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  • Résumé
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  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ce protocole décrit les techniques utilisées pour déterminer les structures de canal d’ion par cryo microscopie électronique, y compris un système baculovirus utilisé pour exprimer efficacement gènes dans des cellules de mammifères avec le minimum d’effort et de toxicité, d’extraction de protéine, de purification, contrôle qualité, préparation des échantillons grille et dépistage, ainsi que collecte de données et traitement.

Résumé

Transient receptor potentiels chaînes (TRPCs) de la sous-famille TRP canonique sont non sélectifs cation qui jouent un rôle essentiel dans l’homéostasie calcique, entrée de calcium particulièrement exploité au magasin, qui est essentielle pour maintenir le bon fonctionnement de la libération des vésicules synaptiques et voies de signalisation intracellulaire. En conséquence, les canaux TRPC ont été impliqués dans une variété de maladies humaines, y compris les troubles cardiovasculaires tels que l’hypertrophie cardiaque, les maladies neurodégénératives comme la maladie de Parkinson et des troubles neurologiques comme l’ataxie spinocérébelleuse. Par conséquent, les canaux TRPC représente une cible pharmacologique potentielle dans les maladies humaines. Cependant, les mécanismes moléculaires de blocage dans ces canaux sont encore peu claires. La difficulté d’obtenir de grandes quantités de protéine purifiée, homogène et stable a été un facteur limitatif dans des études de détermination de structure, notamment pour les protéines de la membrane chez les mammifères tels que les canaux d’ion TRPC. Nous présentons ici un protocole pour l’expression à grande échelle des protéines de membrane de canal ion mammifères à l’aide d’un système de transfert de gènes modifiés baculovirus et la purification de ces protéines par affinité et chromatographie d’exclusion stérique. Nous présentons également un protocole pour recueillir des images de microscopie de cryo-électron de particule de protéine purifiée et d’utiliser ces images pour déterminer la structure des protéines. Détermination de la structure est une méthode puissante pour la compréhension des mécanismes de blocage et de fonction dans les canaux ioniques.

Introduction

Calcium est impliquée dans des processus plus cellulaires, y compris la signalisation des cascades, contrôle de la transcription, la libération des neurotransmetteurs et hormones molécule synthèse1,2,3. Le maintien homéostasie du calcium libre cytosolique est crucial pour la santé et la fonction des cellules. L’un des principaux mécanismes de l’homéostasie du calcium intracellulaire est entrée magasin fonctionnant de calcium (SOCE), un processus dans lequel épuisement du calcium stocké dans le réticulum endoplasmique (re) déclenche l’ouverture des canaux ioniques sur la membrane plasmique pour faciliter la reconstitution du calcium ER, qui peut ensuite être utilisé dans la signalisation plus4,5,6. Canaux des potentiels récepteurs transitoire (TRPCs), qui sont des canaux calcium-perméable appartenant à la super-famille TRP, ont été identifiés comme un acteur majeur dans le SOCE7,8,9 .

Parmi les sept membres de la famille des TRPC, TRPC3, TRPC6 et TRPC7 forment un sous-groupe homologue, et ils sont uniques dans la capacité à être activé par le lipides messager secondaire Diacylglycérol (DAG), un produit de dégradation des lipides signalisation phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2)10,11. TRPC3 est fortement exprimée dans le muscle lisse et dans les régions de cérébrales et cérébelleuses du cerveau, où elle joue un rôle essentiel dans la signalisation calcique qui influent sur la neurotransmission et la neurogenèse12,13. Dysfonctionnement du TRPC3 a été lié à des troubles du système nerveux central, troubles cardio-vasculaires et certains cancers par exemple adénocarcinome ovarien14,15,16. Par conséquent, TRPC3 est prometteuse comme cible pharmaceutique pour le traitement de ces maladies. Le développement de médicaments ciblés agissant sur TRPC3 a été limité par un manque de compréhension de ses mécanismes moléculaires d’activation, y compris les lipides binding sites17,18. Nous avons rapporté la première structure d’atomique-résolution du canal TRPC3 humain (hTRPC3) et ses deux accepteurs lipidique dans l’état closed, fournissant des renseignements importants sur ces mécanismes19.

Le facteur clé pour déterminer la structure d’une protéine de membrane à haute résolution est d’obtenir des protéines de haute qualité. La projection correspondante d’expression et purification des conditions nécessaires à l’obtention de protéines de haute qualité peut être une démarche lente et coûteuse. Nous présentons ici un protocole décrivant en détail comment identifier les conditions optimales d’expression et purification de hTRPC3, qui se comportaient mal dans notre analyse initiale. Nous présentons plusieurs points clés sur la façon de résoudre les problèmes et d’optimiser le comportement de la protéine, qui jeter des bases solides pour nos cryo-électron études en microscopie (cryo-EM). Nous utilisons un baculoviral mis à jour le génération vector (pEG), développé par Gouaux et ses collègues, qui est optimisé pour le dépistage des dosages et génération efficace de baculovirus dans les cellules de mammifères,20. Cette méthode d’expression se trouve rapide et rentable de surexpression de protéines dans la membrane des cellules mammifères. Nous combinons l’utilisation de ce vecteur avec une taille-exclusion-la détection par fluorescence axée sur la chromatographie (FSEC) – présélection méthode21. Cette méthode utilise une balise de la protéine fluorescente verte (GFP) fusionnée à la construction d’intérêt et améliore la visualisation de la protéine cible en échantillons solubilisées petite cellule entière. Cela permet pour le dépistage de la stabilité des protéines en présence de différents détergents et les additifs, les mutations thermostabilizing et permet l’utilisation d’un petit nombre de cellules de transfection transitoire à petite échelle. De cette façon, une multitude de conditions peut subir rapidement avant de passer à une purification de la protéine à grande échelle. La suite expression, criblage et de purification, nous présentons un protocole pour l’obtention et de traitement d’images de cryo-EM pour générer une détermination structurale de novo de la protéine. Nous croyons que les approches décrites ici servira un protocole généralisable pour des études structurales de récepteurs de canal TRP et autres protéines membranaires.

Protocole

1. transformation de DH10α des cellules capables de produire Bacmid ADN

  1. Synthétiser le gène d’intérêt et il subclone dans une version modifiée du vecteur pEG contenant une balise double infection streptococcique, une His8-tag et GFP avec un site de clivage de la thrombine au terminus (pFastBacI) N20.
  2. Transformer des cellules compétentes en ajoutant 5 ng de plasmide contenant un gène désiré en pFastBacI à 50 μL de DH10α les cellules dans un 1,5 mL tube et incuber pendant 10 minutes sur la glace. Chaleur de choc les cellules pour 45 s à 42 ° C. Ajouter 200 μl de bouillon super optimal avec milieu de répresseur catabolique (SOC) dans le tube et laisser incuber pendant 4 à 8 heures à 37 ° C dans un agitateur orbital à 225 t/mn.
  3. Plaque de 5 μl de cellules sur une gélose bacmid LB (50 kanamycine μg/mL, gentamicine μg/mL, 10 μg/mL d’agar, 100 μg/mL Bluo-gal et à 40 μg/mL isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside [IPTG], 7).
  4. Incuber les plaques pendant 48 h à 37 ° C.
    Remarque : Les colonies de taches indicateur Bluo-gal qui expriment encore lacZ (vecteur d’insertion échoue), permettant une sélection des colonies (transformés avec succès) blancs.
  5. Sélectionner avec soin une colonie blanche isolée, en évitant toute colonies blanches qui sont en contact avec les colonies bleues et la croissance de cellules pendant la nuit dans 6 mL de milieu de bacmid LB (50 kanamycine μg/mL, 7 gentamicine μg/mL, tétracycline 10 μg/mL) à 37 ° C dans un agitateur orbital à 225 t/mn.

2. bactérienne préparation pour l’isolement de l’ADN de Bacmid

  1. Pour isoler l’ADN de la bacmid, tournez en bas des cellules d’Escherichia coli pendant 10 min à 2880 x g.
  2. Jeter le surnageant et remettre le culot dans 200 µL de solution remise en suspension cellulaire de la miniprep kit (voir Table des matières) de pipetage. Veillez à ce que la pastille est suspendue totalement et de façon homogène. Ensuite, transférer la suspension cellulaire dans des tubes de 1,5 mL.
  3. Ajouter 200 µL de la solution de lyse cellulaire de la trousse de miniprep et mélanger en retournant le tube quelques fois. Incuber pendant jusqu'à 5 min à température ambiante (RT) à lyser les cellules. Ajouter 200 µL de solution de neutralisation de la trousse de miniprep et mélanger en retournant le tube quelques fois pour arrêter la réaction de lyse.
  4. Tournez vers le bas pendant 10 min à 21 130 g dans une centrifugeuse de table-top. Recueillir 600 μL de surnageant dans un tube de 2 mL. Ajouter 600 μL solution de phénol : chloroforme : isoamylique alcool (voir Table des matières) et mélanger soigneusement pour extraire l’ADN du reste des produits la lyse cellulaire.
    Attention : Solution de phénol : chloroforme : isoamylique alcool est toxique par inhalation, par contact avec la peau et par ingestion. Il peut provoquer des brûlures chimiques et peut-être être cancérigène. Porter des gants et une blouse boutonnée. Travailler sous une hotte. Disposer de ces déchets dangereux convenablement.
  5. Tourner le tube pendant 10 min à 21130 x g dans une centrifugeuse de table-top. Deux phases liquides séparés seront visibles. Transvaser avec soin 300 μL de la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube. Ajouter 600 μL d’éthanol à 100 % pour laver l’ADN. Retourner doucement le tube pour mélanger.
    Remarque : Ne pas vortex, car cela peut de cisaillement bacmid ADN.
  6. Cool tubes en les plaçant dans un congélateur à-20 ° C pendant environ 10 minutes tournent en bas pendant 10 min à 21 130 g dans une centrifugeuse de table-top. Jeter le surnageant et préserver le granule d’ADN.
  7. Ajouter 1 mL d’éthanol à 70 % pour laver le culot. Retourner doucement le tube pour mélanger. Tourner pendant 10 min à 21 130 g dans une centrifugeuse de dessus de table. Jeter le surnageant et permettre le plomb dans l’air sec pendant environ 5 min ou jusqu'à ce qu’aucun liquide n’est visible dans le tube et le culot d’ADN devienne translucide.
  8. Resuspendre le culot sèche dans 50 µL de stérile et sans DNase, de l’eau désionisée. Mesurer la concentration d’ADN.
    Remarque : Ne pas congeler l’ADN bacmid. Conserver à 4 ° C pendant plusieurs jours.

3. la transfection des cellules d’insectes avec Bacmid pour produire P1 Baculovirus Sf9

  1. Semences 0,9 x 106 Sf9 cellules/puits dans 2 mL de milieu approprié (voir la Table des matières) dans chaque puits d’une plaque de culture de tissu de 6 puits. Incuber les cellules à 27 ° C pendant 20 min pour favoriser l’attachement à la plaque.
    Attention : Les cultures cellulaires sont un danger biologique potentiel. Travailler dans une hotte à flux laminaire approuvé stérilement et vérifier les orientations institutionnelles et gouvernementales pour des vêtements de protection recommandés et l’élimination appropriée des déchets avant d’effectuer des expériences.
  2. Après fixation, ajouter 8 µL de réactif de transfection (voir Table des matières) pour 100 µL de médias pour chaque puits de la 6 sur plaque bien être transfectées dans un tube stérile. Ajouter 6 μg de bacmid ADN à 100 µL de milieu dans un tube stérile distinct. Incuber 5 min à RT. combiner les deux solutions et incuber pendant 45 min à température ambiante.
  3. Remplacer le support dans les puits de 6 avec 2 mL de milieu frais. Ajouter le mélange de l’étape précédente pour chaque bien goutte (200 µL / puits). En faisant doucement tourner la plaque pour assurer un mélange de la solution de transfection dans le milieu.
    Remarque : Ne pas agiter ou secouer la plaque car cela provoquerait des cellules détacher.
  4. Incuber pendant 5 jours (120 h), les cellules dans un incubateur humidifié à 27 ° C. Vérifier la fluorescence GFP avant la récolte afin de vérifier que le virus est produit dans un grand pourcentage des cellules ; Si le pourcentage est faible, prolonger le temps d’incubation si nécessaire (voir Figure 1).
  5. Récupérer le surnageant contenant virus de P1 (environ 2 mL de chaque puits). Le support contenant le virus P1 dans des tubes de 2 mL à l’aide d’une seringue de 3 mL et petit 0,2 µm filtre de filtration. Ajouter stérile sérum fœtal (SVF) à une concentration finale de 1 %.
    Remarque : Ce stock de virus P1 doit être conservé à 4 ° C et être protégé de la lumière.

4. l’infection de cellules d’insectes avec P1 Baculovirus pour produire P2 Baculovirus Sf9

  1. Préparer 200 mL (ou volume désiré) de cellules Sf9 à une concentration de 0,8 - 0,9 x 106 cellules/mL dans le milieu approprié (voir la Table des matières) dans un Erlenmeyer de culture fond plat d’une taille suffisante.
    Remarque : Pour la culture en suspension, le volume utilisé ne doit pas dépasser 40 % de la capacité totale du ballon.
  2. Ajouter 1:2500 ratio (v/v) des stocks de virus de P1 de 3,5 à la culture de suspension de cellules Sf9. Incuber pendant le temps d’expression optimale de virus (généralement 48 à 120 h selon la construction de protéine) à 27 ° C dans un agitateur orbital à 115 tr/min.
    Remarque : L’expression relative de virus peut être déterminée en consultant la fluorescence GFP du virus dans un échantillon de la culture.
  3. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 40 min à 11 520 x g et recueillir le surnageant contenant virus de P2. Filtrer le surnageant à l’aide de filtres jetables de µm 0,2. Ajouter FBS à une concentration finale de 0,5 %.
    Remarque : Ce stock de virus P2 doit être conservé à 4 ° C et être protégé de la lumière.
  4. Obtenir un titre pour le virus de P2 à l’aide de cellules Sf9easy ou un compteur de virus.

5. l’infection de cellules de mammifères HEK293 avec P2 Baculovirus pour l’Expression de la protéine à grande échelle

  1. Préparer un volume souhaitable HEK293 mammifères suspension de culture de cellules (4-6 L est recommandé pour la préparation de grilles de gelée) à une concentration de 3,5 à 3,8 x 106 cellules/mL dans le milieu de l’expression (voir Table des matières) additionné de 1 % (v / v) FBS stérile en erlenmeyers dérouté-fond de culture de taille suffisante.
    Remarque : Pour la culture en suspension, le volume utilisé ne doit pas dépasser 40 % du volume total du ballon.
  2. Ajouter 8 % (v/v) de solution mère de virus P2 de l’étape 4.3 à la culture de suspension de cellules HEK293. Incuber à 37 ° C dans un agitateur orbital à 135 tr/min.
  3. Ajouter le butyrate de sodium 10 mM à post-infection 12-18 h. Incuber pendant le temps de l’expression de protéines optimal (généralement de 36 à 72 h) à 30 ° C.
  4. Récolter les cellules par centrifugation pendant 20 min à 2 880 x g. Laver les cellules en resuspendant dans environ 100 mL tampon tris salin (TBS) par litre de cellules prélevées. Centrifuger à nouveau pendant 20 min à 2 880 x g et recueillir le culot cellulaire.
    Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. Boulettes de cellule peuvent être snap-congelés dans l’azote liquide et conservés à-80 ° C jusqu'à la purification.
    Attention : Azote liquide peut causer des brûlures cryogéniques ou des blessures. Il peut provoquer des gelures. Il peut déplacer l’oxygène et provoquer une asphyxie rapide. Porter des gants isolants froids et un écran facial.
  5. Recueillir des récoltes de petits de 1 mL à divers moments et solubiliser pendant 2 h à 4 ° C, avec bascule ou en remuant en présence de différents détergents et/ou additifs. Ces petits échantillons solubilisées germes entiers peuvent être clarifiées par ultracentrifugation à 235 000 × g pendant 10 min à 4 ° C et l’exécuter comme un échantillon de 30 μL sur une colonne de chromatographie d’exclusion stérique (SEC) (voir la Table des matières) pour déterminer le meilleur moment pour l’expression et les meilleures conditions de solubilisation.
    Remarque : Dans le cas de hTRPC3, cet examen comportait différents tampons avec des valeurs de pH de 4,0-9,5 et concentrations salines de 50-500 mM ; différentes compositions ioniques (par exemple MgCl2 ou NaCl) ; différents détergents avec valeurs (CMC) de concentration micellaire critique de 0, 1 - 20 mM ; réduire les additifs tels que le dithiothréitol, tris(2-carboxyethyl) phosphine et β-mercaptoéthanol ; et les chélateurs de calcium acide éthylènediaminetétraacétique additif (EDTA).

6. la purification de la protéine de hTRPC3 du culot cellulaire congelés

  1. Décongeler le culot dans un tampon contenant 20 mM Tris (pH 8,0), 500 mM NaCl, le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) de 1 mM, 0,8 μM aprotinine, 2 μg/mL leupeptine, 2 mM pepstatine A, et 1 % digitonine, à l’aide de 100 mL de tampon par litre de cellules récoltées. Une fois décongelé, garantir l’homogénéité de la solution par la pipette ou l’agitation. Permet de solubiliser pendant 2 h à 4 ° C dans un bécher, plongé dans la glace avec une rotation de bar de remuer.
  2. Enlever les débris cellulaires par ultracentrifugation à 235 000 × g pendant 1 h à 4 ° C. Vérifier la quantité de protéines en exécutant un échantillon de 30 μL sur une colonne de SEC (voir Table des matières) par chromatographie liquide haute performance (HPLC) et visualiser la protéine cible par le signal de sortie GFP.
  3. Incuber la protéine solubilisée (surnageante) avec résine cobalt pendant 1-2 h à 4 ° C. Vérifier la liaison aux protéines de la résine en exécutant un échantillon μL 30 sur une colonne de SEC.
    Remarque : Si la liaison aux protéines est produite, la cible de tagged protéine GFP est retenue sur la colonne, introuvable dans le cheminement. Par conséquent, aucun signal GFP ne sera présent à la position correspondant à la taille de protéine cible lorsque le cheminement est exécuté sur HPLC.
  4. Laver la résine avec 10 volumes de colonne d’un tampon (20 mM Tris, pH 8,0, 500 mM NaCl, imidazole de 15 mM et la digitonine 0,1 %). Vérifier la perte de protéines en exécutant un échantillon μL 30 sur une colonne de SEC.
    Remarque : Si la perte de protéines de la colonne s’est produite, la cible de tagged protéine GFP trouvera dans le tampon de lavage qui s’est écoulé sur la colonne. Par conséquent, signal GFP sera présent à la position correspondant à la taille de protéine cible lorsque le tampon de lavage est exécuté sur HPLC. Si la perte de protéines s’est produite, la concentration de l’imidazole de la mémoire tampon de lavage peut doivent être réduites afin d’éviter de perturber sa liaison de balise à la colonne d’affinité.
  5. Éluer la hTRPC3 résine lié avec un tampon (20 mM Tris, pH 8,0, 500 mM NaCl, imidazole de 250 mM et la digitonine 0,1 %). Ajouter la thrombine à un 01:20 rapport molaire (en conjonction avec la balise GFP) et ajouter 10 mM EDTA (un agent stabilisant hTRPC3) dans l’échantillon éluée et incuber pendant 3 h à 4 ° C. Vérifier que la protéine a été élué en exécutant 90 μL d’un échantillon dilué au 1/100 sur une colonne de SEC et de vérifier la présence d’un signal GFP à la position correspondant à la taille de protéine cible.
    Remarque : À ce stade, le signal de tryptophane de protéine totale dans l’élution peut également être consulté. Seule la protéine-cible purifiés par affinité restera dans l’élution et la GFP et tryptophane signaux seront près identique au profil. Si la protéine cible n’est pas vu en grande quantité dans l’élution mais n’a pas échappée à l’intermédiaire ou le lavage, la protéine est probablement resté liée à la colonne et peut être éluée utilisant une concentration plus élevée de l’imidazole dans la mémoire tampon.
  6. Concentrer l’éluat à 500 μL ou moins dans un filtre centrifuge 15 mL 100K tube (voir Table des matières) en tournant à 2 880 x g à 4 ° C par incréments de 5 min. Remettre en suspension les protéines en pipettant également, la solution de haut en bas entre les spins pour éviter overconcentrating.
    NOTE : Temps de centrifugation peut être raccourcie à l’approche du volume le volume final souhaité.
  7. Charger le concentré sur une colonne de la SEC dans un tampon (20 mM Tris, pH 8,0, 500 mM NaCl, EDTA 1 mM et la digitonine 0,1 %). Exécutez.
  8. Combinez des fractions de pic contenant le tétramère TRPC3 intact, comme visualisées par signal d’absorbance UV et se concentrer à nouveau à une concentration finale d’au moins 5 mg/mL.

7. dépistage de protéine par microscopie électronique de coloration négative

  1. Allumez la machine de décharge luminescente. Configurer le programme pour décharger une grille enduit de carbone à l’aide d’argon et oxygène pour 30 s. exécuter le programme pour faire le revêtement en carbone sur cuivre maille 400 grilles hydrophile avant l’addition de la solution de protéines.
  2. Mis en place cinq 40 μL gouttes d’eau stérile et de gouttes deux 40 μL de solution de formiate d’uranyle de 1 % (sur film lab, papier ciré ou une surface similaire, voir Table des matières). Prenez la grille de l’étape 7.1 et ajouter 2,5 μL de protéine échantillon 5 mg/mL (50-200 μM) sur le côté obscur et laisser reposer pendant 1 min.
  3. Après 1 min, sécher la grille à l’aide de papier filtre. Ne pas toucher le papier filtre directement à la surface de la grille ; au contraire, apporter le papier jusqu’au bord de la goutte liquide et permettre l’action capillaire tirer le liquide de la grille dans le papier filtre.
  4. Tremper la grille dans la première goutte d’eau. Sécher avec du papier filtre et répéter l’opération avec les autres gouttes d’eau et de la première goutte de formiate d’uranyle. Permettre à la deuxième baisse de sit formiate d’uranyle pendant 1 min et puis sécher avec du papier filtre. Laisser entièrement sécher à l’air (environ 1 min) de la grille avant de le ranger.
    Remarque : Ce protocole de coloration n’est peut-être pas idéal pour toutes les combinaisons de protéines-détergent. Différentes concentrations de formiate d’uranyle de tachent et différentes longueurs de temps d’exposition de la tache doivent être testés si les étapes ci-dessus ne permettent pas une tache avec bon contraste.
  5. Les grilles sur un microscope électronique de l’image (voir Table des matières) pour vérifier la qualité de particules de protéines. S’assurer que les micrographies montrent de nombreuses particules qui sont homogènes dans la distribution et l’aspect général, bon contraste de l’écran et correspondre à la taille estimée de la protéine cible.
  6. Générer des préliminaires, les classifications (2D) basse résolution, deux dimensions à l’aide des micrographies de 50-100 (voir étape 10 – traitement des données) pour vérifier que les particules représentent des vues différentes d’une structure cohérente unique.
    Remarque : Les micrographies et préliminaires classes 2D de qualité suffisante, comme décrit ci-dessus, sont un bon indicateur que le protocole a été suffisamment optimisé pour la purification de la protéine. Préparation et contrôle des grilles de cryo-EM est justifiée à ce stade.

8. préparation des échantillons EM

  1. Une grille or holey carbone décharge luminescente (voir Table des matières), comme indiqué au point 7.1.
  2. Appliquer 2,5 μl de l’échantillon de protéines concentré hTRPC3 (5 mg/mL) sur la grille. Épongez la grille à 1. 5 s en utilisant une tache force 1 et un temps d’attente de 5 s à 100 % d’humidité et de 4 ° C, puis plongez la grille éthane liquide refroidie par azote liquide, à l’aide d’une machine de vitrification.
    Remarque : L’humidité, la température, blot-force, tache temps et temps d’attente énumérés ici ont été utilisés pour hTRPC3 étude19 des auteurs. Ils peuvent devoir être modifiés pour produire la glace vitreuse optimale pour d’autres protéines et détergents.
  3. Écran gelé les grilles pour les conditions de glace optimale à l’aide d’un microscope de cryo-EM (voir Table des matières) et manuellement voir régions de glace épaisse (mailles qui apparaissent plus petits et plus foncés), glace (mailles qui apparaissent plus grand et plus lumineux) mince et support de glace .
    NOTE : Glace épaisse tient souvent plus de particules, alors que la glace mince donne souvent de résolution et un meilleur contraste. Les conditions de dépistage manuel utilisation d’images pour déterminer lequel des glaces résultats dans un grand nombre de particules monodisperses avec bon contraste et une résolution. Une fois que les bonnes conditions sont vérifiées, déplacer vers la collection d’images sur un microscope de cryo-EM 300 kV.

9. collecte de données EM

  1. À l’aide d’un programme d’achat automatisé, enregistrer des piles d’image en mode comptage super-résolution avec une taille de pixel jumelées de 1.074 Å sur un microscope électronique fonctionnant à 300 kV avec un grossissement nominal de 130 000 X direct détecteur d’électrons.
  2. Dose-fractionner chaque image à 40 images avec un temps d’exposition totale de 8 s à 0,2 s par trame et un débit de dose de 6.76 e− Å s−2 −1 (valeurs de défocalisation nominal variés de 1,0 à 2,5 μm dans l’expérience des auteurs).

10. EM informatique

  1. Mise en œuvre de la proposition de correction du résumé film piles22 et estimer les valeurs de défocalisation23 en utilisant le logiciel de traitement de données (voir Table des matières)24.
  2. Ramasser les particules de la microscopie. Utilisez-les cueillies de particules pour construire une première classification exempt de référence 2D en utilisant le logiciel24. Sélectionnez classe 2D idéal en moyenne à utiliser comme modèles pour le prélèvement de particules automatisées pour l’ensemble des données.
  3. Vérifier la qualité des particules auto cueillies et enlever les mauvaises particules manuellement. Plusieurs séries de classification 2D permet de nettoyer les particules cueillies.
  4. Générer un modèle initial de25. 2D de l’objet choisi particules en trois dimensions (3D) classification (environ 5 classes), en utilisant la symétrie C1 et un filtre passe-bas de reconstruction initiale de 60 Å comme modèle de référence a. Déterminer quelles classes ont des caractéristiques de haute résolution et combinent des particules à l’intérieur d’une classe.
  5. Affiner les particules à l’aide de l’amélioration locale avec la symétrie de la C4 (dans le cas des hTRPC3) appliqué et une limite haute résolution pour l’alignement des particules fixée à 4,5 Å26.

11. modélisme

  1. Construire un modèle (voir Table des matières pour le logiciel utilisé). Pour hTRPC3, utiliser le domaine transmembranaire (TMD) de la melastatin de potentiel transient receptor 4 (TRPM4) structure protein data bank (PDB) 5wp6 comme un guide27. Utiliser les résidus encombrants et prédiction de structure secondaire pour guider la construction de novo .
  2. Exposez le modèle initial au raffinement de l’espace réel avec contraintes de structure secondaire28. Examiner le modèle raffiné et remodify si nécessaire (voir la Table des matières pour le logiciel utilisé) manuellement.
  3. Appliquer les courbes de corrélation (FSC) de coquille de Fourier pour calculer la différence entre le modèle final et le plan de l’EM pour la validation de la structure raffinée. Évaluer les géométries des modèles atomiques (voir Table des matières pour le logiciel utilisé)29,30.

Résultats

Un aperçu schématique du protocole pour l’expression et purification de hTRPC3 est illustré dans la Figure 1 a. Une image de la plaque de bacmid de hTRPC3 avec les colonies blanches idéales, semblables à celle sélectionnée pour la purification de l’ADN de bacmid, est montrée dans la Figure 1 b. Nous avons constaté que 48 h est idéal pour une coloration claire Bluo-gal tout en maintenant la présence de colonies isol...

Discussion

Détermination de structure des protéines par cryo-EM a révolutionné le domaine de la biologie structurale dans quelques années, grâce au développement d’algorithmes et de nouvelles caméras qui accélère considérablement la détermination de la structure des protéines qui ne sont pas cristalliser facilement, en particulier les protéines membranaires. Malgré tous les progrès récents dans la technique de cryo-EM, la préparation de protéines purifiées suffisantes en qualité et quantité pour faciliter la...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions G. Zhao Meng X. pour le soutien à la collecte de données à la David Van Andel Advanced Cryo-Electron Microscopy Suite. Nous apprécions l’équipe VARI High-Performance Computing pour soutien informatique. Nous donnons notre gratitude à N. Clemente, cotisations D., J. Floramo, Y. Huang, Kim Y., C. Mueller, B. Roth et Z. Ruan aux observations qui ont grandement amélioré ce manuscrit. Nous remercions D. Nadziejka d’aide à la rédaction de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par VARI interne de financement.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
pEG BacMam vector (pFastBacI)addgene31488
DH10α cellsLife Technologies10361-012
S.O.C. mediaCorning46003CRfor transformation of DH10α cells for Bacmid
Bacmam culture platesTeknovaL5919for culture of transformed DH10α cells
Incubation shaker for bacterial cellsInfors HTMultitron standard
Incubated orbital shaker for insect cellsThermo-FisherSHKE8000
Reach-in CO2 incubator for mammalian cellsThermo-Fisher3951
Table-top orbital shakerThermo-FisherSHKE416HPused in Reach-in CO2 incubator for mammalian cells
IncubatorVWR1535for bacterial plates
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106for plasmid extraction and purification
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcoholInvitrogen15593031for DNA extraction
Sf9 cellsLife Technologies12659017insect cells for producing virus
Sf-900 mediaGibco12658-027insect cell media
FBSAtlanta BiologicalsS11550
Cellfectin IIGibco10362100for transfecting insect cells
lipofectamine 2000Invitrogen11668-027for transfecting mamalian cells
0.2 mm syringe filterVWR28145-501for filtering P1 virus
0.2 mm filter flasks 500ml resevoirCorning430758for filtering P2 virus
erlenmeyer culture flask (flat bottom 2L)Gene MateF-5909-2000for culturing insect cells
erlenmeyer culture flask (baffled 2L)Gene MateF-5909-2000Bfor culturing mammalian cells
nanodrop 2000 spectrophotometerThermo-FisherND-2000for determining DNA and protein concentrations
HEK293ATCCCRL-3022mammalian cells for producing protein
Freestyle 293 expression MediumGibco1238-018mammalian cell media for protein expression
Butyric Acid Sodium SaltAcros263195000to amplify protein expression
PMSFAcros215740500protease inhibitor
Aprotinin from bovine lungSigma-AldrichA1153-100MGprotease inhibitor
Leupeptin hydrochlorideSigma-Aldrich24125-16-4protease inhibitor
pepstatin AFisher ScientificBP2671-250protease inhibitor
digitoninEMD Millipore300410detergent - to solubilize protein from membrane
imidazoleSigma792527to elute protein from resin column
TALON resinClonetech635504for affinity purification by His-tag
superose6 incease columnsGE29091596; 29091597for HPLC and FPLC
Prominence Modular HPLC SystemShimadzuSee Below
Controller Module"CBM20A
Solvent Delivery System"LC30AD
Fluorescence Detector"RF20AXS
Autosampler with Cooling"SIL20ACHT
Pure FPLC System with FractionatorAkta
thrombin (alpha)Haematologic Technologies IncorporatedHCT-0020 Human alphafor cleaving GFP tag
Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugal filter tubeMilliporeUFC910008for concentrating protein
EDTAFisherE478500for stabilizing protein
400 mesh carbon-coated copper gridsTed Pella Inc.01754-Fgrids for negative stain
Quantifoil holey carbon grid (gold, 1.2/1.3 μm size/hole space, 300 mesh)Electron Microscopy SciencesQ3100AR1.3grids for Cryo-EM
Vitrobot Mark IIIFEIfor preparing sample grids by liquid ethane freezing
liquid nitrogenDura-CylUN1977
ethane gasAirgasUN1035
Solarus Plasma SystemGatanModel 950for cleaning grids before sample freezing
Tecnai Spirit electron microscopeFEIfor negative stain EM imaging
Talos Arctica electron microsocopeFEIfor screening and low resolution imaging of Cryo-EM grids
Titan Krios electron microscopeFEIfor high-resolution Cryo-EM imaging
Software
Gautomatch softwarehttp://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/to pick particles from micrographs
Relion 2.1 softwarehttps://github.com/3dem/relionto construct 2D and 3D classification
CryoSPARC softwarehttps://cryosparc.com/to generate an initial structure model
Frealign softwarehttp://grigoriefflab.janelia.org/frealignto refine particles
Coot softwarehttps://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/to build a model
MolProbity softwarehttp://molprobity.biochem.duke.edu/to evaluate the geometries of the atomic model
SerialEM softwarehttp://bio3d.colorado.edu/SerialEM/for automated serial image stack acquisition
MortionCor2 softwarehttp://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.htmlfor motion correction of summed movie stacks
GCTF softwarehttps://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/for measuring defocus values in movie stacks
Phenix.real_space_refine softwarehttps://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.htmlfor real space refinement of the initial 3D model

Références

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