Gleichzeitige Messung von intrazellulären Calcium und Membrane Potential in frisch isolierte und intakte Maus zerebralen Endothel

Zusammenfassung

Hier demonstriert werden Protokolle zur intakten zerebralen Endothelzellen "Röhren" und (2) die gleichzeitige Messung von endothelialen Kalzium und Membranpotential im Endothel-derived Hyperpolarisation (1) frisch zu isolieren. Des weiteren können diese Methoden für die pharmakologische Optimierung von Endothelzellen Kalzium und elektrische Signalisierung als Einzel- oder interaktive experimentellen Variablen.

Zusammenfassung

Zerebralen Arterien und ihre jeweiligen Mikrozirkulation liefern Sauerstoff und Nährstoffe an das Gehirn über Blut Durchflussregulierung. Endothelzellen säumen das Lumen der Blutgefäße und Befehl Änderungen im vaskulären Durchmesser je nach Bedarf für die metabolische Nachfrage von Neuronen. Primäre Endothel-abhängige Signalwege der Hyperpolarisation des Membranpotentials (V_m) und Stickoxid-arbeiten in der Regel parallel zur Vermittlung Vasodilatation und steigern somit die Durchblutung. Obwohl integrale zur Koordinierung der Vasodilatation über mehrere Millimeter der vaskulären Länge wurden Bestandteile der Endothel-derived Hyperpolarisation (EDH) historisch schwierig zu messen. Diese Komponenten des EDH beinhalten intrazellulären Ca^{2 +} [Ca^{2 +}]_ich erhöht und anschließende Aktivierung von klein - und Mittelstufe Leitwert Ca^{2 +}-aktiviert K⁺ (SK_Ca/IK_Ca) Kanäle.

Hier präsentieren wir Ihnen eine vereinfachte Darstellung der Isolation des frischen Endothel von Maus zerebralen Arterien; gleichzeitige Messung von Endothelzellen [Ca^{2 +}]_ich und V_m mit Fura-2 Photometrie und intrazellulären scharfe Elektroden bzw.; und eine kontinuierliche Superfusion von Salzlösungen und pharmakologische Wirkstoffe unter physiologischen Bedingungen (pH 7.4, 37 ° C). Hintere Hirnarterien aus dem Kreis von Willis entfernt die hinteren kommunizieren und die Kameraausrüstung Arterien frei. Enzymatische Verdauung von gereinigten hinteren zerebralen arteriellen Segmente und anschließenden Verreibung erleichtert die Entfernung der Adventitia, perivaskuläre Nerven und glatten Muskelzellen. Resultierende hintere zerebrale arterielle Endothelzellen "Röhren" sind dann unter dem Mikroskop gesichert und mit einer Kamera, Photomultiplier Tube, und ein bis zwei Stromzähler unter kontinuierlicher Superfusion untersucht. Gemeinsam kann diese Methode gleichzeitig Änderungen in Endothelzellen [Ca^{2 +}]_ich und V_m in diskreten zellulären lagen, neben der Verbreitung des EDH durch Lücke Kreuzungen bis zu Millimeter Abstand entlang der intakten messen Endothel. Diese Methode wird voraussichtlich eine Hochdurchsatz-Analyse der zugrunde liegenden Blut fließen Regulationsmechanismen im normalen und kranken Gehirn endothelialen Gehirnfunktionen ergeben.

Einleitung

Blutfluss im Gehirn wird durch die Koordination der Vasodilatation bei zerebralen Arterien und Arteriolen in vaskulären Netzwerken¹geregelt. Endothelzellen Futter zerebralen Arterien Befehl Widerstandsänderungen vaskulären Durchmesser je nach Bedarf für die metabolische Nachfrage von Neuronen^1,2,3. Insbesondere während der Endothel-derived Hyperpolarisation (allgemein bekannt als EDH) intrazelluläre Ca^{2 +} ([Ca^{2 +}]_ich) und elektrische Signalisierung in Endothelzellen koordinieren Vasodilatation unter den Endothelzellen und ihre umgebenden glatten Muskelzellen durch Gap Junctions für arterielle Entspannung⁴. Physiologische Einleitung des EDH beinhaltet nacheinander Stimulierung des G-_Q-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs), eine Zunahme [Ca^{2 +}]_ichund Aktivierung von Endothelzellen kleine und Intermediate-Ca^{2 +}-aktiviert K⁺ (SK_Ca/IK_Ca) Kanäle zu zerebralen Endothelzellen Membran potenzielle (V_m)^5,6,7hyperpolarize. So ist das innige Verhältnis von Endothelzellen [Ca^{2 +}]_ich und V_m Blut Durchflussregulierung integraler Bestandteil und unverzichtbar für Kardio- und zerebrovaskuläre Funktion^6,8. In der breiteren Literatur haben zahlreiche Studien die Assoziation von vaskulären endothelialen Dysfunktion mit der Entwicklung von chronischen Krankheiten (z.B. Bluthochdruck, Diabetes, Herzinsuffizienz, koronare Herzkrankheit, chronische Niereninsuffizienz, berichtet. periphere Herzkrankheit)^9,10, was die Bedeutung des Studiums Endothelfunktion in physiologischen und pathologischen Bedingungen.

