Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu iletişim kuralı tarafından cryo-elektron mikroskobu, verimli bir şekilde en az çaba ve toksisite, protein ayıklama, arıtma ile memeli hücrelerinde genlerin ifade etmek için kullanılan bir baculovirus sistemi de dahil olmak üzere iyon kanal yapılarını belirlemek için kullanılan teknikler açıklanır, ve kalite kontrol, örnek kılavuz hazırlık ve tarama, hem de veri toplama ve işleme.

Özet

Geçici reseptör potansiyeli kanal (TRPCs) kurallı TRP Alt familya kalsiyum homeostazı, uygun fonksiyonu korumak açısından çok önemlidir özellikle mağaza işletilen kalsiyum giriş önemli bir rol oynamaktadır nonselective katyon kanalları vardır sinaptik vezikül yayın ve hücre içi sinyal yollar. Buna göre TRPC kanalları insan hastalıkları kalp hipertrofisi gibi kardiyovasküler bozuklukları, Parkinson hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıkları ve spinocerebellar ataksi gibi nörolojik bozukluklar da dahil olmak üzere çeşitli karıştığı olmuştur. Bu nedenle, TRPC kanalları insan hastalıkları bir potansiyel farmakolojik hedefini temsil eder. Ancak, bu kanallar perdeleme moleküler mekanizmaları hala pek açık değildir. İstikrarlı, homojen ve saf protein bol miktarda almak üzere zorluk yapı belirlenmesi çalışmaları, özellikle TRPC iyon kanalları gibi memeli membran proteinlerinin için kısıtlayıcı bir faktör olmuştur. Burada, memeli iyon kanal membran proteinlerinin değiştirilmiş baculovirus Gen aktarım sistemi ve bu proteinlerin saflaştırılması kullanarak benzeşme ve boyutu-dışlama Kromatografi tarafından büyük ölçekli bir ifade için bir iletişim kuralı mevcut. Biz daha da saf protein tek-parçacık cryo-elektron mikroskobu görüntüleri toplamaya ve protein yapısı belirlemek için bu görüntüleri kullanmak için bir iletişim kuralı mevcut. Yapı belirlenmesi çoğunluğuna ve iyon kanalları işlevinde mekanizmaları anlamak için güçlü bir yöntemdir.

Giriş

Kalsiyum cascades, transkripsiyon kontrolü, nörotransmitter yayın ve hormon molekül sentezi1,2,3sinyal de dahil olmak üzere en hücresel süreçler ilişkidedir. Sitozolik ücretsiz kalsiyum homeostatik bakım sağlık ve işlevi hücre için çok önemlidir. Hücre içi kalsiyum homeostazı büyük mekanizmaları biridir kalsiyum deposu ile çalışan giriş (SOCE), kalsiyum tükenmesi içeren endoplazmik retikulum (ER) Tetikleyiciler iyon kanalları açılması kolaylaştırmak için plazma membran üzerinde bir işlem daha sonra daha fazla4,5,6sinyal kullanılabilir ER kalsiyum yenilenmesi. Kalsiyum geçirgen kanalları için TRP süper ait, geçici reseptör potansiyel kanalları (TRPCs), SOCE7,8,9 büyük bir katılımcısı olarak tespit edilmiştir.

TRPC aile yedi üyeleri arasında TRPC3, TRPC6 ve TRPC7 bir homologue alt formu, onlar yetenek lipid ikincil haberci diacylglycerol tarafından (DAG), sinyal lipid bozulması ürünün etkinleştirilmesi için benzersizdir phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2)10,11. TRPC3 son derece düz kas ve nerede12,13neurotransmission ve neurogenesis etkisi kalsiyum sinyal içinde önemli rol oynamaktadır beyin, serebral ve serebellar bölgelerinde ifade edilir. TRPC3 işlev bozukluğu merkezi sinir sistemi bozuklukları, kalp-damar hastalıkları ve bazı kanserler gibi yumurtalık adenokarsinom14,15,16bağlanmıştır. Bu nedenle, TRPC3 bu hastalıkların tedavisi için ilaç hedef olarak söz sahibidir. Özellikle hedeflenen uyuşturucu TRPC3 üzerinde hareket gelişimi lipid bağlama siteleri17,18de dahil olmak üzere onun moleküler harekete geçirmek mekanizmaları anlayış eksikliği tarafından sınırlıdır. Bu mekanizmaları19önemli anlayışlar sağlayan insan TRPC3 kanal (hTRPC3) ve onun iki lipid bağlayıcı siteleri bir kapalı durumda ilk Çözünürlük atomik yapısını bildirdin.

