essential for agonist-activated capacitative Ca2+ entry. Cell. 85 (5), 661-671 (1996).
  10. Itsuki, K., et al. Voltage-sensing phosphatase reveals temporal regulation of TRPC3/C6/C7 channels by membrane phosphoinositides. Channels (Austin). 6 (3), 206-209 (2012).
  11. Tang, J., et al. Identification of common binding sites for calmodulin and inositol 1,4,5-trisphosphate receptors on the carboxyl termini of trp channels. Journal of Biological Chemistry. 276 (24), 21303-21310 (2001).
  12. Gonzalez-Cobos, J. C., Trebak, M. TRPC channels in smooth muscle cells. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 15, 1023-1039 (2010).
  13. Li, H. S., Xu, X. Z., Montell, C. Activation of a TRPC3-dependent cation current through the neurotrophin BDNF). Neuron. 24 (1), 261-273 (1999).
  14. Becker, E. B., et al. Candidate screening of the TRPC3 gene in cerebellar ataxia. Cerebellum. 10 (2), 296-299 (2011).
  15. Kitajima, N., et al. TRPC3 positively regulates reactive oxygen species driving maladaptive cardiac remodeling. Scientific Reports. 6, 37001 (2016).
  16. Yang, S. L., Cao, Q., Zhou, K. C., Feng, Y. J., Wang, Y. Z. Transient receptor potential channel C3 contributes to the progression of human ovarian cancer. Oncogene. 28 (10), 1320-1328 (2009).
  17. Oda, K., et al. Transient receptor potential cation 3 channel regulates melanoma proliferation and migration. Journal of Physiological Sciences. 67 (4), 497-505 (2017).
  18. Xia, M., Liu, D., Yao, C. TRPC3: A New Target for Therapeutic Strategies in Chronic Pain-DAG-mediated Activation of Non-selective Cation Currents and Chronic Pain (Mol Pain 2014;10:43). Journal of Neurogastroenterology and Motility. 21 (3), 445-447 (2015).
  19. Fan, C., Choi, W., Sun, W., Du, J., Lu, W. Structure of the human lipid-gated cation channel TRPC3. Elife. 7, e36852 (2018).
  20. Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
  21. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay to identify membrane protein expression and crystallization conditions. Structure (London, England: 1993). 20 (8), 1293-1299 (2012).
  22. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  23. Zhang, K. Gctf: Real-time CTF determination and correction. Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).
  24. Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  25. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  26. Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
  27. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  28. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
  29. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).
  30. Scheres, S. H. W., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature Methods. 9 (9), 853-854 (2012).
  31. Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  32. Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
  33. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 12-21 (2010).
  34. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).
  35. Green, E. M., Au, Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. Journal of Visualized Experiments. (117), e54792 (2016).
  36. Mesa, P., Deniaud, A., Montoya, G., Schaffitzel, C. Directly from the source: endogenous preparations of molecular machines. Current Opinion in Structural Biology. 23 (3), 319-325 (2013).
  37. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane Protein Assembly into Nanodiscs. FEBS letters. 584 (9), 1721-1727 (2010).
  38. Winkler, P. A., Huang, Y., Sun, W., Du, J., Lü, W. Electron cryo-microscopy structure of a human TRPM4 channel. Nature. 552, 200-204 (2017).
  39. Autzen, H. E., et al. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science. 359 (6372), 228-232 (2017).
  40. Guo, J., et al. Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4. Nature. 552 (7684), 205-209 (2017).
  41. Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1860 (2), 378-383 (2018).
  42. Gulati, S., et al. Detergent-free purification of ABC (ATP-binding-cassette) transporters. Biochemical Journal. 461 (2), 269-278 (2014).

재인쇄 및 허가

JoVE'article의 텍스트 или 그림을 다시 사용하시려면 허가 살펴보기

허가 살펴보기

더 많은 기사 탐색

143cryocryo EM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

개인 정보 보호

이용 약관

정책

연락처

사서에게 추천하기

JoVE 뉴스레터

연구

교육

저자

사서

JoVE 소개

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. 판권 소유