Vaskulären Endothel ist ein wesentlicher Bestandteil für die Produktion von Hyperpolarisation, Vasodilatation und Gewebedurchblutung und somit Prüfung seiner nativen zellulären Eigenschaften entscheidend. Als eine allgemeine Studienmodell Vorbereitung des arteriellen endothelial Rohr Mausmodells vor Skelettmuskulatur^11,12, Darm¹³, Lunge¹⁴, und vor kurzem für das Gehirn⁶erschienen. Studien zur gleichzeitigen [Ca^{2 +}]_ich und V_m Messungen sind insbesondere für skelettartigen Muskel arteriellen Endothel^15,16 , sowie Lymphgefäßsystem Endothel¹⁷erschienen. Neben Primärstudien unter Verwendung des endothelialen Rohr Ansatzes kann ein umfassender Überblick über die vor- und Nachteile⁸ konsultiert werden, um festzustellen, ob diese experimentelle Werkzeug für eine spezifische Studie geeignet ist. Kurz gesagt, ein Vorteil ist, dass die physiologische Schlüsselkomponenten der endothelial Zelle Funktion beibehalten werden (z. B., Ca^{2 +} Zustrom und intrazellulären freilassen, Hyperpolarisation der V_m bis das Nernst-Potenzial für K⁺ über SK_Ca/IK_Ca Aktivierung und endotheliale interzellulären Kopplung über Lücke Kreuzungen) ohne Störfaktoren wie perivaskuläre Nerven Input, glatte Muskulatur Voltage-gated Kanal Funktion und Kontraktilität, Zirkulation von Blut und hormonelle Einflüsse⁸. Im Gegensatz dazu häufig verwendete Zelle Kultur Ansätze einzuführen erhebliche Veränderungen in der Morphologie¹⁸ und Ionen-Kanal Ausdruck¹⁹ in einer Weise, die Vergleiche auf physiologische Beobachtungen bestimmt ex Vivo stark verschleiern kann oder in Vivo. Einschränkungen umfassen eine mangelnde Integration mit anderen wesentlichen Komponenten für die Regulierung der Durchblutung, wie glatte Muskulatur und eingeschränkte Flexibilität in einem experimentellen Zeitplan, wie dieses Modell optimal innerhalb von 4 h der intakten Kreislauf Segment isoliert getestet wird vom Tier.

Gebäude aus einem vorherigen video Protokoll verfasst von Socha und Segal¹² und experimentellen Entwicklungen in der interim^6,15,16, zeigen wir Ihnen hiermit die Isolation der frischen Endothel von hinteren Hirnarterien und gleichzeitige Messungen von Endothelzellen [Ca^{2 +}]_ich und V_m mit Fura-2 Photometrie und intrazellulären scharfe Elektroden bzw.. Darüber hinaus beinhaltet dieses Experiment kontinuierliche Superfusion von Salzlösungen und pharmakologische Wirkstoffe unter physiologischen Bedingungen (pH 7.4, 37 ° C). Wir entschieden uns für die hinteren zerebralen Arterie wie es isolierte Endothel mit der strukturellen Integrität (Zellen über Gap Junctions verbunden) und ausreichend Abmessungen (Breite ≥50 µm, Länge ≥300 µm) für Intra- und interzellulären Signal entlang und unter ergibt Endothelzellen. Darüber hinaus Studien der Nager hinteren zerebralen Arterie werden im Wesentlichen in der Literatur dargestellt und umfassen die Prüfung der grundlegenden endotheliale Signalisierung Mechanismen, vaskuläre Entwicklung/Altern und Pathologie^{20, 21 , 22}. Diese experimentelle Anwendung wird voraussichtlich eine Hochdurchsatz-Analyse der zerebralen Endothelfunktion (und Dysfunktion) führen und ermöglicht dadurch erhebliche Fortschritte im Verständnis der Blut-Durchfluss-Verordnung in der gesamten Altern und die Entwicklung der Neurodegenerative Erkrankung.

Protokoll

Bevor Sie die folgenden Experimente durchführen, sicherzustellen, dass alle Tierpflege verwenden und Protokolle sind vom Tier Heimen und verwenden Committee (IACUC) genehmigt und durchgeführt in Übereinstimmung mit der National Research Council " "Guide für die Pflege und Nutzung der Versuchstieren" " (8^th Edition, 2011) und die ARRIVE-Richtlinien. Die IACUC der Loma Linda Universität genehmigt alle Protokolle für diese Handschrift für männliche und weibliche C57BL/6 Mäusen (Altersgruppe: 3 bis 30 Mo).

1. Geräte und Materialien

Hinweis: Details für das Protokoll benötigten Materialien finden Sie in der Tabelle der Materialien, Reagenzien, und Handbücher oder Websites, die mit dem jeweiligen Anbieter.

1. Strömungsraum
   1. Befestigen Sie eine superfusion Kammer mit einem Glasboden Deckglas in einem Gehäuse aus eloxiertem Aluminium-Plattform. Sichern Sie die Plattform mit Kammer in eine kompakte Aluminium-Bühne.
   2. Legen Sie einen Mikromanipulator an jedem Ende der Plattform, auf der Aluminium-Bühne für die Abhaltung der pinning Pipette.
      Hinweis: Als eine praktische Option verwenden dieses Gerät übertragbar Bühne mit einer Kammer Flusseinheit gesichert, um den Übergang von der Isolierung der endothelialen Röhre zur Leistung der Experimente.
2. Mikroskope
   1. Verwendung Stereomikroskope (5 X 50 X Vergrößerungsbereich) ausgestattet mit Fiber optic Lichtquellen für Makro und Mikro-Dissektion Verfahren.
   2. Verwenden Sie für Vorbereitung der endothelialen Röhren einem inversen Mikroskop mit Phase Kontrast oder Differential Interferenz Kontrast (DIC) kompatible Ziele (10 X, 20 X und 40 X) und ein Aluminium-Bühne ausgestattet.
   3. Um endotheliale Röhren aus teilweise verdaute Blutgefäße zu isolieren, platzieren Sie eine Pumpensteuerung Microsyringe neben der endothelialen Rohr Vorbereitung Apparat.
   4. Verwenden Sie für die experimentelle Vorrichtung, einem inversen Mikroskop ausgestattet mit standard Zielen (4 X und 10 X) neben fluoreszierende Ziele (20 X 40 X, numerische Apertur 0,75) und eine manuelle Aluminium-Bühne auf einem Rütteltisch Isolierung.
3. Intrazelluläre Recording-Equipment
   1. Um V_m von Endothelzellen in isolierten endotheliale Röhren aufzuzeichnen, schließen Sie das Elektrometer an kompatiblen Headstage an. Bei Bedarf verbinden Sie ein Funktionsgenerator oder Stimulator mit Elektrometer für Experimente, für die Stromeinspeisung erforderlich.
   2. Schließen Sie den Verstärker Ausgänge an ein Datenerfassungssystem, akustische Grundlinie Monitoren und einem Oszilloskop. Sichern Sie die Bezugselektrode (Ag/AgCl Pellet) in der Nähe der Fluss Kammer während der Experimente.
   3. Verwenden Sie ein photometrisches System mit integrierten Komponenten einer Fluoreszenz System Schnittstelle, hohe Intensität Bogenlampe und macht Lieferung, Hyperswitch, Photomultiplier Röhre (oder PMT), und Kamera [Ca^{2 +}]_ich in Endothelzellen messen.
   4. Verwenden Sie einen Temperaturregler ausgestattet mit einer Inline-Heizung zu erhöhen und eine physiologische Temperatur (37 ° C) während des Experiments.
   5. Verwenden Sie eine sechs-Reservoir-Plattform mit einem Ventil-Controller mit einer Inline-Stromregelventil verbunden, um die Lieferung der jeweiligen Lösungen an die Endothelzellen Röhre sicherte sich in der Kammer zu steuern.
4. Mikropipetten und scharfen Elektroden
   Hinweis: Herstellung von Pipetten Verreibung und die mechanische Stabilisierung der isolierten endotheliale Rohre verwenden eine elektronische Abzieher für das Ziehen der Pipetten und ein Mikro-Schmiede für das brechen und Feuer polieren.
   1. Um die teilweise verdaute arteriellen Segment Adventitia, glatte Muskelzellen und Endothelzellen Rohr trennen, Zerreibung Pipetten (jeweils mit einem internen Tipp-Durchmesser von 80 – 120 µm) gegebenenfalls mit Borosilikatglas Kapillarröhrchen, vorbereiten und Feuer Polieren Sie die Spitze.
   2. Verwenden, um die endotheliale Rohr gegen die Unterseite der superfusion Kammer befestigen pinning Pipetten mit einem abgestumpften, kugelförmige Ende (Wärme-poliert, OD von 100 – 150 µm; aus Borosilikatglas dünnwandige Rohre vorbereitet).
   3. Zum Aufzeichnen von V_m einer endothelial Zelle bereiten scharfe Elektroden mit einem Tipp-Widerstand von ~ 150 ± 30 MΩ aus Glas Kapillarröhrchen mit einem elektronischen Puller.

2. Vorbereitung der Lösungen und Medikamente

1. Physiologische Salzlösung (PSS)
   1. Für ein Experiment mit Medikament Vorbereitungen, bereiten ein Minimum von 1 L mit PSS: 140 mM NaCl, KCl, 2 mM CaCl₂, 5 mM 1 mM MgCl₂, 10 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic Säure (HEPES) und 10 mM Glukose.
   2. Um die gewünschten Lösungen Dissektion vorzubereiten, bereiten Isolierung der zerebralen Arterie und Vorbereitung der endothelialen Rohr PSS CaCl₂ (null Ca^{2 +} PSS) fehlt.
   3. Bereiten Sie alle Lösungen in hochreinen entionisiertem H₂O, anpassen des pH-Werts 7,4, durch einen Filter (0,22 µm Porengröße) zu sterilisieren und sicherzustellen, dass die Osmolalität der Lösungen zwischen 290 und 300 mOsm.
      Hinweis: Lösungen können etwa zwei Wochen bei 4 ° C aufbewahrt werden.
2. 10 % Rinderserumalbumin (BSA)
   1. Um 10 % BSA vorzubereiten, lösen Sie 1 g des lyophilisierten Pulvers in ein Becherglas von 10 mL Null Ca^{2 +} PSS.
   2. Decken Sie das Becherglas mit Paraffin Film und lassen Sie einen Zeitraum von mehreren Stunden passieren, mit langsamen Rühren die BSA aufzulösen.
   3. Filtern Sie die endgültige Lösung mit einer 10 mL Spritze plus 0,22 µm Filter und machen Sie 1 mL Aliquote bei-20 ° c gelagert werden
3. Dissektion Lösung
   1. Um 50 mL der Dissektion Lösung vorzubereiten, fügen Sie 500 µL der BSA (10 % hinzu) zu 49,5 mL Null Ca^{2 +} PSS.
   2. Sofort nach der Zubereitung übertragen Sie diese Dissektion-Lösung in eine Petrischale für arterielle Dissektion.
4. Dissoziation-Lösung
   1. Um 50 mL der Dissoziation Lösung vorzubereiten, fügen Sie 5 µL CaCl₂ (1 M) und 500 µL der BSA (10 %) auf 49,5 mL Null Ca^{2 +} PSS. Lassen Sie die Lösung bei Raumtemperatur (RT) sitzen.
5. Enzyme
   1. Bereiten Sie teilweise Verdauung der arteriellen Segmente 1 mL der Aufschlusslösung mit 0,31 mg/mL Papain, 0,5 mg/mL Dithioerythritol, 0,75 mg/mL Kollagenase (Typ H Mischung) und 0,13 mg/mL Elastase.
      Hinweis: Enzym-Aktivitäten können variieren; aber für unsere erfolgreichen Protokolle kommerziell gelieferte Enzymaktivitäten werden wie folgt: Papain ≥10 Einheiten/mg; Kollagenase ≥1 Einheiten/mg, N-[3-(2-Furyl)acryloyl]-Leu-Gly-Pro-Ala oder FALGPA Untergrund Umsatz; und Elastase ≥ 5 Einheiten/mg.
6. Vorbereitung von Fura-2 und pharmakologische Wirkstoffe
   1. Bereiten Sie Lager Konzentration (1 mM) von Fura-2 AM Farbstoff in DMSO. Bereiten Sie eine arbeiten-Konzentration (10 µM) 495 µL PSS für laden 5 µL Lager hinzu.
   2. Bereiten Sie ≥50 mL Konzentrationen von pharmakologischen Wirkstoffen (z. B. ATP) arbeiten in PSS entsprechend vor.
7. Durchführung von Lösung
   1. Bereiten Sie eine Durchführung von Lösung, 2 M KCl, durch Auflösen von KCl entionisiertem H₂O (7,455 g KCl in 50 mL H₂O).
   2. Filtern Sie der Lösung durch einen 0,22 µm Spritze Filter vor der Verfüllung der scharfen Elektroden.
8. Propidium Jodid (0,1 %)
   1. 10 mg gefriergetrockneten Propidium Jodid in 10 mL 2 M KCl auflösen.
   2. Gut mischen und speichern bei RT

(3) Dissektion und Isolierung von zerebralen Arterie

Hinweis: Alle Dissektion Verfahren erfordern Probe Vergrößerung (bis zu 50 X) über Stereomikroskope und Beleuchtung von Fiber optic Lichtquellen zur Verfügung gestellt. Zum Ausführen der Dissektion Verfahren zur Isolierung des Gehirns und der Arterien einsetzen Sie geschärften Dissektion Instrumente. Mikrodissektion Werkzeuge zu isolieren und reinigen die Arterien sind geschärft feine Spitzen Pinzette und Vannas Stil Dissektion Schere (3 bis 9,5 mm klingen).

1. Isolierung von Gehirn der Maus
   1. Eine C57BL/6-Maus (3-30 Monate alt, männlich oder weiblich) über Inhalation von Isofluran (3 % für 2 – 3 min.) zu betäuben, dann das Tier sofort nach vollständige Induktion der Anästhesie zu enthaupten. Legen Sie den Kopf in eine Petrischale (Durchmesser 10 cm, Tiefe 1,5 cm), kalt (4 ° C) enthält Null Ca^{2 +} PSS unter einem Stereomikroskop.
   2. Unter dem Mikroskop betrachten, die Haut und die Haare über den Schädel entfernen Sie und übermäßigen Blut mit kaltem Null Ca^{2 +} PSS. Machen Sie einen Schnitt mit nur die Spitzen der standard Dissektion Schere (z. B. 24 mm Klinge), beginnend mit dem Hinterhauptsbein und Verlängerung bis durch die nasale Knochen des Schädels.
   3. Öffnen Sie den Schädel sorgfältig entlang der Schnitt mit groben gekippt Zange und separate Bindegewebe, um das Gehirn mit einem intakten Kreis von Willis zu isolieren.
      Hinweis: Alternativ können Littauer Knochen schneiden Zangen verwendet werden, öffnen den Schädel und das Gehirn aussetzen.
   4. Waschen Sie vorsichtig dem isolierte Gehirn mit kalten Null Ca^{2 +} PSS in ein Becherglas, Blut zu entfernen. Legen Sie die Gehirn ventralen Seite nach oben in eine Kammer mit kalten Dissektion Lösung für die Isolierung der Hirnarterien (Abbildung 1A).
2. Isolierung der Hirnarterien
   Hinweis: Die hintere zerebrale Arterie wurde als eine repräsentative zerebrovaskuläre endotheliale Studienmodell für dieses Protokoll ausgewählt.
   1. Sichern Sie das isolierte Gehirn in kalten Dissektion Lösung mit Edelstahlstiften (Durchmesser 0,2 mm, Länge ~ 11 – 12 mm) in ein Holzkohle-infundiert Silikon-Polymer Beschichtung der Unterseite (Tiefe ≥50 cm) eines Glases Petrischale eingefügt werden soll.
   2. Verwenden Sie eine Dissektion Kammer durch ein Kühlsystem kontinuierlich Radfahren ein 1:1 Wasser-Ethylen-Glykol-Gemisch gekühlt, um eine gekühlte Temperatur von PSS während Dissektion beizubehalten. Alternativ kann die Dissektion auf frisches Eis durchgeführt werden.
   3. Chirurgisch zu isolieren, die hinteren Hirnarterien (~0.3 auf 0,5 cm Segmente, keine axiale Spannung) an der hinteren Kommunikation und basilaris Arterien mit Mikrodissektion Instrumente Vannas Stil Schere und geschärften feine Spitzen Pinzette (Abbildung 1 b ). Verwenden Sie Edelstahlstiften (Durchmesser 0,1 mm, Länge ~ 13 – 14 mm) sicher isoliert beide hintere Hirnarterien in die Dissektion-Lösung in der Petrischale (Abbildung 1).
   4. Reinigen Sie sorgfältig isolierten hinteren Hirnarterien, indem Bindegewebe mit geschärften feine Spitzen Pinzette (Abbildung 1). Intakte Arterien in Segmente geschnitten (Länge 1 – 2 mm) für die enzymatische Verdauung (Abbildung 1; Einschub).

4. Vorbereitung der endothelialen Rohr- und Superfusion

Hinweis: Die endotheliale Röhre ist bereit, wie zuvor beschrieben¹², mit Modifikationen für die zerebralen Arterie-⁶.

1. Bereiten Sie die Verreibung Vorrichtung unter Verwendung eines Mikroskops mit Zielen (10 X, 20 X und 40 X), eine Kamera und ein Aluminium-Bühne mit einer Kammer und Mikromanipulatoren ausgestattet. Sichern Sie eine Microsyringe mit einer Pumpensteuerung neben der Bühne und Probe (Abbildung 2A).
2. Völlig Hinterfüllung eine Verreibung pipette mit Mineralöl und sichern Sie ihn über den Mikro-Spritze-Kolben. Dann, mit der Mikro-Spritze mit Pumpensteuerung, Dissoziation Lösung in die Pipette zurückziehen (~ 130 nl) auf dem Mineralöl und gleichzeitig das Fehlen von Luftblasen in der Pipette.
3. Platzieren Sie intakt arteriellen Segmente in 1 mL der Lösung der Dissoziation in einer Glasröhre 10 mL (Abb. 2 b), mit 0,31 mg/mL Papain, 0,5 mg/mL Dithioerythritol, 0,75 mg/mL Kollagenase und Elastase 0,13 mg/mL. Bei 34 ° C für 10 – 12 min für teilweise Verdauung inkubieren.
4. Nach der Verdauung ersetzen der Enzymlösung mit ~ 5 mL frisches Dissoziation Lösung. Mit einer 1-mL-Pipette übertragen Sie ein Segment in eine Kammer, die die Dissoziation Lösung bei RT
5. Legen Sie die Pipette in die Dissoziation-Lösung in der Kammer, und positionieren Sie es in der Nähe von einem Ende des verdauten Schiffes. Legen Sie einen Preis im Bereich von 2 bis 5 nL/s auf die Pumpensteuerung für sanfte Verreibung (Abbildung 2, Einschub).
6. Während der Anzeige durch 100 X 200 X Vergrößerung, zurückziehen und Auswerfen der arteriellen Segments zu glatten Muskelzellen zu trennen, während die Herstellung einer endothelialen Rohres. Bei Bedarf verwenden Sie sorgfältig feine Spitzen Pinzette dissoziierten Adventitia und internen elastischen Lamina aus der endothelialen Tube zu trennen. Bestätigen Sie, dass alle glatten Muskelzellen getrennt sind und dass nur Endothelzellen als eine intakte "Tube" (Abbildung 2).
7. Mit Mikromanipulatoren, sichern Sie jedes Ende der endothelialen Röhre auf das Deckglas Glas der superfusion Kammer mit Borosilikatglas anheften Pipetten (Abb. 2D).
8. Wash-Out distanzierte Adventitia und glatten Muskelzellen aus der Kammer und ersetzen die Dissoziation-Lösung mit 2 mM CaCl₂ PSS. Die mobile Plattform mit gesicherten endotheliale Rohr auf das Mikroskop der superfusion und experimentelle Rig zu übertragen.
9. Verwenden Sie 6 saubere 50 mL Stauseen (Abbildung 3A) für kontinuierliche Lieferung von PSS und jeweiligen Droge Lösungen während des Experiments, je nach Bedarf. Verwenden Sie das Inline-Stromregelventil, um manuell die Durchflussmenge im ganzen als konsistent mit Laminar-Flow eingestellt, während passender Strömung zu Vakuum-Saug-feed. Liefern Sie PSS an die Kammer (Abb. 3 b) für die Superfusion der endothelialen Röhre für ≥ 5 min vor der Aufnahme die Hintergrunddaten und Farbstoff laden.

(5) Farbstoff Last, auswaschen und Temperatureinstellungen

1. Schalten Sie alle Komponenten des Systems zur Messung [Ca^{2 +}]_ichPhotometrie. Verwenden Sie das Mikroskop auf das experimentelle Rig (Abbildung 3), um das Endothel Rohr auf 400 X Vergrößerung und Fokus auf Zellen in der photometrischen Fenster mithilfe der Photometrie-System-Software-Suite anzuzeigen.
2. Messen Sie den Durchmesser der endothelialen Röhre und zeichnen Sie Autofluoreszenz Hintergrundwerte in Übereinstimmung mit 510 nm Emission während Alternative Erregung bei 340 und 380 nm (≥10 Hz auf).
3. [Ca^{2 +}]_ich Antworten zu messen, laden die endotheliale Röhre mit Fura-2 bin färben (10 µM Endkonzentration) bei RT und erlauben ~ 30 – 40 min in der Abwesenheit von Licht.
4. Starten Sie Superfusion der endothelialen Röhre mit frischen PSS für ~ 30-40 min zum Auswaschen überschüssige Farbstoff und ermöglichen intrazellulären Fura-2, de-esterify bin. Während der Wash-Out-Zeit erhöhen Sie die Temperatur allmählich von RT auf 37 ° C mit dem Temperatur-Controller (Abbildung 3A) mit einer Inline-Heizung, dann bei 37 ° C während des Experiments beibehalten.
   Hinweis: Die empfohlene schrittweise Übergang zwischen RT auf 37 ° C umfasst drei Schritte (z. B. 5 ° C) mit einer ≥5 min Gleichgewichtherstellung Zeit bei jedem Schritt.

(6) die gleichzeitige Messung von [Ca^{2 +}]_Ich und V_m

1. Schalten Sie alle anderen Geräte und die Elektrometer-Software-Suite für die Messung von V_m (siehe Abbildung 3, Abbildung 4). Erwerb der Datenrate entsprechend anpassen (≥10 Hz).
2. Ziehen Sie eine scharfe Elektrode und Hinterfüllung mit 2 M KCl. Für Studien der interzellulären Kopplung der Mikroelektroden über Dye-Transfer, Hinterfüllung mit 0,1 % Propidium Jodid aufgelöst in 2 M KCl.
3. Sichern Sie die Elektrode über ein Silberdraht mit Chlorid in der Pipette Halterung befestigt, Elektrometer Kopf frühzeitig gesichert mit einem Mikromanipulator beschichtet. Verwenden Sie die Mikromanipulator, um kurz die Spitze der Elektrode in die fließende PSS in der Kammer während der Anzeige durch das Objektiv 4 X position.
4. Die ruhenden V_m auf 0 als konsistent mit geerdeten Badewanne potenzielle gesetzt. Position der Spitze der Elektrode nur über eine Zelle der endothelialen Röhre. Falls gewünscht, verwenden Sie akustische Grundlinie Monitoren verbunden mit Stromzähler, die möglichen Aufnahmen Tonhöhe zugeordnet.
5. Erhöhen Sie Vergrößerung auf 400 x 40 X Objektiv mit und positionieren Sie die Spitze der Elektrode neu zu, je nach Bedarf. Passen Sie das photometrische Fenster mit der Photometrie Software auf ~ 50 bis 80 Endothelzellen konzentrieren.
6. Sanft legen Sie die Elektrode in eine der Zellen der endothelialen Röhre mit dem Mikromanipulator und warten Sie ≥2 min für den ruhenden V_m zu stabilisieren. In ähnlicher Weise legen Sie eine zweite Elektrode in einer anderen Zelle (Entfernung ≥100 µm) aus der ersten Zelle mit ersten Elektrode aufgespießt.
7. Sobald Ruhe V_m mit seiner erwarteten Werte stabil ist (-30 bis-40 mV)⁶, Einschalten der PMT auf der Fluoreszenz-Schnittstelle in der Abwesenheit von Licht und Erwerb von intrazellulären [Ca^{2 +}]_ich durch spannende Fura-2 abwechselnd beginnen (10 Hz) bei 340 und 380 nm beim Sammeln von Fluoreszenzemission bei 510 nm.
   Hinweis: Testen Sie interzelluläre elektrische Kopplung, aktuelle (± 0,5-3 nA, ~ 20 s Pulsdauer) als "Seite 1" über ein Elektrometer geliefert werden können, und Änderungen von V_m erfasst werden, mit einem anderen Elektrometer als "Seite 2" (Entfernung ≥100 µm).
8. Nachdem simultane Messungen V_m und [Ca^{2 +}]_ich eingerichtet wurden, können Sie ~ 5 min für die Superfusion der endothelialen Rohr mit PSS mit einer konstanten Laminar-Flow-Rate vor der Anwendung von Medikamenten.
9. Wenden Sie das Medikament (z. B. ATP) an die superfusion Kammer mit konstantem Volumenstrom in PSS vorbereitet. Nach ca. 3 min (oder einen Zeitraum für die Kinetik des Medikaments) zurück waschen mit PSS bis V_m und F340/f₃₈₀ Verhältnis an ihrer Grundlinie Bedingungen. Markieren Sie jeweiligen Aufnahmen als zeitlich synchronisierte über die Photometer und Elektrometer Software-Suiten, bei jedem Übergang von Lösungen.
10. Sobald das Experiment geschehen ist, die Zelle mit dem Mikromanipulator Elektrode entziehen und bemerken V_m ~ 0 mV wie referenziert durch die Bad-Elektrode. Stoppen Sie jeweiligen Aufnahmen von V_m und [Ca^{2 +}]_ich und speichern Sie die Datensätze auf Datei für die Datenanalyse.

(7) Visualisierung von Zelle zu Zelle Kupplung

1. Zell-Zell-Kopplung über Propidium Jodid zu visualisieren, verwenden Sie ein 40 X oder 60 X fluoreszierende Ziel mit ein relativ hoher numerischer Apertur (z. B. 0,95) und Rhodamin Filtersatz mit Solid-State-Beleuchtung, eine hochauflösende Kamera (z. B. 16- Megapixel) und eine imaging-Software-Suite.

Ergebnisse

Die schematische Demonstration des oben beschriebenen Protokolls ist in den beigefügten Abbildungen gezeigt. Abbildung 1Azeigt eine Gehirn von einem jungen Erwachsenen männlichen C57BL/6N Maus (5 Monate) isoliert. Hintere Hirnarterien sind sorgfältig isoliert aus dem Kreis von Willis, ohne Bindegewebe entfernt, und schneiden Sie in Segmente (Abbildung 1 b-D). Aus teilweise verdaute arteriellen Segmente das int...

Diskussion

Angesichts der jüngsten Entwicklungen^6,15,16,17zeigen wir nun die Methode zur Isolierung Maus zerebralen arteriellen Endothel in Vorbereitung für die gleichzeitige Messung von [Ca^{2 +}] _i und V_m zugrunde liegenden EDH konsequent für ~ 2 h bei 37 ° C. Obwohl es technisch schwierig ist, messen wir Zell-zu-Zell-Kupplung sowie (siehe Referenz⁶

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glucose	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	G7021
NaCl	Sigma	S7653
MgCl2	Sigma	M2670
CaCl2	Sigma	223506
HEPES	Sigma	H4034
KCl	Sigma	P9541
NaOH	Sigma	S8045
ATP	Sigma	A2383
HCl	ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)	A466250
Collagenase (Type H Blend)	Sigma	C8051
Dithioerythritol	Sigma	D8255
Papain	Sigma	P4762
Elastase	Sigma	E7885
BSA	Sigma	A7906
Propidium iodide	Sigma	P4170
DMSO	Sigma	D8418
Fura-2 AM dye	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	F14185
Recirculating chiller (Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Scientific	13874647
Plexiglas superfusion chamber	Warner Instruments, Camden, CT, USA	RC-27
Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm)	ThermoFisher Scientific	12-548-5M
Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm)	Warner Instruments	PM6 or PH6
Compact aluminum stage	Siskiyou, Grants Pass, OR, USA	8090P
Micromanipulator	Siskiyou	MX10
Stereomicroscopes	Zeiss, NY, USA	Stemi 2000 & 2000-C
Fiber optic light sources	Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss	Fostec 8375
Nikon inverted microscope	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA	Ts2
Phase contrast objectives	Nikon Instruments Inc	(Ph1 DL; 10X & 20X)
Fluorescent objectives	Nikon Instruments Inc	20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor)
Nikon inverted microscope	Nikon Instruments Inc	Eclipse TS100
Microsyringe pump controller (Micro4 )	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	SYS-MICRO4
Vibration isolation table	Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA	Micro-g
Amplifiers	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Headstages	Molecular Devices	HS-2A & HS-9A
Function generator	EZ Digital, Seoul, South Korea	FG-8002
Data Acquision System	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Digidata 1550A
Audible Baseline Monitors	Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA	BM-A-TM
Digital Storage Oscilloscope	Tektronix, Beaverton, Oregon, USA	TDS 2024B
Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	IonOptix Systems
Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344B or C
Inline Heater	Warner Instruments	SH- 27B
Valve Controller	Warner Instruments	VC-6
Inline Flow Control Valve	Warner Instruments	FR-50
Electronic Puller	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97 or P-1000
Microforge	Narishige, East Meadow, NY, USA	MF-900
Borosilicate Glass Tubes (Trituration)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	1B100-4
Borosilicate Glass Tubes (Pinning)	Warner Instruments	G150T-6
Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes)	Warner Instruments	GC100F-10
Syringe Filter (0.22 µm)	ThermoFisher Scientific	722-2520
Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard	Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA	DD-90-S-BLK
Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm)	World Precision Instruments	555640S, 14364
Scissors 3 & 7 mm blades	Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA	Moria MC52 & 15000-00
Sharpened fine-tipped forceps	FST	Dumont #5 & Dumont #55