АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает методы, используемые для определения структуры ионного канала крио электронная микроскопия, включая систему бакуловирусы используется эффективно выражать гены в клетках млекопитающих с минимальными усилиями и токсичности, экстракции белков, очистка, и проверка качества, сетка пробоподготовки и скрининга, а также сбор и обработка данных.

Аннотация

Переходный рецепторный потенциал каналов (TRPCs) канонических подсемейство ГТО, неселективных катиона каналы, которые играют важную роль в гомеостаз кальция, кальция, особенно магазин работает запись, которая имеет решающее значение для поддержания надлежащего функционирования релиз синаптических пузырьков и внутриклеточных сигнальных путей. Соответственно Термизатор каналы были вовлечены в различных заболеваний человека, в том числе сердечно-сосудистых расстройств, таких как гипертрофии сердца, нейродегенеративных расстройств, таких как болезнь Паркинсона и неврологических расстройств, таких как Спиноцеребеллярная атаксия. Таким образом Термизатор каналы представляют потенциальной мишенью фармакологических в заболеваниях человека. Однако молекулярные механизмы стробирования в эти каналы по-прежнему неясны. Трудности в получении большого количества стабильной, однородной и очищенный белок был ограничивающим фактором в исследованиях определение структуры, особенно для млекопитающих мембранных белков например Термизатор ионных каналов. Здесь мы представляем собой протокол для крупномасштабных выражение млекопитающих ионного канала мембранных белков с помощью очистки этих белков и системы передачи гена модифицированных бакуловирусы сродства и размер-гель-проникающей хроматографии. Далее мы представляем протокол для сбора сингл частица крио электронная микроскопия изображения от очищенный протеин и использовать эти изображения для определения структуры белков. Для определения структуры это мощный метод для понимания механизмов, стробирование и функции в ионных каналов.

Введение

Кальций участвует в самых клеточных процессах, включая сигнальные каскады, транскрипция управления, нейромедиатора релиз и гормон молекулы синтез1,2,3. Гомеостатических поддержание цитозольной свободного кальция имеет решающее значение для здоровья и функции клеток. Одним из основных механизмов гомеостаза внутриклеточного кальция является запись работает магазин кальция (SOCE), процесс, в котором истощения кальция хранится в эндоплазматический ретикулум (ER) триггеры открытие ионных каналов на плазматической мембраны для облегчения пополнение ER кальция, который затем может использоваться в дальнейшей сигнализации4,5,6. Переходный рецепторный потенциал каналов (TRPCs), которые кальция проницаемые каналы, принадлежащие ГТО надсемейства, были определены как одним из основных участников в SOCE7,8,9 .

Среди семи членов в семье Термизатор TRPC3, TRPC6 и TRPC7 образуют подгруппу гомолог, и они являются уникальными в способности быть активированы липидов вторичных посланник диацилглицерол (ГПДР), продуктом разложения сигналов липидов фосфатидилинозитол 4,5-Бисфосфат (PIP2)10,11. Высоко TRPC3 выражается в гладких мышц и регионах мозга и мозжечка головного мозга, где он играет существенную роль в сигнализации кальция, которые влияют синапсах и нейрогенез12,13. Дисфункция TRPC3 были связаны с центральной нервной системы, сердечно-сосудистых заболеваний и некоторых видов рака, таких как аденокарцинома яичников14,,1516. Таким образом TRPC3 обещает как фармацевтического назначения для лечения этих заболеваний. Разработка целенаправленных препараты, действующие на TRPC3 было ограничено отсутствием понимания его молекулярной активации механизмов, включая липидов привязки сайтов17,18. Мы сообщили первой атомной резолюции структуры человеческого TRPC3 канал (hTRPC3) и ее две липидов привязки сайтов в закрытом состоянии, предоставляя важные выводы этих механизмов19.

Ключевым фактором для определения структуры мембранный белок с высоким разрешением, чтобы получить белка высокого качества. Соответствующие скрининг очистки и выражение условия, необходимые для получения высококачественного белка может быть длительным и дорогостоящим стремиться. Здесь мы представляем протокол, подробно описывающий, как мы определить оптимальные условия для выражения и очистки hTRPC3, который вел себя плохо в наших первоначальных скрининг. Мы представляем несколько ключевых моментов, о том, как оптимизировать поведение белка, который заложить прочную основу для нашей крио электронная микроскопия (крио ЭМ) исследования и устранения неполадок. Мы используем модифицированных baculoviral генерации вектор (ПЭГ), разработанный Gouaux и коллеги, который оптимизирован для скрининговых анализов и эффективного поколения бакуловирусы в mammalian клетках20. Это выражение метод подходит для быстрого и экономически гиперэкспрессия белков в млекопитающих клеточной мембраны. Мы совмещаем использование данного вектора с флуоресцентным обнаружением размер исключение на основе хроматографии (FSEC), подавшим метод21. Этот метод использует тег Зеленый флуоресцентный белок (КГВ), сливается с конструкцией интерес и улучшает визуализацию целевого белка в небольших, поклеточного растворимых образцов. Это позволяет для проверки стабильности белка в присутствии различных моющих средств и добавок, с thermostabilizing мутации и позволяет использовать небольшое количество клеток от небольших переходных transfection. Таким образом множество условий может проверяться быстро до переезда в крупномасштабных белка очистки. После выражения, скрининг и очистки мы представляем собой протокол для получения и обработки изображений с крио EM для создания de novo определение структурного белка. Мы считаем, что подходы, описанные здесь будет служить обобщаемым протокол для структурных исследований ГТО канал рецепторов и других мембранных белков.

протокол

1. Преобразование компетентных клеток DH10α для производства Bacmid ДНК

  1. Синтезировать гена интереса и subclone в модифицированную версию вектора колышек, содержащий тег стрептококк Твин, His8-тег и GFP с сайтом расщепления тромбина на вокзал (pFastBacI) N20.
  2. Превратить сведущие клетки, добавив 5 нг плазмида, содержащий требуемый гена в pFastBacI до 50 мкл DH10α клетки в 1,5 мл трубки и проинкубируйте втечение 10 мин на льду. Тепловой шок клетки для 45 s при 42 ° C. Добавить 200 мкл супер оптимального бульон с катаболических репрессор (SOC) средний в трубы и проинкубируйте 4-8 ч при 37 ° C в орбитальный шейкер на 225 об/мин.
  3. Пластина 5 мкл клеток на плите агар bacmid фунтов (50 мкг/мл канамицин, 7 мкг/мл гентамицин, тетрациклин, 100 мкг/мл Bluo Гал и 40 мкг/мл изопропиловый β-D-1-тиогалактопиранозид [IPTG], агар 10 мкг/мл).
  4. Инкубировать пластину для 48 ч при 37 ° C.
    Примечание: Bluo Гал индикатор пятна колоний, которые по-прежнему выражают lacZ (вектор вставки неудачной), позволяя для отбора белых колоний (успешно преобразованных).
  5. Тщательно выберите изолированное белый колонии, избегая любой белый колоний, которые находятся в контакте с голубой колоний и расти клеток на ночь в 6 мл среды bacmid фунтов (50 мкг/мл канамицин, 7 мкг/мл гентамицин, тетрациклин 10 мкг/мл) при 37 ° C в орбитальный шейкер на 225 об/мин.

2. бактериальные подготовка для изоляции Bacmid ДНК

  1. Чтобы изолировать bacmid ДНК, спина вниз клетки Escherichia coli 10 мин на 2880 x g.
  2. Удалить супернатант и Ресуспензируйте Пелле в 200 мкл раствора ресуспендирования клеток от алкалический комплекта (см. Таблицу материалы), закупорить. Убедитесь, что гранулы приостанавливается полностью и содержанием однородно. Затем перевести суспензию клеток на 1.5 мл пробирок.
  3. Добавьте 200 мкл раствора лизис клеток от алкалический комплект и микс, инвертирование трубки в несколько раз. Инкубируйте до 5 мин при комнатной температуре (RT) чтобы лизировать клетки. Добавить 200 мкл раствора нейтрализации от алкалический комплект и микс, инвертирование трубки несколько раз остановить лизис реакции.
  4. Спин вниз за 10 минут на 21,130 x g в центрифуге столешницы. Собирайте 600 мкл супернатант в 2-мл пробирку. Добавить 600 мкл фенола: хлороформ: изоамилового спирта раствор (см. Таблицу материалы) и перемешать тщательно, чтобы извлечь ДНК из остальных продуктов лизис клеток.
    Предупреждение: Фенол: хлороформ: изоамилового спирта раствор токсичных при вдыхании, при контакте с кожей и при проглатывании. Это может вызвать химические ожоги и могут быть канцерогенами. Надевайте перчатки и застегнутой халате. Работа в зонта. Утилизация опасных отходов надлежащим образом.
  5. Спиновые трубки для 10 мин на 21130 x g в центрифуге столешницы. Две отдельные жидкой фазы будет видимым. Тщательно передачи 300 мкл верхней водной фазы к новой пробке. Добавьте 600 мкл, 100% этанола мыть ДНК. Аккуратно Переверните трубку смешивать.
    Примечание: Сделать не вихря, как это можно наклонять bacmid ДНК.
  6. Прохладный трубы, поместив их в морозильной камере-20 ° C на 10 мин спин вниз за 10 минут на 21,130 x g в центрифуге столешницы. Отменить супернатант и сохранения ДНК Пелле.
  7. Добавьте 1 мл 70% этанола, чтобы помыть лепешка. Аккуратно Переверните трубку смешивать. Спина за 10 минут на 21,130 x g в центрифуге столешницы. Отменить супернатант и позволяют Пелле воздух сухой, примерно 5 минут или до тех пор, пока жидкости не виден в трубе и Пелле ДНК становится прозрачным.
  8. Ресуспензируйте сухие гранулы в 50 мкл стерильные, DNase бесплатно, деионизированная вода. Измерение концентрации ДНК.
    Примечание: Не замораживать bacmid ДНК. Хранить при 4 ° C до нескольких дней.

3. transfection Sf9 насекомых клеток с Bacmid производить P1 бакуловирусы

  1. Семя 0,9 x 106 клеток/хорошо Sf9 в 2 мл соответствующей среды (см. Таблицу материалы) в каждой скважине пластины 6-ну тканевые культуры. Инкубируйте клетки на 27 ° C в течение 20 мин содействовать привязанность к пластине.
    Предупреждение: Клеточных культур являются потенциальной биологической опасности. Работа в утвержденных Ламинарный шкаф с использованием асептических методов и проверьте институциональные и правительственные руководящие принципы для рекомендованных защитную одежду и надлежащего удаления отходов до выполнения экспериментов.
  2. После вложения, мкл 8 трансфекции реагента (см. Таблицу материалы) до 100 мкл средств массовой информации для каждой скважины 6 хорошо пластины будучи transfected в стерильную пробирку. Добавьте 100 мкл среды в отдельной стерильную пробирку 6 мкг bacmid ДНК. Инкубировать 5 мин на RT. Combine двух решений и проинкубируйте 45 мин на RT.
  3. Замените средний в 6 скважин с 2 мл свежей среды. Добавить смесь из предыдущих шага для каждого хорошо каплям (200 мкл на хорошо). Осторожно покачайте пластину для обеспечения Смешивание раствора трансфекции в среду.
    Примечание: Не вихрем или встряхнуть пластину, потому что это вызовет клетки для отсоединения.
  4. Инкубируйте клетки для 5 d (120 ч) в 27 ° C увлажненные инкубатора. Проверьте GFP флуоресценции до сбора урожая, чтобы убедиться, что этот вирус производится в большой процент клеток; Если процент является низкой, продлить время инкубации при необходимости (см. рис. 1 c).
  5. Соберите супернатанта содержащий вирус P1 (около 2 мл от каждой скважины). Фильтр носитель, содержащий вирус P1 в 2-мл пробирок, используя шприц 3 мл и малые 0.2 мкм фильтром. Добавьте стерильные плода бычьим сывороточным (ФБС) в конечной концентрации 1%.
    Примечание: Этот запас P1 вируса следует хранить при 4 ° C и быть защищены от света.

4. инфекции Sf9 насекомых клеток с P1 бакуловирусы производить P2 бакуловирусы

  1. Подготовка 200 мл (или желаемый объем) Sf9 клеток в концентрации 0,8 - 0,9 х 106 клеток/мл в соответствующей среде (см. Таблицу материалы) в плоское дно колбу Эрленмейера культуры достаточного размера.
    Примечание: Для подвески культуры, объем использования не должен превышать 40% общей емкости колбы.
  2. Добавьте соотношение 1:2500 (v/v) акций P1 вирус от 3,5 подвеска культуры клеток Sf9. Инкубируйте время оптимального вирус выражения (обычно 48-120 ч в зависимости от конструкции белка) при 27 ° C в орбитальный шейкер на 115 об/мин.
    Примечание: Выражение относительного вирус может быть определен путем просмотра GFP флуоресценции вируса в образце культуры.
  3. Центрифуга суспензию клеток для 40 мин на 11,520 x g и собирать супернатанта содержащий вирус P2. Фильтр супернатанта, используя одноразовые фильтры 0,2 мкм. Добавь FBS в конечной концентрации 0,5%.
    Примечание: Этот запас P2 вируса следует хранить при 4 ° C и быть защищены от света.
  4. Получения титра вируса P2 с помощью Sf9easy клетки или счетчик вирус.