Yüksek çözünürlükte bir membran protein yapısını belirleyen en önemli unsur yüksek kaliteli protein elde etmektir. İfade ve arıtma yüksek kaliteli protein elde etmek gerekli koşullar ilgili tarama zaman alıcı ve pahalı bir çaba olabilir. Burada ayrıntılı olarak nasıl ifade ve kötü davrandım bizim başlangıç tarama hTRPC3 arınma için en uygun koşulları tanımlamak açıklayan bir iletişim kuralı mevcut. Biz sağlam bir temel için bizim cryo-elektron mikroskobu (cryo-EM) çalışmalar yatıyordu protein davranış en iyi duruma getirme ve sorun giderme hakkında birkaç anahtar nokta mevcut. Deneyleri ve verimli baculovirus memeli hücreleri20nesil tarama için en iyi duruma getirilmiş Gouaux ve meslektaşları, tarafından geliştirilen vektör (pEG), üreten bir değiştirilmiş baculoviral kullanıyoruz. Bu ifade Yöntem hızlı ve düşük maliyetli overexpression proteinlerin memeli hücre zarı için uygundur. Biz yöntemi21prescreening kullanımı ile bir floresan-algılama boyutu-dışlama Kromatografi tabanlı bu vektör (FSEC) birleştirmek. Bu yöntem faiz yapısı için erimiş bir yeşil flüoresan protein (GFP) etiketini kullanır ve küçük, tüm hücreli çözündürüldükten örneklerinde hedef proteinin görselleştirme geliştirir. Bu farklı deterjanlar ve katkı maddeleri ile thermostabilizing mutasyonlar, protein istikrar testi ile taranması için izin verir ve küçük ölçekli geçici transfection hücrelerden az sayıda kullanımına izin verir. Bu şekilde, koşullar çok sayıda hızla bir büyük ölçekli protein saflaştırma taşımadan önce taramaya tabi. İfade, filtreleme ve arıtma biz elde etmek ve bir de novo yapısal kararlılık protein oluşturmak için cryo-EM görüntüleri işlemek için kullanılan bir iletişim kuralı mevcut. Biz burada açıklanan yaklaşımlar için TRP kanal reseptörleri ve diğer membran proteinlerinin yapısal çalışmaların genelleştirilebilir bir iletişim kuralı işlevi görecek inanıyorum.

Protokol

1. DH10α yetkili hücreleri Bacmid DNA üretmek için dönüştürme

  1. Faiz gen sentez ve bir ikiz strep etiketi, His8 etiketi ve GFP Trombin bölünme sitesiyle N terminus (pFastBacI)20içeren pEG vektör değiştirilmiş bir sürümü içine subclone.
  2. Yetkili hücreleri 5 ekleyerek dönüştürmek pFastBacI hücreleri 1,5 ml tüp ve buz üzerinde 10 min için kuluçkaya DH10α 50 μL için istenen bir gen içeren plazmid ng. Isı şok 45 için hücreleri 42 ° C'de s 4-8 h bir orbital çalkalayıcı 225 rpm'de 37 ° C'de için kuluçkaya ve katabolik önleyici (SOC) orta ile süper en iyi suyu 200 μL tüp ekleyin.
  3. Hücre bacmid LB agar tabakta (50 μg/mL sefaloridin, 7 μg/mL gentamisin, 10 μg/mL tetrasiklin, 100 μg/mL Bluo-gal ve 40 μg/mL izopropil β-D-1-thiogalactopyranoside [IPTG], agar) 5 μL plaka.
  4. 37 ° C'de 48 h plaka kuluçkaya
    Not: hala lacZ (vektör ekleme başarısız), ifade eden Bluo-gal göstergesi lekeleri kolonileri beyaz (başarıyla dönüştürülen) koloniler seçimi için izin.
  5. Herhangi bir beyaz kolonileri mavi koloniler ile temas halinde olan ve geceleme bir orbital çalkalayıcı 225 rpm'de 37 ° C'de bacmid LB Orta (50 μg/mL sefaloridin, 7 μg/mL gentamisin, 10 μg/mL tetrasiklin) 6 mL hücrelerin büyümesine kaçınarak izole bir beyaz kolonisi seçerken dikkat.

2. bakteriyel hazırlık Bacmid DNA izolasyonu için

  1. Bacmid DNA izole etmek için spin Escherichia coli hücreler 2880 x g, 10 min için aşağı.
  2. Atma süpernatant ve resuspend 200 µL Pelet hücre resuspension eriyik--dan miniprep ( Tablo malzemelerigörmek) pipetting tarafından kit. Pelet tam ve homojen askıya alınır emin olun. Ardından, hücre süspansiyon 1,5 mL tüpler içine aktarın.
  3. Hücre lizis çözüm 200 µL miniprep kit birkaç kez tüp ters çevirme tarafından ekleyip karıştırın. 5 dakikaya kadar oda sıcaklığında (RT) hücreleri parçalayıcı için kuluçkaya. Nötralizasyon çözüm 200 µL miniprep kit birkaç kez tüp ters çevirme tarafından ekleyip karıştırın lizis reaksiyonu durdurmak için.
  4. Spin aşağı 10 dk 21,130 x g Masa Üstü Santrifüj az için. 2 mL tüp içinde süpernatant ile 600 μL toplamak. 600 μL fenol: kloroform: izoamil alkol çözümü ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) ve karışımı iyice DNA hücre lizis ürünlerin geri kalanı ayıklamak için.
    Dikkat: Fenol: kloroform: izoamil alkol çözüm toksik Solunduğunda, cilt ile temasında ve yutulduğunda. Bu kimyasal yanıklara neden ve kanserojen olabilir. Eldiven ve düğmeli laboratuar önlüğünü giy. Bir duman mahallede çalışıyorum. Bu tehlikeli atıklar uygun şekilde atın.
  5. Masa Üstü Santrifüj 21130 x g , 10 min için tüp spin. İki ayrı sıvı bölüm görünür. Dikkatle 300 μL üst sulu faz için yeni bir tüp aktarın. DNA yıkamak için % 100 etanol 600 μL ekleyin. Mix tüpü yavaşça tersine çevirin.
    Not: Bu bacmid DNA yamultabilirsiniz değil girdap, yap.
  6. -20 ° C-dondurucu 10 dakika süreyle yerleştirerek serin tüpler iyi Spin aşağı 10 dk 21,130 x g Masa Üstü Santrifüj az için. Süpernatant atın ve DNA Pelet korumak.
  7. 1 mL % 70 etanol Pelet yıkamak için ekleyin. Mix tüpü yavaşça tersine çevirin. Masa Üstü Santrifüj 21,130 x g , 10 min için spin. Süpernatant atın ve Pelet yayına kadar hiçbir sıvı tüp içinde görünür ve DNA Pelet yarı saydam hale gelir yaklaşık 5 min için veya kuru izin.
  8. Kuru Pelet steril, DNaz ücretsiz 50 µL resuspend, deiyonize su. DNA toplama ölçmek.
    Not: bacmid DNA dondurma değil. 4 ° C'de için birkaç gün kadar saklayın.

3. P1 Baculovirus üretmek için Bacmid ile Sf9 böcek hücrelerinin transfection

  1. Tohum 0,9 x 106 Sf9 hücreler/iyi uygun orta 2 ml ( Tablo malzemelerigörmek) 6-iyi doku kültürü plaka her şey içinde. Plaka eki tanıtmak 20 dk 27 ° C'de hücreler kuluçkaya.
    Dikkat: Potansiyel bir biohazard hücre kültürleri vardır. Aseptik teknikler kullanarak bir onaylanmış laminar akış mahallede çalışma ve önerilen koruyucu ve uygun deneyler gerçekleştirmeden önce atık bertarafı için kurumsal ve toplum kuralları kontrol edin.
  2. Ek sonra transfection reaktif 8 µL eklemek ( Tablo malzemelerigörmek) plaka medya her şey 6 için 100 µL için de steril bir tüp içinde transfected. Bacmid DNA 6 μg orta ayrı steril tüp içinde 100 µL ekleyin. RT birleştirin iki çözümleri de 5 dk kuluçkaya ve RT. adlı 45 dk için kuluçkaya
  3. 6 Wells Orta 2 mL taze orta ile değiştirin. Karışım önceki adımı her şey dropwise ekleyin (iyi başına 200 µL). Yavaşça transfection çözümü Orta karıştırma sağlamak için plaka rock.
    Not: Girdap değil veya bu hücreler ayırmak neden olur çünkü plaka sallamak.
  4. Hücreler için 5 d (120 saat) 27 ° C oksijen kuluçka makinesine kuluçkaya. Bu virüs hücreleri büyük bir yüzdesi üretilen doğrulamak için hasat önce GFP floresans kontrol edin; yüzde düşükse, gerekli kuluçka süresini uzatmak (bkz. Şekil 1 c).
  5. Süpernatant içeren P1 virüs (yaklaşık her kuyudan 2 mL) toplamak. 3 mL şırınga ve küçük 0.2 µm filtresi kullanarak 2 mL tüpler içine P1 virüs içeren orta filtre. Steril fetal Sığır serum (FBS) % 1'i son bir konsantrasyon için ekleyin.
    Not: Bu stok P1 şunun 4 ° C'de muhafaza edilmelidir ve ışıktan korunmalıdır.

4. enfeksiyon P1 P2 Baculovirus üretmek için Baculovirus ile Sf9 böcek hücrelerinin

  1. 200 mL (veya istediğiniz birimi) Sf9 hücre, bir konsantrasyon 0,8 - 0,9 x 106 hücre/mL uygun ortamda hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek) bir düz dipli Erlenmeyer kültür şişesi, yeterli boyuta içinde.
    Not: süspansiyon kültürü için kullanılan birim şişeye toplam kapasitesi % 40'ını geçmemelidir.
  2. 1: 2500 oranı (v/v) P1 virüs stokunun 3.5 Sf9 hücre süspansiyon kültürü için ekleyin. Orbital çalkalayıcı 115 rpm'de 27 ° C'de en iyi virüs ifade (genellikle bağlı olarak protein yapı 48-120 h) kez kuluçkaya.
    Not: Kültür örneği içinde virüsün GFP floresans görüntüleyerek göreli virüs ifade belirlenebilir.
  3. Hücre süspansiyon 11,520 x g de 40 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant içeren P2 virüs toplamak. Tek kullanımlık 0.2 µm filtreleri kullanarak süpernatant filtre. FBS % 0.5 son bir konsantrasyon için ekleyin.
    Not: Bu stok P2 şunun 4 ° C'de muhafaza edilmelidir ve ışıktan korunmalıdır.
  4. Sf9easy hücreleri veya bir virüs karşı kullanarak P2 virüs için bir titresi elde edilir.

5. enfeksiyon P2 Baculovirus büyük ölçekli Protein ifade ile HEK293 memeli hücrelerinin

  1. Arzu hacmi 3.5 3.8 x konsantrasyon HEK293 memeli hücre süspansiyon Kültür (4-6 L donmuş ızgaralar hazırlanması için önerilir) hazırlamak 106 hücre/mL ifade orta %1 ile desteklenmiş ( Tablo malzemelerigörmek) (v / v) steril FBS şaşkın-alt Erlenmeyer kültür şişeler, yeterli boyuta içinde.
    Not: süspansiyon kültürü için kullanılan birim şişeye hacmi % 40'ını geçmemelidir.
  2. % 8'i (v/v) P2 virüs hisse senedi eriyik--dan adım 4.3 HEK293 hücre süspansiyon kültürü için ekleyin. Orbital çalkalayıcı 135 rpm'de 37 ° C'de kuluçkaya.
  3. 10 mM sodyum bütrat 12-18 h sonrası enfeksiyon ekleyin. En iyi protein ifade (genellikle 36-72 h) 30 ° C'de kez kuluçkaya
  4. Hücreleri 2.880 x gde 20 dakika centrifuging tarafından hasat. Hücrelerin içinde yaklaşık 100 mL tris arabelleğe alınmış serum fizyolojik (TBS) hücre hasat litre başına resuspending yıkayın. Tekrar 2.880 x g de 20 dk santrifüj kapasitesi ve hücre Pelet toplamak.
    Not: Protokol burada duraklatılmış. Hücre topakları ek donmuş sıvı azot ve-80 ° C'de arıtma kadar saklanır.
    Dikkat: Sıvı azot kriyojenik yanık veya yaralanmalara neden olabilir. Donmalara neden olabilir. Oksijen yerinden ve hızlı boğulmasına neden olabilir. Soğuk ısı yalıtım eldiven ve yüz kalkan giyin.
  5. Küçük 1 mL hasat değişen zaman noktalarda toplamak ve sallanan veya farklı deterjanlar ve/veya katkı maddeleri huzurunda karıştırma ile 4 ° c 2 h için solubilize. Bu küçük bütün hücreli solubilized örnekler ultrasantrifüj 235,000 × g 10 dk 4 ° C ve çalışma için de tarafından 30 μL örnek boyutu-dışlama Kromatografi (sn) sütun olarak açıklık (bakınız Tablo reçetesiiçin en iyi zaman belirlemek için) ifade ve en iyi solubilization koşulları.
    Not: hTRPC3 söz konusu olduğunda, bu tarama pH değerleri ile farklı arabelleklerinden 4.0-9.5 ve 50-500 mM tuz konsantrasyonları dahil; farklı iyonik besteleri (örneğin, MgCl2 veya NaCl); farklı deterjanlar kritik micelle konsantrasyonu (CMC) değerleri 0.1 - 20 mM ile; dithiothreitol gibi katkı maddeleri azaltarak tris(2-carboxyethyl) fosfamin ve β-mercaptoethanol; ve kalsiyum şelat katkı ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA).

6. dondurulmuş hücre Pelet hTRPC3 Protein Saflaştırma

  1. 500 mM NaCl, 1 mM phenylmethylsulfonyl florür (PMSF), 0.8 mikron aprotinin, 2 μg/mL leupeptin, 2 mM pepstatin A, 20 mM Tris (pH 8.0), içeren arabellekte Pelet çözülme ve % 1'digitonin, 100 mL hücreleri litre başına arabellek kullanarak hasat. Çözdürülen sonra çözüm polimerlerin pipetting veya karıştırma kontrol edin. Buz bir heyecan bar dönen dalmış bir ölçek 4 ° C'de 2 h için solubilize olanak sağlar.
  2. Ultrasantrifüj 235,000 × g 4 ° C'de 1 h için de hücre artıkları çıkarın Protein miktarı 30 μL örnek bir sn sütun üzerinde çalıştırarak doğrulayın (bkz. Tablo reçetesi) yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) tarafından ve hedef protein GFP sinyal çıkış tarafından görselleştirmek.
  3. Solubilized protein ile kobalt benzeşme reçine için 1-2 h 4 ° C'de (süpernatant) kuluçkaya Protein bağlayıcı reçine için 30 μL örnek bir sn sütun üzerinde çalıştırarak doğrulayın.
    Not: protein bağlayıcı oluştuysa, GFP tagged protein hedef sütun akış-aracılığıyla bulunamadı, muhafaza edilecektir. Bu nedenle, GFP sinyal akışı aracılığıyla HPLC üzerinde çalıştırıldığında hedef protein boyutuna karşılık gelen pozisyonda mevcut olacak.
  4. Reçine arabellek (20 mM Tris, pH 8.0, 500 mM NaCl, 15 mM imidazole ve %0,1 digitonin) 10 sütun hacimleri ile yıkayın. Protein kaybı için 30 μL örnek bir sn sütun üzerinde çalıştırarak denetlemek.
    Not: sütun protein kaybı oluştuysa, GFP tagged protein hedef sütun üzerinde geçti yıkama arabellek bulunur. Bu nedenle, GFP sinyal yıkama arabellek HPLC üzerinde çalıştırdığınızda hedef protein boyutuna karşılık gelen pozisyonda mevcut olacak. Protein kaybı oluştuysa, yıkama arabellek imidazole konsantrasyon onun etiket bağlama benzeşme sütuna engellemeden önlemek için indirdi gerekebilir.
  5. Reçine bağlı hTRPC3 arabellek (20 mM Tris, pH 8.0, 500 mM NaCl, 250 mM imidazole ve %0,1 digitonin) ile elute. 1:20 at Trombin eklemek (GFP etiketi ayırmak için) molar oranı ve 10 mM EDTA (bir hTRPC3 teskin Ajan) eluted örnek eklemek ve 4 ° C'de 3 h için kuluçkaya Protein 90 μL örnek seyreltilmiş 1: 100 bir sn sütun üzerinde çalıştırıp konumundaki hedef protein boyutuna karşılık gelen bir GFP sinyal varlığını doğrulama eluted kontrol edin.
    Not: Bu noktada, elüsyon toplam protein triptofan sinyalini da görüntülenebilir. Yalnızca hedef benzeşme saf protein elüsyon ve GFP kalır ve triptofan sinyalleri olacak profilde aynı yakınındaki. Hedef protein elüsyon büyük miktarda görmedim ama akış yoluyla veya yıkama kayboldu değil, protein büyük olasılıkla sütuna bağlı kalmıştır ve imidazole daha yüksek bir konsantrasyon içinde belgili tanımlık tampon kullanarak eluted.
  6. Eluate 500 μL için konsantre veya 2.880 x g 5 dk aralıklarla 4 ° C'de de iplik tarafından ( Tablo malzemelerigörmek) tüp daha az 15 mL 100K santrifüj filtre. Protein çözüm yukarı ve aşağı spin arasında overconcentrating önlemek için pipetting tarafından resuspend.
    Not: birim istenen son hacim yaklaşırken santrifüj süre kısalabilir.
  7. Konsantre bir sn sütuna arabelleği (20 mM Tris, pH 8.0, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA ve %0,1 digitonin) yükleyin. Çalıştırın.
  8. Tepe kesirler olarak görüntülenmeyecektir UV absorbans sinyal, bozulmamış TRPC3 tetramer içeren birleştirin ve yine en az 5 mg/mL nihai bir konsantrasyon için konsantre.

7. Protein negatif-leke elektron mikroskobu tarafından taranması

  1. Parlaklık-deşarj makinede açın. Argon ve oksijen için 30 s. Çalıştır'ı kullanarak bir karbon kaplı ızgara boşaltma için program karbon kaplama bakır 400-kafes ızgaralar üzerinde hidrofilik protein çözüm eklenmesi önce yapmak için program ayarla.
  2. Steril su damlaları beş 40 μL ve iki 40 μL damla % 1 uranyl Format çözüm ayarlamak (Laboratuvar film, yağlı kâğıt veya benzer bir yüzey üzerinde Tablo malzemelerigörmek). Adım 7.1 kılavuz almak ve protein 2.5 μL örnek 5 mg/mL (50-200 mikron) karanlık yüzü ekleyin ve 1 dakika oturmak izin.
  3. 1 dakika sonra filtre kağıdı kullanarak kılavuz kuru. Filtre kağıdı doğrudan kılavuz yüzeye dokunmayın; Bunun yerine, kağıdın sıvı damlacık kenarının üzerine getirin ve kılcal filtre kağıt halinde ızgarayı sıvıdan çekmeye eyleme izin.
  4. Kılavuz ilk damla su daldırma. Filtre kağıdı ile Kuru ve kalan su damlaları ve uranyl format ilk damla ile yineleyin. Uranyl Format sit 1 dk. için ikinci damla izin ve filtre kağıdı ile kuru. Tam hava kuru (yaklaşık 1 dakika) kılavuzuna depolamadan önce izin.
    Not: Bu boyama iletişim kuralı tüm protein-deterjan birleşimler için ideal olmayabilir. Uranyl Format farklı konsantrasyonlarda leke ve yukarıdaki adımları bir leke iyi kontrasta sahip belirtmediğiniz takdirde zaman leke pozlama için farklı uzunlukları test edilmelidir.
  5. Izgaralar üzerinde bir elektron mikroskobu Image (protein parçacık kalite kontrol etmek için Malzemeler tablobkz:). Filmler genel görünüş ve dağıtım homojen çok sayıda parçacıklar göstermek emin olun, iyi kontrast görüntülemek ve öngörülen hedef protein uygun.
  6. Düşük çözünürlüklü, iki boyutlu (2D) sınıflandırmalar parçacıklar bu kontrol etmek için (bkz: veri işleme-adım 10) 50-100 filmler kullanarak tek bir tutarlı yapısı farklı görüşlerini temsil, ön oluşturur.
    Not: Filmler ve yukarıda açıklanan protokol yeterince protein arıtma için getirilmiş güçlü bir göstergesi olarak yeterli kalite ön 2D sınıfları. Hazırlık ve cryo-EM ızgaralar testi ile taranması bu noktada garanti.

8. EM numune hazırlama

  1. Parlaklık-altın delikli karbon kılavuz debi (7.1 adımda anlatıldığı gibi Malzemeler tablobakınız).
  2. Izgara üzerine konsantre hTRPC3 protein örneği (5 mg/mL) 2.5 μL uygulanır. 1,5 için kılavuz leke s bir leke kullanarak Kuvvetleri 1 ve 5 bir bekleme süresi %100 nem ve 4 ° C, s sonra içine sıvı etan vitrifikasyon makinasıyla sıvı nitrojen tarafından soğutmalı kılavuz Dalma.
    Not: Nem, sıcaklık, leke-force, leke saat ve bekleme süresi burada listelenen yazarların hTRPC3 çalışma19için kullanılmıştır. Onlar diğer proteinler ve deterjanlar için en uygun vitreus buz üretmek için değiştirilmesi gerekebilir.
  3. Cryo-EM mikroskop kullanarak en iyi buz koşulları için Izgaralar donmuş ekran ( Tablo malzemelerigörmek) ve el ile buz kalın buz (daha küçük ve daha koyu görünen kılavuz kareler) bölgelerinde ince buzun (daha büyük ve parlak görünür kılavuz kareler) görünümü ve orta .
    Not: ince buz kez daha iyi kontrast ve çözünürlük verir iken kalın buz kez daha fazla parçacıkları taşıyabilir. Kullanım el ile tarama hangi buz belirlemek görüntülerin sonuçlarında monodispersed parçacıklar iyi kontrast ve çözünürlük ile çok sayıda koşulları. Bir kez iyi koşullar doğrulanır, resim koleksiyonu için 300 kV cryo-EM mikroskop üzerinde hareket.

9. EM veri toplama

  1. Bir otomatik satın alma programı kullanarak, Süper çözünürlük sayım modu 1.074 dönüştüm piksel boyutunda görüntü yığınları kaydetmek Å bir elektron mikroskobu üzerinde 300 işletilen kV 130.000 X nominal bir büyütme ile doğrudan elektron dedektörü.
  2. Her görüntü 8 toplam çekim hızı ile 40 karelere doz fractionate s, 0,2 ile çerçeve ve 6,76 e− Å−2 s– 1 (1.0'dan yazarların deneyinde 2,5 μm kalınlığında çeşitli nominal odak değerleri) doz hızı başına s.

10. EM veri işleme

  1. Uygulamak düzeltilmesi özetlenebilir film yığınları22 hareket ve odak değerleri veri işleme yazılımı kullanarak23 tahmin (bakınız Tablo reçetesi)24.
  2. Filmler parçacıkları seç. Bu parçacıklar aldı yazılım24kullanarak bir ilk başvuru ücretsiz 2D sınıflandırma oluşturmak için kullanın. Tüm veri kümesi için otomatik parçacık malzeme çekme için şablon olarak kullanmak için seçin ideal 2D sınıf ortalamaları.
  3. El ile otomatik aldı parçacıklar kalitesini kontrol ve kötü parçacıklar kaldırın. 2D sınıflandırma birden fazla mermi kadar çekilen parçacıklar temizlemek için kullanın.
  4. Bir başlangıç modeli25oluşturur. Konu 2D parçacıklar C1 simetri ve bir ilk imar alçak geçiren filtre 60 Å a başvuru model olarak kullanarak üç boyutlu (3D) sınıflandırma (yaklaşık 5 sınıflar) için aldım. Hangi sınıfların yüksek çözünürlüklü özelliklere sahip ve parçacıklar böyle bir sınıf içinde birleştirmek belirler.
  5. C4 simetri ile (hTRPC3) durumunda uygulanan yerel arıtma kullanarak parçacıkları daha da geliştirmek ve parçacık hizalama için yüksek çözünürlüklü bir sınır Å264.5'e ayarlayın.

11. model kurma

  1. Bir model oluşturmak ( Tablo malzemeler kullanılan yazılımlar için bakınız). HTRPC3 için transmembran etki alanı (TMD) geçici reseptör potansiyel melastatin 4 (TRPM4) kullanın yapısı protein veri Bankası (PDB) 5wp6 bir rehber27olarak. Hantal artıkları ve ikincil yapı tahmini de novo bina yol göstermesi için kullanın.
  2. Konu gerçek uzay arıtma ikincil yapı bağlar28ile ilk modeli. El ile rafine modeli inceleyin ve ( Tablo malzemeleri kullanılan yazılımlar için görmek) gerektiği gibi remodify.
  3. Fourier kabuk korelasyon (FSC) eğrileri son modelinde ve rafine yapısının doğrulama için EM harita arasındaki farkı hesaplamak için geçerlidir. (Bkz: Malzemeler tablo için kullanılan yazılım) atom modelleri geometrileri değerlendirmek29,30.

Sonuçlar

İfade için protokol şematik bir bakış ve hTRPC3 arınma Şekil 1Aile gösterilir. Bir resim hTRPC3 bacmid plaka ile ideal beyaz koloniler, benzer bir bacmid DNA arıtma için seçili Şekil 1Badımında gösterilir. Bulduğumuz o 48 saat açık Bluo-gal izole kolonileri varlığını koruyarak boyama için idealdir. P2 virüs olarak görüntülenmeyecektir GFP floresan tarafından hTRPC3 için en yüksek üretimi 4 d Sf9 bö...

Tartışmalar

Yapısal proteinler cryo-EM tarafından belirlenmesi önemli ölçüde hızlandırır kadar değil protein yapısı belirlenmesi yeni kameralar ve algoritmaları geliştirilmesi sayesinde son birkaç yıl içinde yapısal biyoloji alanında devrim yarattı kolayca kristal, özellikle membran proteinlerinin. Tüm cryo-EM tekniği son gelişmeler rağmen yüksek kaliteli kez Imaging kolaylaştırmak için hazırlık saf protein kalite ve miktar yeterli zaman alıcı, masraflı ve zorlu kalır. Hızlı bir şekilde ifade et...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Biz G. Zhao ve X. Meng desteği ile David Van Andel Advanced Cryo-elektron mikroskobu Suite, veri toplama için teşekkür ederiz. VARI yüksek performanslı bilgi işlem takım Hesaplamalı destek için teşekkür ederiz. Bu el yazması büyük ölçüde geliştirilmiş Yorumlar için minnettarlığımızı i. Clemente, ö. aidat, J. Floramo, Y. Huang, Y. Kim, C. Mueller, B. Roth ve Z. Ruan ver. Biz ö Nadziejka bu el yazması için editoryal destek için teşekkür ederiz. Bu eser iç VARI tarafından desteklenen fon.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
pEG BacMam vector (pFastBacI)addgene31488
DH10α cellsLife Technologies10361-012
S.O.C. mediaCorning46003CRfor transformation of DH10α cells for Bacmid
Bacmam culture platesTeknovaL5919for culture of transformed DH10α cells
Incubation shaker for bacterial cellsInfors HTMultitron standard
Incubated orbital shaker for insect cellsThermo-FisherSHKE8000
Reach-in CO2 incubator for mammalian cellsThermo-Fisher3951
Table-top orbital shakerThermo-FisherSHKE416HPused in Reach-in CO2 incubator for mammalian cells
IncubatorVWR1535for bacterial plates
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106for plasmid extraction and purification
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcoholInvitrogen15593031for DNA extraction
Sf9 cellsLife Technologies12659017insect cells for producing virus
Sf-900 mediaGibco12658-027insect cell media
FBSAtlanta BiologicalsS11550
Cellfectin IIGibco10362100for transfecting insect cells
lipofectamine 2000Invitrogen11668-027for transfecting mamalian cells
0.2 mm syringe filterVWR28145-501for filtering P1 virus
0.2 mm filter flasks 500ml resevoirCorning430758for filtering P2 virus
erlenmeyer culture flask (flat bottom 2L)Gene MateF-5909-2000for culturing insect cells
erlenmeyer culture flask (baffled 2L)Gene MateF-5909-2000Bfor culturing mammalian cells
nanodrop 2000 spectrophotometerThermo-FisherND-2000for determining DNA and protein concentrations
HEK293ATCCCRL-3022mammalian cells for producing protein
Freestyle 293 expression MediumGibco1238-018mammalian cell media for protein expression
Butyric Acid Sodium SaltAcros263195000to amplify protein expression
PMSFAcros215740500protease inhibitor
Aprotinin from bovine lungSigma-AldrichA1153-100MGprotease inhibitor
Leupeptin hydrochlorideSigma-Aldrich24125-16-4protease inhibitor
pepstatin AFisher ScientificBP2671-250protease inhibitor
digitoninEMD Millipore300410detergent - to solubilize protein from membrane
imidazoleSigma792527to elute protein from resin column
TALON resinClonetech635504for affinity purification by His-tag
superose6 incease columnsGE29091596; 29091597for HPLC and FPLC
Prominence Modular HPLC SystemShimadzuSee Below
Controller Module"CBM20A
Solvent Delivery System"LC30AD
Fluorescence Detector"RF20AXS
Autosampler with Cooling"SIL20ACHT
Pure FPLC System with FractionatorAkta
thrombin (alpha)Haematologic Technologies IncorporatedHCT-0020 Human alphafor cleaving GFP tag
Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugal filter tubeMilliporeUFC910008for concentrating protein
EDTAFisherE478500for stabilizing protein
400 mesh carbon-coated copper gridsTed Pella Inc.01754-Fgrids for negative stain
Quantifoil holey carbon grid (gold, 1.2/1.3 μm size/hole space, 300 mesh)Electron Microscopy SciencesQ3100AR1.3grids for Cryo-EM
Vitrobot Mark IIIFEIfor preparing sample grids by liquid ethane freezing
liquid nitrogenDura-CylUN1977
ethane gasAirgasUN1035
Solarus Plasma SystemGatanModel 950for cleaning grids before sample freezing
Tecnai Spirit electron microscopeFEIfor negative stain EM imaging
Talos Arctica electron microsocopeFEIfor screening and low resolution imaging of Cryo-EM grids
Titan Krios electron microscopeFEIfor high-resolution Cryo-EM imaging
Software
Gautomatch softwarehttp://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/to pick particles from micrographs
Relion 2.1 softwarehttps://github.com/3dem/relionto construct 2D and 3D classification
CryoSPARC softwarehttps://cryosparc.com/to generate an initial structure model
Frealign softwarehttp://grigoriefflab.janelia.org/frealignto refine particles
Coot softwarehttps://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/to build a model
MolProbity softwarehttp://molprobity.biochem.duke.edu/to evaluate the geometries of the atomic model
SerialEM softwarehttp://bio3d.colorado.edu/SerialEM/for automated serial image stack acquisition
MortionCor2 softwarehttp://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.htmlfor motion correction of summed movie stacks
GCTF softwarehttps://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/for measuring defocus values in movie stacks
Phenix.real_space_refine softwarehttps://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.htmlfor real space refinement of the initial 3D model

Referanslar

  1. Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
  2. Kumar, R., Thompson, J. R. The regulation of parathyroid hormone secretion and synthesis. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (2), 216-224 (2011).
  3. Sudhof, T. C. Calcium control of neurotransmitter release. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (1), a011353 (2012).
  4. Ong, H. L., de Souza, L. B., Ambudkar, I. S. Role of TRPC Channels in Store-Operated Calcium Entry. Advances in Experimental Medicine and Biology. 898, 87-109 (2016).
  5. Smyth, J. T., et al. Activation and regulation of store-operated calcium entry. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (10), 2337-2349 (2010).
  6. Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiological Reviews. 95 (4), 1383-1436 (2015).
  7. Liu, X., Singh, B. B., Ambudkar, I. S. TRPC1 is required for functional store-operated Ca2+ channels. Role of acidic amino acid residues in the S5-S6 region. Journal of Biological Chemistry. 278 (13), 11337-11343 (2003).
  8. Zhu, X., Jiang, M., Birnbaumer, L. Receptor-activated Ca2+ influx via human Trp3 stably expressed in human embryonic kidney (HEK)293 cells. Evidence for a non-capacitative Ca2+ entry. Journal of Biological Chemistry. 273 (1), 133-142 (1998).
  9. Zhu, X., et al. trp, a novel mammalian gene family essential for agonist-activated capacitative Ca2+ entry. Cell. 85 (5), 661-671 (1996).
  10. Itsuki, K., et al. Voltage-sensing phosphatase reveals temporal regulation of TRPC3/C6/C7 channels by membrane phosphoinositides. Channels (Austin). 6 (3), 206-209 (2012).
  11. Tang, J., et al. Identification of common binding sites for calmodulin and inositol 1,4,5-trisphosphate receptors on the carboxyl termini of trp channels. Journal of Biological Chemistry. 276 (24), 21303-21310 (2001).
  12. Gonzalez-Cobos, J. C., Trebak, M. TRPC channels in smooth muscle cells. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 15, 1023-1039 (2010).
  13. Li, H. S., Xu, X. Z., Montell, C. Activation of a TRPC3-dependent cation current through the neurotrophin BDNF). Neuron. 24 (1), 261-273 (1999).
  14. Becker, E. B., et al. Candidate screening of the TRPC3 gene in cerebellar ataxia. Cerebellum. 10 (2), 296-299 (2011).
  15. Kitajima, N., et al. TRPC3 positively regulates reactive oxygen species driving maladaptive cardiac remodeling. Scientific Reports. 6, 37001 (2016).
  16. Yang, S. L., Cao, Q., Zhou, K. C., Feng, Y. J., Wang, Y. Z. Transient receptor potential channel C3 contributes to the progression of human ovarian cancer. Oncogene. 28 (10), 1320-1328 (2009).
  17. Oda, K., et al. Transient receptor potential cation 3 channel regulates melanoma proliferation and migration. Journal of Physiological Sciences. 67 (4), 497-505 (2017).
  18. Xia, M., Liu, D., Yao, C. TRPC3: A New Target for Therapeutic Strategies in Chronic Pain-DAG-mediated Activation of Non-selective Cation Currents and Chronic Pain (Mol Pain 2014;10:43). Journal of Neurogastroenterology and Motility. 21 (3), 445-447 (2015).
  19. Fan, C., Choi, W., Sun, W., Du, J., Lu, W. Structure of the human lipid-gated cation channel TRPC3. Elife. 7, e36852 (2018).
  20. Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
  21. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay to identify membrane protein expression and crystallization conditions. Structure (London, England: 1993). 20 (8), 1293-1299 (2012).
  22. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  23. Zhang, K. Gctf: Real-time CTF determination and correction. Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).
  24. Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  25. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  26. Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
  27. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  28. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
  29. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).
  30. Scheres, S. H. W., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature Methods. 9 (9), 853-854 (2012).
  31. Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  32. Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
  33. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 12-21 (2010).
  34. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).
  35. Green, E. M., Au, Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. Journal of Visualized Experiments. (117), e54792 (2016).
  36. Mesa, P., Deniaud, A., Montoya, G., Schaffitzel, C. Directly from the source: endogenous preparations of molecular machines. Current Opinion in Structural Biology. 23 (3), 319-325 (2013).
  37. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane Protein Assembly into Nanodiscs. FEBS letters. 584 (9), 1721-1727 (2010).
  38. Winkler, P. A., Huang, Y., Sun, W., Du, J., Lü, W. Electron cryo-microscopy structure of a human TRPM4 channel. Nature. 552, 200-204 (2017).
  39. Autzen, H. E., et al. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science. 359 (6372), 228-232 (2017).
  40. Guo, J., et al. Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4. Nature. 552 (7684), 205-209 (2017).
  41. Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1860 (2), 378-383 (2018).
  42. Gulati, S., et al. Detergent-free purification of ABC (ATP-binding-cassette) transporters. Biochemical Journal. 461 (2), 269-278 (2014).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyokimyasay 143iyon kanalmembran proteinprotein safla t rmayap belirlenmesicryo elektron mikroskobucryo EMbaculovirus

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır