قياسات متزامنة من الكالسيوم داخل الخلايا وإمكانات غشاء في البطانة الدماغي الماوس معزولة طازجة وسليمة

Summary

تظاهر هنا بروتوكولات لعزل (1) طازجة غشائي الدماغية سليمة "أنابيب" والقياسات (2) المتزامنة من الكالسيوم بطانية وغشاء المحتملة خلال المستمدة من البطانة فرط الاستقطاب. علاوة على ذلك، تسمح هذه الأساليب لضبط الدوائي الكالسيوم غشائي الخلايا والإشارات الكهربائية كمتغيرات تجريبية فردية أو التفاعلية.

Abstract

شرايين المخ وعلى دوران الأوعية الدقيقة الخاصة بكل منها تسليم الأوكسجين والمواد المغذية إلى الدماغ عن طريق تنظيم تدفق الدم. خلايا بطانية خط التجويف الأوعية الدموية والتغييرات الأمر في قطر الأوعية الدموية اللازمة لتلبية الطلب على التمثيل الغذائي للخلايا العصبية. عادة ما تعمل الابتدائي غشائي تعتمد على مسارات إشارات من فرط الاستقطاب غشاء المحتملة (ت_م) وأكسيد النيتريك في نفس الوقت التوسط من أجل توسع الأوعية ومن ثم زيادة تدفق الدم. على الرغم من أن جزءا لا يتجزأ من تنسيق توسع الأوعية عبر عدة ملليمترات من طول الأوعية الدموية، كان من الصعب تاريخيا لقياس مكونات المستمدة من البطانة فرط الاستقطاب (إده). هذه المكونات من إده تنطوي داخل الخلية Ca^{2 +} [Ca^{2 +}]_أنا يزيد والتنشيط اللاحقة للصغيرة-والمتوسط الموصلية Ca^{2 +}-تنشيط ك⁺ (كورونا/IK_CaCa) القنوات.

وهنا، نقدم مثالاً مبسطة لعزله البطانة الطازجة من الماوس الشرايين الدماغية؛ قياسات متزامنة غشائي [Ca^{2 +}]_أنا والخامس_م استخدام Fura-2 قياس الضوء واقطاب حادة داخل الخلية، على التوالي؛ ومن سوبيرفوسيون مستمر لحلول الملح ووكلاء الدوائية في ظل الظروف الفسيولوجية (درجة الحموضة 7.4، 37 درجة مئوية). تتم إزالة الشرايين الدماغية الخلفية من "دائرة ويليس" مجاناً للاتصال اللاحق والشرايين باسيلار. ويسهل الهضم الأنزيمي لتنظيف القطع الشرياني الدماغي الخلفي واللاحقة تريتوريشن إزالة والبرانية وارتشاح الأعصاب وخلايا العضلات الملساء. الناتج الخلفي الدماغي الشرياني بطانية "أنابيب" ثم يتم تأمينها تحت مجهر ودرست باستخدام كاميرا، وأنبوب ضوئي، اليكتروميتيرس واحدة واثنين في حين ظل سوبيرفوسيون المستمر. جماعياً، في نفس الوقت يمكن قياس هذا الأسلوب التغييرات في غشائي [Ca^{2 +}]_أنا و الخامس_م في مواقع الخلوية منفصلة، بالإضافة إلى انتشار إده عن طريق تقاطعات الفجوة حتى مسافات ملليمتر على طول حالها البطانة. هذا الأسلوب من المتوقع أن تسفر عن إجراء تحليل الفائق لمهام غشائي الدماغية الكامنة وراء آليات لتنظيم تدفق الدم في المخ العادي والمريضة.

Introduction

وينظم تدفق الدم في جميع أنحاء الدماغ تنسيق توسع الأوعية بين شرايين المخ والشرايين في شبكات الأوعية الدموية¹. خلايا بطانية بطانة الشرايين المقاومة الدماغية الأمر التغييرات في قطر الأوعية الدموية حسب الحاجة لتلبية الطلب الأيضية للخلايا العصبية^1،،من²³. خلال فرط الاستقطاب المستمدة من البطانة (المعروفة عموما باسم إده)، على وجه الخصوص، كاليفورنيا داخل الخلية^{2 +} ([Ca^{2 +}]_أنا) والإشارات الكهربائية في خلايا بطانية توسع الأوعية تنسيق بين خلايا بطانية وبهم خلايا العضلات الملساء المحيطة بها من خلال تقاطعات الفجوة للاسترخاء الشرايين⁴. الفسيولوجية بدء إده تسلسلياً يستلزم تنشيط ز-إلى جانب المستقبلات (جبكرس)، زيادة في [Ca^{2 +}]_أنا، وتفعيل البطانية الصغيرة والمتوسطة Ca^{2 +}-تنشيط ك⁺ (/IK كورونا_{المرجع المصدقCa}) القنوات هايبربولاريزي غشاء بطانة الأوعية الدموية الدماغية المحتملة (ت_م)^5،،من⁶⁷. وهكذا، العلاقة الحميمة غشائي [Ca^{2 +}]_أنا والخامس_م جزء لا يتجزأ من تنظيم تدفق الدم ولا غنى عنه للقلب-والأوعية الدماغية وظيفة^6،8. في جميع أنحاء الأدب أوسع نطاقا، والعديد من الدراسات أفادت رابطة خلل الأوعية الدموية غشائي مع تطور الأمراض المزمنة (مثل ارتفاع ضغط الدم، والسكري، قصور القلب، مرض الشريان التاجي، الفشل الكلوي المزمن، أمراض الشرايين الطرفية)^9،10، مما يشير إلى أهمية دراسة الدالة غشائي في الظروف الفسيولوجية وكذلك المرضية.

البطانة الوعائية جزء لا يتجزأ من الإنتاج من فرط الاستقطاب، وتوسع الأوعية، ونضح الأنسجة وهكذا، دراسة خصائصه الخلوية الأصلية الحاسمة. كنموذج دراسة عامة، تم نشر إعداد نموذج أنبوب غشائي الشرياني الماوس قبل للهيكل العظمى والعضلات^11،12،¹³من القناة الهضمية،¹⁴من الرئة، ومؤخرا ل الدماغ⁶. خاصة نشرت دراسات متزامنة [Ca^{2 +}]_أنا وقياسات_m V للهيكل العظمى والعضلات البطانة الشريانية^15،16 ، فضلا عن سفينة اللمفاوية البطانة¹⁷. وبالإضافة إلى الدراسات الأولية استخدام النهج أنبوب غشائي، يمكن الاطلاع على استعراض شامل لمزايا وعيوب⁸ تحديد ما إذا كانت هذه الأداة التجريبية المناسبة لدراسة محددة. باختصار، هي ميزة الاحتفاظ بالعناصر الفسيولوجية الرئيسية لوظيفة الخلايا البطانية (مثل، Ca^{2 +} تدفق وإطلاق سراح داخل الخلايا، فرط الاستقطاب V_م تصل إلى الإمكانات] [نرنست] ك⁺ عن طريق كورونا/IK_CaCa التنشيط، واقتران بين الخلايا البطانية عن طريق تقاطعات الفجوة) دون التباس عوامل مثل ارتشاح الأعصاب الإدخال ووظيفة القناة عن طريق بوابة الجهد العضلات الملساء وكونتراكتيليتي، دوران الدم، والتأثيرات الهرمونية⁸. وفي المقابل، نهج ثقافة الخلية المستخدمة عادة إدخال تعديلات هامة في مورفولوجيا¹⁸ وأيون قناة التعبير¹⁹ في طريقة إلى حد كبير يمكن أن تعتم مقارنات للملاحظات الفسيولوجية التي تحدد السابقين فيفو أو في فيفو. وتشمل القيود الافتقار إلى التكامل مع المكونات الأخرى الضرورية لتنظيم تدفق الدم، مثل العضلات الملساء والمرونة مقيدة في وضع جدول زمني تجريبية، كما يتم اختبار هذا النموذج الأمثل ضمن ح 4 من عزلة الجزء الأوعية الدموية سليمة من هذا الحيوان.

بناء من بروتوكول فيديو سابق من تأليف سوتشا وسيجال¹² ومستجدات التجريبية المؤقتة^6،،من¹⁵¹⁶، نثبت هنا عزلة البطانة جديدة من شرايين المخ الخلفي وقياسات متزامنة غشائي [Ca^{2 +}]_أنا والخامس_م استخدام Fura-2 قياس الضوء واقطاب حادة داخل الخلية، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك، تستلزم هذه التجربة سوبيرفوسيون المستمر لحلول الملح ووكلاء الدوائية خلال الظروف الفسيولوجية (درجة الحموضة 7.4، 37 درجة مئوية). لقد اخترنا الشريان الدماغي الخلفي، كما غلة البطانة معزولة مع السلامة الهيكلية (الخلايا إلى جانب من خلال تقاطعات الفجوة) ويكفي الأبعاد (العرض إيه فايف زيرو ميكرومتر، طول إيه ثري زيرو زيرو ميكرومتر) قابلة لداخل وبين الخلايا مما يشير إلى طول وبين خلايا بطانية. وبالإضافة إلى ذلك، تمثل إلى حد كبير في الأدب دراسات الشريان الدماغي الخلفي القوارض وتشمل دراسة آليات إرسال الإشارات غشائي الأساسية والأوعية الدموية التنمية/الشيخوخة، وعلم الأمراض^{20، 21 , 22}-ومن المتوقع أن تسفر عن إجراء تحليل الفائق للدالة غشائي الدماغي (والخلل) هذا التطبيق التجريبي وسيسمح ذلك لأوجه التقدم الكبير في الفهم لتنظيم تدفق الدم في جميع أنحاء الشيخوخة وتطور المرض الأعصاب.

Protocol

قبل إجراء التجارب التالية، ضمان استخدام جميع أنواع الرعاية الحيوانية وبروتوكولات وافق "المؤسسية رعاية الحيوانات" واستخدام اللجنة (IACUC) والقيام بها في اتفاق مع "المجلس الوطني للبحوث" في ''دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية'' (8^th الطبعة، 2011)، والمبادئ التوجيهية سيصلون. إياكوك من جامعة لوما ليندا قد وافق جميع البروتوكولات المستخدمة لهذه المخطوطة للذكور والإناث من الفئران C57BL/6 (العمرية: مو 3 إلى 30).

1-معدات ومواد

ملاحظة: يمكن الاطلاع على تفاصيل المواد المطلوبة للبروتوكول في الجدول للموادأو المواد الكاشفة، وكتيبات أو المواقع المرتبطة مع البائعين الخاصة بكل منها.

1. الدائرة تدفق
   1. ربط غرفة سوبيرفوسيون مع قاع ساترة زجاجية في منصة ألومنيوم المؤكسد. تأمين المنصة مع الدائرة إلى مرحلة اتفاق ألومنيوم.
   2. تعيين ميكرومانيبولاتور في نهاية كل من المنصة على المسرح الألومنيوم لعقد ماصة التثبيت.
      ملاحظة: كخيار عملي، استخدم هذا الجهاز مرحلة قابلة للتحويل مع وحدة دائرة تدفق المضمونة لتسهيل الانتقال من العزلة لأنبوب غشائي لأداء التجارب.
2. المجاهر
   1. استخدام ستيريوميكروسكوبيس (5 x لنطاق التكبير x 50) مجهزة بالألياف البصرية مصادر الضوء لإجراءات تشريح الكلي والجزئي.
   2. لإعداد أنابيب بطانية، استخدم مجهر مقلوب مجهزة بمرحلة التباين أو فرق التدخل التباين (DIC) متوافق مع أهداف (10 x و 20 x و 40 x) ومرحلة ألومنيوم.
   3. لعزل أنابيب غشائي من الأوعية الدموية هضمها جزئيا، وضع وحدة تحكم مضخة ميكروسيرينجي المتاخمة لجهاز إعداد أنبوب غشائي.
   4. للجهاز التجريبي، واستخدام مجهر مقلوب مزودة بأهداف قياسية (4 x و 10 x) بالإضافة إلى أهداف الفلورسنت (20 x و 40 x, الفتحة العددية 0.75) ومرحلة ألومنيوم دليل على طاولة عزل الاهتزازات.
3. معدات التسجيل داخل الخلايا
   1. لسجل ت_م من خلايا بطانية في أنابيب معزولة بطانية، تتصل في الكترومتر هيدستاجي متوافقة. إذا لزم الأمر، بتوصيل مولد دالة أو مشجعا الكترومتر للتجارب التي تتطلب الحقن الحالية.
   2. قم بتوصيل النواتج مكبر للصوت لنظام الحصول على بيانات ورصد خط الأساس مسموعة والذبذبات. تأمين مسرى مرجع (Ag/AgCl بيليه) قرب مخرج الدائرة التدفق خلال التجارب.
   3. استخدام نظام القياس الضوئي مع مكونات متكاملة الأسفار نظام واجهة أو عالية الكثافة مصباح القوس والسلطة إمدادات، هايبرسويتش، أنبوب ضوئي (أو PMT)، وكاميرا لقياس [Ca^{2 +}]_أنا في خلايا بطانية.
   4. استخدام وحدة تحكم درجة حرارة مزودة سخان مضمنة لرفع والحفاظ على درجة حرارة فسيولوجية (37 درجة مئوية) في جميع أنحاء هذه التجربة.
   5. استخدام منصة 6-الخزان متصل بوحدة تحكم صمام مع صمام تحكم تدفق مضمنة للتحكم في تقديم الحلول الخاصة بكل منها لأنبوب غشائي المضمونة في الدائرة.
4. ميكروبيبيتيس واقطاب حادة
   ملاحظة: لتصنيع الماصات تريتوريشن وميكانيكية تثبيت أنابيب معزولة بطانية، استخدم ساحبة إلكترونية لسحب الماصات والصغير-فورج لكسر وإطلاق النار التلميع.
   1. لفصل والبرانية والعضلات الملساء وأنبوب غشائي من الجزء الشرياني هضمها جزئيا، إعداد تريتوريشن الماصات (كل منها قطر الحافة داخلية من 80 – 120 ميكرون) حسب الاقتضاء، استخدام أنابيب زجاج البورسليكات الشعرية، وإطلاق النار البولندية في التلميح.
   2. لتأمين أنبوب غشائي ضد الجزء السفلي من الدائرة سوبيرفوسيون، استخدام الماصات التثبيت مع نهاية يتثلم، كروية (الحرارة-مصقول، التطوير التنظيمي من 100-150 ميكرومتر؛ أعد من أنابيب رقيقة الجدار البورسليكات الزجاج).
   3. أن سجل ت_م خلية بطانية، إعداد أقطاب حادة مع مقاومة نصيحة ~ 150 ± 30 MΩ من الزجاج الأنابيب الشعرية باستخدام ساحبة إلكترونية.

2-إعداد الحلول والأدوية

1. الحل الملح الفسيولوجية (PSS)
   1. للحصول على تجربة واحدة مع المخدرات الاستعدادات، وإعداد الحد أدنى من 1 لتر من استخدام PSS: 140 ملم كلوريد الصوديوم، 5 ملم بوكل، 2 مم كاكل₂، 1 مم مجكل الجلوكوز₂، 10 حمض N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic (حبيس)، و 10 ملم.
   2. لإعداد الحلول المطلوبة للتشريح، تعد العزلة الشريان الدماغي، وإعداد من أنبوب غشائي، PSS تفتقر كاكل₂ (صفر Ca^{2 +} PSS).
   3. إعداد كافة الحلول في عالي النقاوة منزوع ح₂س وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 وتعقيم لهم من خلال عامل تصفية (حجم المسام 0.22 ميكرومتر) وكفالة osmolality الحلول بين موسم 290 و 300.
      ملاحظة: ويمكن تخزين الحلول عند 4 درجة مئوية لمدة أسبوعين تقريبا.
2. ألبومين المصل البقري 10% (BSA)
   1. لإعداد جيش صرب البوسنة 10%، يذوب 1 غ مسحوق المجففة بالتبريد في كوب من 10 مل صفر Ca^{2 +} PSS.
   2. تغطية الكأس بالفيلم البارافين والسماح لمدة عدة ساعات لتمرير، مع التحريك البطيء لجيش صرب البوسنة حل.
   3. تصفية الحل النهائي باستخدام حقنه 10 مل بالإضافة إلى عامل تصفية 0.22 ميكرومتر وجعل 1 مل مختبرين لتخزينها في-20 درجة مئوية.
3. تشريح الحل
   1. لإعداد 50 مل من محلول التشريح، إضافة 500 ميليلتر لجيش صرب البوسنة (10%) إلى 49.5 مل من الصفر Ca^{2 +} PSS.
   2. فورا بعد التحضير، نقل هذا الحل تسلخ في طبق بتري لتشريح الشرايين.
4. حل الانفصال
   1. لإعداد 50 مل من محلول الانفصال، إضافة 5 ميليلتر كاكل₂ (1 م) و 500 ميليلتر لجيش صرب البوسنة (10 في المائة) إلى 49.5 مل من الصفر Ca^{2 +} PSS. تسمح حل للجلوس في درجة حرارة الغرفة (RT).
5. الإنزيمات
   1. الهضم الجزئي شرائح الشرياني، إعداد 1 مل من محلول الهضم مع غراء 0.31 ملغم/مل ديثيوريثريتول 0.5 ملغ/مل، 0.75 ملغ/مل كولاجيناز (ح نوع المزج) و elastase 0.13 مغ/مل.
      ملاحظة: يمكن أن تختلف نشاطات الإنزيم؛ ومع ذلك، لدينا بروتوكولات ناجحة، نشاطات الإنزيم المتوفرة تجارياً استخدمت على النحو التالي: وحدات إيه وان زيرو غراء/ملغ؛ وحدات إيه وان كولاجيناز/ملغ، لدوران الركيزة N-[3-(2-Furyl)acryloyl]-Leu-Gly-Pro-Ala أو فالجبا؛ و elastase ≥ 5 وحدات/mg.
6. إعداد Fura-2 ووكلاء الدوائية
   1. إعداد تركيز المخزون (1 ملم) Fura-2 صباحا صبغ في [دمس]. إعداد تركيز عامل (10 ميكرون) بإضافة 5 ميليلتر للأوراق المالية إلى ميليلتر 495 من PSS للتحميل.
   2. إعداد مل إيه فايف زيرو من العامل تركيزات وكلاء الدوائية (مثل ATP) في PSS حسب الاقتضاء.
7. إجراء الحل
   1. التحضير إجراء الحل، 2 م بوكل، بتذويب بوكل في منزوع ح₂س (ز 7.455 بوكل في 50 مل ح₂س).
   2. تصفية الحل من خلال عامل تصفية حقنه 0.22 ميكرومتر قبل ردمها أقطاب كهربائية حادة.
8. يوديد Propidium (0.1%)
   1. حل 10 مغ يوديد propidium المجففة بالتبريد في 10 مل 2 م بوكل.
   2. يخلط جيدا وتخزينها في الرايت

3-تشريح والعزلة الشريان الدماغي

ملاحظة: تتطلب جميع إجراءات تشريح العينة التكبير (تصل إلى 50 س) عبر ستيريوميكروسكوبيس والإضاءة المقدمة من الألياف البصرية مصادر الضوء. لتنفيذ إجراءات تشريح لعزل الدماغ والشرايين، استخدام أدوات تشريح شحذ. وتشمل أدوات ميكروديسيكشن لعزل وتنظيف الشرايين شحذ الملقط الجميلة ذات الرؤوس و Vannas نمط تشريح المقص (شفرات 3 إلى 9.5 مم).

1. عزل الدماغ الماوس
   1. تخدير ماوس (3-30 شهرا القديمة؛ وذكر أو أنثى) C57BL/6 عن طريق استنشاق إيسوفلوراني (3% لمدة 2-3 دقائق)، ثم قطع رأس الحيوان مباشرة بعد الاستقراء التام للتخدير. وضع رأسه في طبق بتري (قطرها 10 سم، عمق 1.5 سم) تحتوي على الباردة (4 درجة مئوية) صفر Ca^{2 +} PSS تحت ستيريوميكروسكوبي.
   2. عرض من خلال المجهر، قم بإزالة الجلد والشعر على الجمجمة والدم المفرط مع الباردة صفر Ca^{2 +} PSS. جعل شق استخدام فقط نصائح مقص تشريح القياسية (مثل شفرة 24 ملم)، بدءاً بعظم قذالي وتمتد حتى عبر عظم الآنف في الجمجمة.
   3. فتح الجمجمة بعناية على طول شق استخدام الملقط الخشنة ذات الرؤوس، والنسيج الضام منفصلة لعزل الدماغ مع "دائرة ويليس" سليمة.
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، يمكن استخدام الملقط العظام-قطع ليتاوير لفتح الجمجمة وفضح الدماغ.
   4. تغسل بلطف الدماغ معزولة مع الباردة صفر Ca^{2 +} PSS في كوب لإزالة الدم. ضع الجانب البطني الدماغ التي تواجه في دائرة التي تحتوي على الحل تشريح البارد لعزل الشرايين الدماغية (الشكل 1A).
2. عزل الشرايين الدماغية
   ملاحظة: وقد اختيرت الشريان الدماغي الخلفي كنموذج دراسة غشائي المخية ممثلة لهذا البروتوكول.
   1. تأمين الدماغ معزولة في تشريح الباردة الحل باستخدام دبابيس الفولاذ المقاوم للصدأ (قطرها 0.2 مم، طول ~ 11 – 12 ملم) إدراجها في بوليمر سليكون غرست الفحم طلاء الجزء السفلي (عمق إيه فايف زيرو سم) من الزجاج طبق بيتري.
   2. للحفاظ على درجة حرارة المبرد من PSS خلال التشريح، استخدام دائرة تشريح تبريد بنظام التبريد بشكل مستمر ركوب الدراجات مزيج الماء 1:1-إثيلين غليكول. وبدلاً من ذلك، يمكن إجراء تشريح على الجليد جديدة.
   3. عزل جراحيا الشرايين الدماغية الخلفي (~0.3 إلى شرائح 0.5 سم، لا التوتر المحوري) من الاتصال اللاحق والشرايين باسيلار استخدام مقص نمط Vannas الصكوك ميكروديسيكشن وشحذ الملقط مقلوب غرامة (1B الشكل ). استخدام دبابيس الفولاذ المقاوم للصدأ (قطرها 0.1 ملم، طول ~ 13 – 14 مم) لتأمين كل معزولة الشرايين الدماغية الخلفية في الحل تسلخ في طبق بتري (الشكل 1).
   4. تنظيف الشرايين الدماغية الخلفية معزولة بعناية عن طريق إزالة النسيج الضام استخدام الملقط شحذ مقلوب غرامة (الشكل 1). قطع شرايين سليمة إلى شرائح (طول 1 – 2 مم) الهضم الأنزيمي (الشكل 1؛ واقحم).

4-إعداد أنبوب غشائي وسوبيرفوسيون

ملاحظة: أنبوب غشائي مستعدة كما هو موضح سابقا،¹²مع بعض التعديلات ل الشريان الدماغي⁶.

1. إعداد جهاز تريتوريشن استخدام مجهر مزودة بأهداف (10 x و 20 x و 40 x)، وكاميرا، ومرحلة ألومنيوم عقد دائرة وميكرومانيبولاتورس. تأمين ميكروسيرينجي مع وحدة تحكم مضخة بجوار المرحلة والعينة (الشكل 2A).
2. تماما الردم تريتوريشن "الماصة؛" مع الزيوت المعدنية وتأمينه على المكبس الصغير-المحاقن. ثم، استخدام مايكرو-المحاقن مع وحدة تحكم المضخة، سحب الحل الانفصال في الماصة (~ 130 nl) على رأس الزيوت المعدنية مع ضمان عدم وجود فقاعات الهواء في الماصة.
3. ضع شرائح الشرايين سليمة إلى 1 مل من محلول الانفصال في أنبوب زجاج 10 مل (الشكل 2)، الذي يحتوي على غراء 0.31 ملغم/مل ديثيوريثريتول 0.5 ملغ/مل، كولاجيناز 0.75 ملغ/مل و elastase 0.13 مغ/مل. احتضان في 34 درجة مئوية لمدة 10 – 12 دقيقة لهضم جزئي.
4. وبعد عملية الهضم، يستعاض الحل إنزيم ~ 5 مل من محلول الانفصال من جديد... باستخدام ماصة 1 مل، نقل قطعة واحدة في دائرة التي تحتوي على الحل الانفصال في الرايت
5. ضع الماصة في الحل الانفصال في الدائرة ووضعه قريبا من نهاية واحد من السفينة هضمها. تعيين معدل ضمن المجموعة من 2 إلى 5 nL/s على وحدة تحكم المضخة للطيف تريتوريشن (الشكل 2؛ واقحم).
6. أثناء عرض عن طريق x 100 إلى 200 x التكبير، سحب وإخراج الجزء الشرياني فصل خلايا العضلات الملساء بينما تنتج أنبوب غشائي. إذا لزم الأمر، بعناية استخدام الملقط مقلوب الجميلة لفصل والبرانية منفصلان والصفيحة المرنة الداخلية من أنبوب غشائي. تأكد من أنه يتم فصل جميع خلايا العضلات الملساء وبقاء خلايا بطانية فقط سليمة "أنبوب" (الشكل 2).
7. باستخدام ميكرومانيبولاتورس، تأمين كل نهاية أنبوب غشائي في كشف غطاء الزجاج في دائرة سوبيرفوسيون باستخدام زجاج البورسليكات يعلقون الماصات (الشكل 2D).
8. المياه والصرف الصحي فصل والبرانية وخلايا العضلات الملساء من الدائرة واستبدال الحل الانفصال مع 2 مم كاكل₂ PSS. نقل منصة متنقلة مع أنبوب غشائي المضمون على مجهر تلاعب سوبيرفوسيون والتجريبية.
9. استخدام الخزانات نظيفة 50 مل 6 (الشكل 3A) لتسليم المستمر من PSS والمخدرات كل الحلول خلال التجربة، حسب الاقتضاء. استخدام صمام تحكم تدفق المضمنة يدوياً لتعيين معدل التدفق في جميع أنحاء متسقا مع الاندفاق الصفحي بينما مطابقة تدفق آر لشفط فراغ. تسليم PSS للدائرة (الشكل 3B) سوبيرفوسيون أنبوب غشائي ل ≥ 5 دقائق قبل تسجيل البيانات الخلفية وصبغ تحميل.

5-صبغ الحمولة، من المياه والصرف الصحي، وضبط درجة الحرارة

1. قم بتشغيل كافة مكونات نظام قياس الضوء لقياس [Ca^{2 +}]_أنا. استخدام المجهر على تلاعب التجريبية (الشكل 3) لعرض أنبوب غشائي في 400 x التكبير، والتركيز على الخلايا الموجودة في النافذة الضوئية باستخدام برمجيات نظام قياس الضوء.
2. قياس قطر أنبوب غشائي وتسجيل قيم أوتوفلوريسسينسي الخلفية في اتفاق مع 510 نانومتر الانبعاثات أثناء الإثارة المناوب في 340 و 380 نانومتر (إيه وان زيرو هرتز).
3. لقياس [Ca^{2 +}]_أنا الردود، أنا صبغ (10 ميكرون تركيز النهائية) في الرايت تحميل أنبوب غشائي مع Fura-2 والسماح ~ 30 – 40 دقيقة في الغياب الضوء.
4. قم بإعادة تشغيل سوبيرفوسيون أنبوب غشائي مع PSS الطازجة ل ~ 30 – 40 دقيقة للمياه والصرف الصحي بالزائدة صبغ والسماح بداخل الخلايا Fura-2 صباحا لإزالة استيريفي. خلال الفترة من المياه والصرف الصحي، رفع درجة الحرارة تدريجيا من الرايت إلى 37 درجة مئوية باستخدام وحدة تحكم درجة الحرارة (الشكل 3A) مع سخان مضمنة، ثم الحفاظ على 37 درجة مئوية طوال التجربة.
   ملاحظة: يستلزم الانتقال الإضافية الموصى بها بين RT إلى 37 درجة مئوية ثلاث خطوات (مثلاً، 5 درجة مئوية) مع فترة الموازنة دقيقة إيه فايف في كل خطوة.

6-واحد قياس [Ca^{2 +}]_أنا والخامس_م

1. قم بتشغيل جميع معدات وبرمجيات الكترومتر لقياس V_m (انظر الشكل 3، الرقم 4). ضبط معدل اقتناء البيانات تبعاً لذلك (إيه وان زيرو هرتز).
2. سحب قطب حادة والردم مع 2 م بوكل. دراسات من بين الخلايا اقتران عبر نقل الصبغ، والردم ميكرويليكتروديس مع يوديد propidium 0.1% المذاب في 2 م بوكل.
3. تأمين الكهربائي عبر سلك فضة المغلفة بكلوريد في حامل الماصة المرفقة إلى مرحلة رأس الكترومتر المضمون مع ميكرومانيبولاتور. استخدام ميكرومانيبولاتور إيجاز موقف غيض مسرى إلى PSS المتدفقة في الدائرة أثناء عرض من خلال الهدف 4 x.
4. تعيين الخامس يستريح_م 0 كما يتفق مع أسس حمام المحتملة. ضع طرف القطب فقط فوق خلية أنبوب غشائي. إذا رغبت في ذلك، استخدام شاشات الأساس مسموعة ترتبط اليكتروميتيرس لربط الملعب سليمة مع تسجيلات المحتملة.
5. زيادة التكبير إلى 400 x 40 x والهدف باستخدام وإعادة تحديد موضع غيض مسرى حسب الحاجة. ضبط النافذة الضوئية باستخدام البرمجيات قياس الضوء للتركيز على الخلايا البطانية ~ 50 إلى 80.
6. بلطف ضع الكهربائي في إحدى خلايا أنبوب غشائي في ميكرومانيبولاتور باستخدام وانتظر min إيه تو الخامس يستريح_م لتحقيق الاستقرار. وبالمثل، إدراج قطب ثاني في خلية أخرى (المسافة إيه وان زيرو زيرو ميكرومتر) من الخلية الأولى مخوزق مع القطب الأول.
7. متى يستريح V_m مستقر في قيمها المتوقعة (-30 إلى-40 mV)⁶، قم بتشغيل PMT على الواجهة fluorescence في غياب الضوء ويبدأ اكتساب داخل الخلايا [Ca^{2 +}]_أنا مثيرة Fura-2 بالتناوب (10 هرتز) في 340 و 380 نانومتر بينما جمع الانبعاثات fluorescence في 510 نانومتر.
   ملاحظة: لاختبار اقتران الكهربائية بين الخلايا، الحالي (± 0.5-3 غ، مدة النبضة s ~ 20) يمكن تسليمها عن طريق واحد الكترومتر "الموقع 1"، ويمكن أن تسجل تغييرات الخامس_م مع الكترومتر آخر ك "الموقع 2" (المسافة إيه وان زيرو زيرو ميكرومتر).
8. بمجرد إنشاء قياسات متزامنة من V_m و [Ca^{2 +}]_أنا ، تسمح ~ 5 دقيقة سوبيرفوسيون أنبوب غشائي مع PSS بمعدل ثابت الاندفاق الصفحي قبل تطبيق المخدرات.
9. تطبيق على المخدرات (مثل ATP) أعد PSS للدائرة سوبيرفوسيون مع معدل التدفق المستمر. بعد دقيقة ~ 3 (أو فترة زمنية مناسبة لحركية الدواء)، المياه والصرف الصحي مع PSS حتى الخامس_م ونسبة₃₈₀ /F₃₄₀و العودة إلى ظروف خط الأساس. علامة تسجيلات كل منهما وقتيا متزامنة عبر أجنحة البرمجيات شحني والكترومتر خلال كل مرحلة انتقالية من الحلول.
10. بمجرد القيام بالتجربة، سحب القطب من الخلية باستخدام ميكرومانيبولاتور ولاحظ ت_م ~ 0 mV كالمشار إليه بواسطة مسرى حمام. إيقاف التسجيلات كل من ت_م و [Ca^{2 +}]_أنا وحفظ السجلات في ملف لتحليل البيانات.

7-التصور من خلية إلى اقتران

1. لتصور اقتران خلية إلى خلية عن طريق يوديد propidium، استخدم علامة x 40 أو 60 x الفلورسنت الهدف مع فتحه عددية عالية نسبيا (مثلاً، 0.95) وتعيين عامل تصفية والرودامين مع الإضاءة الحالة الصلبة، وكاميرا عالية الدقة (مثلاً، 16- ميغابكسل)، وبرمجيات تصوير.

النتائج

ويبين الأرقام المرفقة المظاهرة التخطيطي للبروتوكول، المذكورة أعلاه. ويبين الشكل 1Aدماغ معزولة عن ماوس C57BL/6N ذكور شباب البالغين (5 أشهر). شرايين المخ الخلفي معزولون بعناية من "دائرة ويليس"، إزالتها دون النسيج الضام، ومقطعة شرائح (الشكل 1B...

Discussion

ضوء الأخيرة تطورات^6،15،،من¹⁶¹⁷، نظهر الآن طريقة لعزل الماوس البطانة الشريانية الدماغية تحضيرا لقياس متزامنة من [Ca^{2 +}] _الأول والخامس_م الكامنة إده استمرار ح ~ 2 عند 37 درجة مئوية. على الرغم من صعوبة من الناحية...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glucose	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	G7021
NaCl	Sigma	S7653
MgCl2	Sigma	M2670
CaCl2	Sigma	223506
HEPES	Sigma	H4034
KCl	Sigma	P9541
NaOH	Sigma	S8045
ATP	Sigma	A2383
HCl	ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)	A466250
Collagenase (Type H Blend)	Sigma	C8051
Dithioerythritol	Sigma	D8255
Papain	Sigma	P4762
Elastase	Sigma	E7885
BSA	Sigma	A7906
Propidium iodide	Sigma	P4170
DMSO	Sigma	D8418
Fura-2 AM dye	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	F14185
Recirculating chiller (Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Scientific	13874647
Plexiglas superfusion chamber	Warner Instruments, Camden, CT, USA	RC-27
Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm)	ThermoFisher Scientific	12-548-5M
Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm)	Warner Instruments	PM6 or PH6
Compact aluminum stage	Siskiyou, Grants Pass, OR, USA	8090P
Micromanipulator	Siskiyou	MX10
Stereomicroscopes	Zeiss, NY, USA	Stemi 2000 & 2000-C
Fiber optic light sources	Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss	Fostec 8375
Nikon inverted microscope	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA	Ts2
Phase contrast objectives	Nikon Instruments Inc	(Ph1 DL; 10X & 20X)
Fluorescent objectives	Nikon Instruments Inc	20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor)
Nikon inverted microscope	Nikon Instruments Inc	Eclipse TS100
Microsyringe pump controller (Micro4 )	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	SYS-MICRO4
Vibration isolation table	Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA	Micro-g
Amplifiers	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Headstages	Molecular Devices	HS-2A & HS-9A
Function generator	EZ Digital, Seoul, South Korea	FG-8002
Data Acquision System	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Digidata 1550A
Audible Baseline Monitors	Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA	BM-A-TM
Digital Storage Oscilloscope	Tektronix, Beaverton, Oregon, USA	TDS 2024B
Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	IonOptix Systems
Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344B or C
Inline Heater	Warner Instruments	SH- 27B
Valve Controller	Warner Instruments	VC-6
Inline Flow Control Valve	Warner Instruments	FR-50
Electronic Puller	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97 or P-1000
Microforge	Narishige, East Meadow, NY, USA	MF-900
Borosilicate Glass Tubes (Trituration)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	1B100-4
Borosilicate Glass Tubes (Pinning)	Warner Instruments	G150T-6
Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes)	Warner Instruments	GC100F-10
Syringe Filter (0.22 µm)	ThermoFisher Scientific	722-2520
Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard	Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA	DD-90-S-BLK
Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm)	World Precision Instruments	555640S, 14364
Scissors 3 & 7 mm blades	Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA	Moria MC52 & 15000-00
Sharpened fine-tipped forceps	FST	Dumont #5 & Dumont #55