5. инфекции HEK293 Mammalian клеток с P2 бакуловирусы для крупномасштабных белков

  1. Подготовка тома желательно HEK293 культуры mammalian клетки подвеска (4-6 L рекомендуется для приготовления замороженных сеток) в концентрации 3,5-3,8 x 106 клеток/мл в средство выражения (см. Таблицу материалы) дополнены 1% (v / v) стерильные FBS в догадках дно Эрленмейер культуры колбы достаточного размера.
    Примечание: Для подвески культуры, объем использования не должен превышать 40% от общего объема колбы.
  2. Добавьте 8% (v/v) P2 вирус Стоковый раствор из шага 4.3 подвеска культуры клеток HEK293. Инкубируйте при 37 ° C в орбитальный шейкер на 135 об/мин.
  3. Добавьте 10 мм натрия бутират в 12-18 h послеоперационные инфекции. Инкубируйте время оптимального белков (обычно 36-72 ч) при 30 ° C.
  4. Урожай клетки центрифугированием на 20 мин в 2880 x g. Вымойте клетки, resuspending в приблизительно 100 мл трис буфер солевой раствор (TBS) на литр клеток собирают. Центрифуга снова на 20 мин в 2880 x g и собирать Пелле ячейки.
    Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. Окатыши клеток может оснастки замороженные в жидком азоте и хранятся при температуре-80 ° C до очистки.
    Предупреждение: Жидкий азот может вызвать криогенные ожоги или травмы. Это может вызвать обморожение. Он может вытеснять кислород и вызвать быстрое удушья. Надевайте холодной Изоляционные Перчатки и щит.
  5. Собирать урожай небольшой 1 мл в различные моменты времени и солюбилизировать последнего втечение 2 ч при 4 ° C с качания или перемешивания в присутствии различных моющих средств и добавок. Эти небольшие образцы растворимых поклеточного может быть уточюненным ultracentrifugation на 235 000 × g 10 мин при 4 ° C и запустить как 30 мкл пример на столбец Размер-гель-проникающей хроматографии (сек) (см. Таблицу материалы), чтобы определить лучшее время для выражение и лучшие условия солюбилизация.
    Примечание: В случае hTRPC3, это обследование включены различные буферы с pH от 4.0-9.5 и концентрация соли 50-500 мм; различных ионных композиций (например, MgCl2 или NaCl); различные моющие средства с критической мицеллы значения концентрации (CMC) 0,1 - 20 мм; снижение добавки, такие как Дитиотреитол, tris(2-carboxyethyl) фосфина и β-меркаптоэтанол; и кальций Хелатирующие добавка Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА).

6. Очистка hTRPC3 белка из замороженных клеток Пелле

  1. Оттепель Пелле в буфер, содержащий 20 мм трис (рН 8,0), 500 мм NaCl, 1 мм phenylmethylsulfonyl фторид (PMSF), 0,8 мкм Апротинин, 2 мкг/мл leupeptin, 2 мм pepstatin A, и собрали digitonin 1%, с использованием 100 мл буфера на литр клеток. После размораживания, обеспечить однородность раствора, закупорить или перемешивания. Позволяют солюбилизировать последнего за 2 ч при 4 ° C в стакан, погруженный в лед с вращающейся бар stir.
  2. Удалить ячейки мусор, ultracentrifugation на 235 000 × г за 1 час при 4 ° C. Проверить количество белка, запустив 30 мкл пример на столбец SEC (см. Таблицу материалы), высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и визуализировать целевого белка GFP выходного сигнала.
  3. Инкубировать растворимых белка (супернатант) с кобальтом сродство смолы для 1-2 ч и при 4 ° C. Проверка связывания белков в смолу, запустив 30 мкл пример на столбец сек.
    Примечание: Если произошло связывания белков, целевой меткой белка GFP будет храниться на столбце, не найден в поток через. Таким образом сигнал не GFP будет присутствовать в положении, соответствующем размер целевого белка при запуске потока через на ВЭЖХ.
  4. Вымойте смолы с 10 томов столбца буфера (20 мм трис, рН 8,0, 500 мм NaCl, 15 мм имидазола и 0,1% digitonin). Проверка потери белка путем запуска 30 мкл пример на столбец сек.
    Примечание: Если произошло потери белка из столбца, целевой меткой белка GFP будет находиться в буфере мыть, что прошел над столбцом. Таким образом GFP сигнал будет присутствовать в положении, соответствующем размер целевого белка при мытье буфер на ВЭЖХ. Если произошла потеря белков, концентрация имидазола мыть буфера может потребоваться быть снижен для предотвращения подрыва его тег привязки к столбцу сходства.
  5. Элюировать hTRPC3 смола граница с буфером (20 мм трис, рН 8,0, 500 мм NaCl, 250 мм имидазола и 0,1% digitonin). Добавить тромбина в 1:20 молярное соотношение (чтобы расщеплять тег GFP) и добавить 10 мм ЭДТА (hTRPC3 стабилизирующий агент) в образце eluted и Инкубируйте 3 ч при 4 ° C. Проверьте, что белок был этого eluted, запустив 90 мкл пример разбавленный масштаба 1: 100 на столбец SEC и проверяя наличие сигнала GFP в позиции, соответствующей размеру целевого белка.
    Примечание: на данный момент, триптофан сигнал от общего белка в элюции можно также рассматривать. Только сходство очищенный белок целевой останется в элюции и GFP и триптофан сигналы будут вблизи идентичны в профиле. Если целевого белка не видел в большом количестве в элюции, но не был потерян в проточных или мыть, белок вероятно остается привязанным к столбцу и может быть этого eluted используя более высокую концентрацию имидазола в буфере.
  6. Концентрат элюата до 500 мкл или меньше в 15 мл 100K центробежного фильтра трубки (см. Таблицу материалы), спиннинг на 2880 x g при 4 ° C с шагом в 5 минут. Ресуспензируйте белка, закупорить решение вверх и вниз между спинами, чтобы избежать overconcentrating.
    Примечание: Центрифуги время может быть сокращен как объем приближается к желаемый конечный объем.
  7. Загрузите концентрата на SEC столбца в буфере (20 мм трис, рН 8,0, 500 мм NaCl, 1 мм ЭДТА и 0,1% digitonin). Запуск.
  8. Объединить пик фракций, содержащих нетронутыми Тетрамер TRPC3, как визуализировать УФ поглощения сигнала и снова сосредоточиться в конечной концентрации по крайней мере 5 мг/мл.

7. Скрининг белка, отрицательные пятно электронной микроскопии

  1. Включите машину тлеющего разряда. Задайте программу для разгрузки углерода покрытием сетки с использованием аргона и кислорода для 30 s. запустить программу, чтобы сделать углерода покрытие на медь 400-сетки сетки гидрофильные перед добавлением раствора белка.
  2. Созданы пять 40 мкл капли стерильной воды и два 40 мкл капель раствора 1% уранила формате (на фильм лаборатории, вощеной бумагой или подобную мягкую поверхность, см. Таблицу материалы). Возьмите решетку из шага 7.1 и добавить 2,5 мкл белка образца 5 мг/мл (50-200 мкм) на темную сторону и дайте ему сидеть за 1 мин.
  3. После 1 мин сухие сетку, используя фильтр-бумаги. Не прикасайтесь к фильтровальной бумаги непосредственно на поверхность сетки; Вместо этого довести этот документ до края жидкие капли и позволяют капиллярность тянуть жидкости из сетки в фильтровальную бумагу.
  4. Окуните сетки в первые капли воды. Сухие с фильтровальной бумаги и повторите с оставшиеся капли воды и первая капля уранила формате. Разрешить Второе падение уранила Формиат сидеть за 1 мин и затем высушить фильтровальную бумагу. Разрешить сетке полностью воздух сухой (около 1 мин) перед сохранением.
    Примечание: Это окрашивание протокол не может быть идеально подходит для всех комбинаций белка-моющего средства. Различные концентрации уранила Формиат пятно и разной длины времени пятно воздействия должны быть проверены, если перечисленные выше шаги не предоставляют пятно с хорошим контрастом.
  5. Изображение сетки по электронным микроскопом (см. Таблицу материалы) для проверки качества белковых частиц. Убедитесь, что микроскопии показывают многочисленные частицы, которые являются однородными в общий вид и распределение, отображения хороший контраст и матч прогнозируемого размера целевого белка.
  6. Создать предварительный, с низким разрешением, двухмерный (2D) классификаций, с помощью микроскопии 50-100 (см. обработка данных-шаг 10) чтобы проверить, что частицы представляют разные виды единой последовательной структуры.
    Примечание: Микроскопии и предварительных 2D классы достаточно высокого качества, как описано выше, являются сильным показателем, что протокол был достаточно оптимизирован для очистки белков. Подготовка и показ крио ет сетки является оправданным в этот момент.

8. EM пробоподготовки

  1. Тлеющего разряда Золотой Холи углерода сетки (см. Таблицу материалы), как описано в пункте 7.1.
  2. Примените 2,5 мкл концентрированного hTRPC3 образец протеина (5 мг/мл) на сетке. Блот сетки для 1,5 s с помощью пятно силу 1 и время ожидания 5 s при 100% влажности и 4 ° C, затем окунуться в сетке жидкий Этан, охлаждаемый жидким азотом, с помощью витрификации машины.
    Примечание: Влажность, температура, блот сила, блот время и время ожидания, перечисленные здесь были использованы для авторов hTRPC3 исследовании19. Им может потребоваться изменить для получения оптимального стекловидного тела ice для других белков и моющих средств.
  3. Экран замороженных сетки для оптимального ледовых условий с помощью микроскопа крио Эм (см. Таблицу материалы) и вручную мнение регионов толщиной льда (сетка квадратов, которые появляются небольшие и темнее), тонкого льда (сетка квадратов, которые появляются больше и ярче) и среднего льда .
    Примечание: Толще льда часто проводит больше частиц, в то время как тоньше льда часто дает лучше, контрастность и разрешение. Использование ручной отбора изображений для определения, которое льда условия результаты в большое количество частиц монодисперсными с хороший контраст и разрешение. После того, как хорошие условия проверяются, переход к коллекции изображений на микроскопом крио EM 300 кв.

9. сбор данных EM

  1. С помощью программы автоматического приобретения, запись стеки изображений в супер-резолюции подсчитывая режиме с сегментированием пикселя размером 1,074 Å на электронным микроскопом на 300 кв с номинальным увеличением 130,000 X прямой детектор электронов.
  2. Доза фракционировать каждое изображение до 40 кадров с общей выдержка из 8 сек, с 0,2 s каждого кадра и дозы 6.76 e− Å−2 s−1 (номинальный defocus значения варьировались от 1,0 до 2,5 мкм в эксперименте авторов).

10. обработка данных EM

  1. Осуществлять движение, коррекция подвел фильм стеки22 и оценить defocus значения23 с помощью программного обеспечения для обработки данных (см. Таблицу материалы)24.
  2. Выберите частиц от микроскопии. Используйте эти выбрали частиц для создания начальной ссылки бесплатный 2D классификации с использованием программного обеспечения24. Выберите идеальный 2D класса средние значения для использования в качестве шаблонов для комплектации автоматизированных частиц для всего набора данных.
  3. Вручную проверить качество авто выбрали частиц и удалить плохие частицы. Используйте несколько раундов 2D классификации для очистки взял частиц.
  4. Создание начальной модели25. Тема 2D выбрал частиц для трехмерных (3D) классификации (около 5 классы) с использованием C1 симметрии и первоначальной реконструкции НЧ-фильтр 60 Å как a эталонной модели. Определите, какие классы имеют черты высокого разрешения и объединить частиц в рамках такого класса.
  5. Дальнейшего уточнения частиц с помощью местных уточнения с C4 симметрия (в случае hTRPC3) применяется и с высоким разрешением для выравнивания частиц лимит до 4.5 Å26.

11. модель здания

  1. Построить модель (см. Таблицу материалов для используемого программного обеспечения). Для hTRPC3, используйте трансмембранных доменов (ПРО ТВД) в переходный рецепторный потенциал melastatin 4 (TRPM4) структура белка 5wp6 банка данных (PDB) как руководство27. Используйте громоздкие остатков и предсказание вторичной структуры для руководства de novo здания.
  2. Тема первоначальной модели для уточнения реального пространства с вторичной структуры ограничений28. Вручную изучить изысканные модели и remodify при необходимости (см. Таблицу материалов для используемого программного обеспечения).
  3. Применение кривых корреляции (FSC) оболочки Фурье для вычисления разницы между окончательной модели и карта EM для проверки структуры изысканный. Оценка геометрии атомной модели (см. Таблицу материалов для используемого программного обеспечения)29,30.

Результаты

Схематический обзор протокола для выражения и очистки hTRPC3 показано на рисунке 1A. Изображение hTRPC3 bacmid плиты с идеальной белых колоний, аналогичный тому, который выбран для очистки bacmid ДНК, показан на рисунке 1B. Мы обнаружили, что 48 h идеал?...

Обсуждение

Структурные определения белков, крио EM произвела революцию в области структурной биологии в последние несколько лет, благодаря разработке алгоритмов и новых камер, что значительно ускоряет определение структуры белков, которые не легко crystalize, особенно мембранных белков. Несмотря на в...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы благодарим G. Чжао и X. Meng за поддержку в сборе данных в Дэвид Ван Андел Advanced крио-электронная микроскопия Suite. Мы высоко ценим VARI высокопроизводительных вычислений команды для компьютерной поддержки. Мы даем нашу благодарность N. Клементе, D. взносы, J. Floramo, ю. Хуан, ю. Ким, C. Mueller, B. рот и Z. Ruan для комментариев, которые значительно улучшили эту рукопись. Мы благодарим д Nadziejka за редакционную поддержку для этой рукописи. Эта работа была поддержана внутренней VARI финансирования.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
pEG BacMam vector (pFastBacI)addgene31488
DH10α cellsLife Technologies10361-012
S.O.C. mediaCorning46003CRfor transformation of DH10α cells for Bacmid
Bacmam culture platesTeknovaL5919for culture of transformed DH10α cells
Incubation shaker for bacterial cellsInfors HTMultitron standard
Incubated orbital shaker for insect cellsThermo-FisherSHKE8000
Reach-in CO2 incubator for mammalian cellsThermo-Fisher3951
Table-top orbital shakerThermo-FisherSHKE416HPused in Reach-in CO2 incubator for mammalian cells
IncubatorVWR1535for bacterial plates
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106for plasmid extraction and purification
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcoholInvitrogen15593031for DNA extraction
Sf9 cellsLife Technologies12659017insect cells for producing virus
Sf-900 mediaGibco12658-027insect cell media
FBSAtlanta BiologicalsS11550
Cellfectin IIGibco10362100for transfecting insect cells
lipofectamine 2000Invitrogen11668-027for transfecting mamalian cells
0.2 mm syringe filterVWR28145-501for filtering P1 virus
0.2 mm filter flasks 500ml resevoirCorning430758for filtering P2 virus
erlenmeyer culture flask (flat bottom 2L)Gene MateF-5909-2000for culturing insect cells
erlenmeyer culture flask (baffled 2L)Gene MateF-5909-2000Bfor culturing mammalian cells
nanodrop 2000 spectrophotometerThermo-FisherND-2000for determining DNA and protein concentrations
HEK293ATCCCRL-3022mammalian cells for producing protein
Freestyle 293 expression MediumGibco1238-018mammalian cell media for protein expression
Butyric Acid Sodium SaltAcros263195000to amplify protein expression
PMSFAcros215740500protease inhibitor
Aprotinin from bovine lungSigma-AldrichA1153-100MGprotease inhibitor
Leupeptin hydrochlorideSigma-Aldrich24125-16-4protease inhibitor
pepstatin AFisher ScientificBP2671-250protease inhibitor
digitoninEMD Millipore300410detergent - to solubilize protein from membrane
imidazoleSigma792527to elute protein from resin column
TALON resinClonetech635504for affinity purification by His-tag
superose6 incease columnsGE29091596; 29091597for HPLC and FPLC
Prominence Modular HPLC SystemShimadzuSee Below
Controller Module"CBM20A
Solvent Delivery System"LC30AD
Fluorescence Detector"RF20AXS
Autosampler with Cooling"SIL20ACHT
Pure FPLC System with FractionatorAkta
thrombin (alpha)Haematologic Technologies IncorporatedHCT-0020 Human alphafor cleaving GFP tag
Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugal filter tubeMilliporeUFC910008for concentrating protein
EDTAFisherE478500for stabilizing protein
400 mesh carbon-coated copper gridsTed Pella Inc.01754-Fgrids for negative stain
Quantifoil holey carbon grid (gold, 1.2/1.3 μm size/hole space, 300 mesh)Electron Microscopy SciencesQ3100AR1.3grids for Cryo-EM
Vitrobot Mark IIIFEIfor preparing sample grids by liquid ethane freezing
liquid nitrogenDura-CylUN1977
ethane gasAirgasUN1035
Solarus Plasma SystemGatanModel 950for cleaning grids before sample freezing
Tecnai Spirit electron microscopeFEIfor negative stain EM imaging
Talos Arctica electron microsocopeFEIfor screening and low resolution imaging of Cryo-EM grids
Titan Krios electron microscopeFEIfor high-resolution Cryo-EM imaging
Software
Gautomatch softwarehttp://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/to pick particles from micrographs
Relion 2.1 softwarehttps://github.com/3dem/relionto construct 2D and 3D classification
CryoSPARC softwarehttps://cryosparc.com/to generate an initial structure model
Frealign softwarehttp://grigoriefflab.janelia.org/frealignto refine particles
Coot softwarehttps://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/to build a model
MolProbity softwarehttp://molprobity.biochem.duke.edu/to evaluate the geometries of the atomic model
SerialEM softwarehttp://bio3d.colorado.edu/SerialEM/for automated serial image stack acquisition
MortionCor2 softwarehttp://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.htmlfor motion correction of summed movie stacks
GCTF softwarehttps://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/for measuring defocus values in movie stacks
Phenix.real_space_refine softwarehttps://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.htmlfor real space refinement of the initial 3D model

Ссылки

  1. Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
  2. Kumar, R., Thompson, J. R. The regulation of parathyroid hormone secretion and synthesis. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (2), 216-224 (2011).
  3. Sudhof, T. C. Calcium control of neurotransmitter release. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (1), a011353 (2012).
  4. Ong, H. L., de Souza, L. B., Ambudkar, I. S. Role of TRPC Channels in Store-Operated Calcium Entry. Advances in Experimental Medicine and Biology. 898, 87-109 (2016).
  5. Smyth, J. T., et al. Activation and regulation of store-operated calcium entry. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (10), 2337-2349 (2010).
  6. Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiological Reviews. 95 (4), 1383-1436 (2015).
  7. Liu, X., Singh, B. B., Ambudkar, I. S. TRPC1 is required for functional store-operated Ca2+ channels. Role of acidic amino acid residues in the S5-S6 region. Journal of Biological Chemistry. 278 (13), 11337-11343 (2003).
  8. Zhu, X., Jiang, M., Birnbaumer, L. Receptor-activated Ca2+ influx via human Trp3 stably expressed in human embryonic kidney (HEK)293 cells. Evidence for a non-capacitative Ca2+ entry. Journal of Biological Chemistry. 273 (1), 133-142 (1998).
  9. Zhu, X., et al. trp, a novel mammalian gene family essential for agonist-activated capacitative Ca2+ entry. Cell. 85 (5), 661-671 (1996).
  10. Itsuki, K., et al. Voltage-sensing phosphatase reveals temporal regulation of TRPC3/C6/C7 channels by membrane phosphoinositides. Channels (Austin). 6 (3), 206-209 (2012).
  11. Tang, J., et al. Identification of common binding sites for calmodulin and inositol 1,4,5-trisphosphate receptors on the carboxyl termini of trp channels. Journal of Biological Chemistry. 276 (24), 21303-21310 (2001).
  12. Gonzalez-Cobos, J. C., Trebak, M. TRPC channels in smooth muscle cells. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 15, 1023-1039 (2010).
  13. Li, H. S., Xu, X. Z., Montell, C. Activation of a TRPC3-dependent cation current through the neurotrophin BDNF). Neuron. 24 (1), 261-273 (1999).
  14. Becker, E. B., et al. Candidate screening of the TRPC3 gene in cerebellar ataxia. Cerebellum. 10 (2), 296-299 (2011).
  15. Kitajima, N., et al. TRPC3 positively regulates reactive oxygen species driving maladaptive cardiac remodeling. Scientific Reports. 6, 37001 (2016).
  16. Yang, S. L., Cao, Q., Zhou, K. C., Feng, Y. J., Wang, Y. Z. Transient receptor potential channel C3 contributes to the progression of human ovarian cancer. Oncogene. 28 (10), 1320-1328 (2009).
  17. Oda, K., et al. Transient receptor potential cation 3 channel regulates melanoma proliferation and migration. Journal of Physiological Sciences. 67 (4), 497-505 (2017).
  18. Xia, M., Liu, D., Yao, C. TRPC3: A New Target for Therapeutic Strategies in Chronic Pain-DAG-mediated Activation of Non-selective Cation Currents and Chronic Pain (Mol Pain 2014;10:43). Journal of Neurogastroenterology and Motility. 21 (3), 445-447 (2015).
  19. Fan, C., Choi, W., Sun, W., Du, J., Lu, W. Structure of the human lipid-gated cation channel TRPC3. Elife. 7, e36852 (2018).
  20. Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
  21. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay to identify membrane protein expression and crystallization conditions. Structure (London, England: 1993). 20 (8), 1293-1299 (2012).
  22. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  23. Zhang, K. Gctf: Real-time CTF determination and correction. Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).
  24. Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  25. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  26. Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
  27. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  28. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
  29. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).
  30. Scheres, S. H. W., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature Methods. 9 (9), 853-854 (2012).
  31. Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  32. Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
  33. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 12-21 (2010).
  34. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).
  35. Green, E. M., Au, Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. Journal of Visualized Experiments. (117), e54792 (2016).
  36. Mesa, P., Deniaud, A., Montoya, G., Schaffitzel, C. Directly from the source: endogenous preparations of molecular machines. Current Opinion in Structural Biology. 23 (3), 319-325 (2013).
  37. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane Protein Assembly into Nanodiscs. FEBS letters. 584 (9), 1721-1727 (2010).
  38. Winkler, P. A., Huang, Y., Sun, W., Du, J., Lü, W. Electron cryo-microscopy structure of a human TRPM4 channel. Nature. 552, 200-204 (2017).
  39. Autzen, H. E., et al. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science. 359 (6372), 228-232 (2017).
  40. Guo, J., et al. Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4. Nature. 552 (7684), 205-209 (2017).
  41. Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1860 (2), 378-383 (2018).
  42. Gulati, S., et al. Detergent-free purification of ABC (ATP-binding-cassette) transporters. Biochemical Journal. 461 (2), 269-278 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

143EM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены