Misurazioni simultanee di calcio intracellulare e potenziale di membrana nell'endotelio cerebrale Mouse appena isolato ed intatto

Riepilogo

Ha dimostrato qui sono protocolli per isolamento (1) appena endothelial cerebrali intatti "tubi" e misure (2) simultanee di calcio endoteliale e potenziale durante endotelio-derivato hyperpolarization della membrana. Inoltre, questi metodi consentono per la sintonizzazione farmacologico di calcio delle cellule endoteliali e segnali elettrici come variabili sperimentali individuali o interattive.

Abstract

Arterie cerebrali e loro rispettivi microcircolazione fornire ossigeno e sostanze nutritive per la regolazione del cervello tramite flusso sanguigno. Cellule endoteliali linea del lume dei vasi sanguigni e modifiche dei comandi in diametro vascolare come necessario per soddisfare la richiesta metabolica dei neuroni. Vie di segnalazione endoteliale-dipendente primarie di hyperpolarization di potenziale di membrana (V_m) e ossido nitrico in genere operano in parallelo per mediare la vasodilatazione e quindi aumentare il flusso sanguigno. Anche se parte integrante del coordinamento vasodilatazione sopra parecchi millimetri di lunghezza vascolare, componenti di hyperpolarization endotelio-derivato (EDH) sono stati storicamente difficili da misurare. Questi componenti di EDH comportano intracellulare Ca^{2 +} [Ca^{2 +}]_io aumenta e la successiva attivazione dei piccoli e intermedi conduttanza Ca^{2 +}-attivato K⁺ (SK_Ca/IK_Ca) canali.

Qui, presentiamo un'illustrazione semplificata dell'isolamento di endotelio fresco da arterie cerebrali del mouse; misurazioni simultanee di endoteliale [Ca^{2 +}]_i e V_m utilizzando Fura-2 fotometria e intracellulare degli elettrodi affilati, rispettivamente; e un continuo superfusione di soluzioni saline e agenti farmacologici in condizioni fisiologiche (pH 7.4, 37 ° C). Arterie cerebrali posteriori dal cerchio di Willis vengono rimossi senza il comunicante posteriore e le arterie basilare. Digestione enzimatica di segmenti arteriosi cerebrali posteriori puliti e successiva triturazione facilita la rimozione del adventitia, nervi perivascolari e cellule di muscolo liscio. Risultanti posteriori cerebrali arteriosi endoteliali "tubi" sono quindi protetti sotto un microscopio ed esaminati usando una macchina fotografica, fotomoltiplicatore, elettrometri e uno o due mentre sotto superfusione continua. Collettivamente, questo metodo può misurare simultaneamente variazioni endoteliali [Ca^{2 +}]_i e V_m in luoghi discreti cellulare, oltre alla diffusione di EDH attraverso giunzioni di gap fino a distanze di millimetro lungo l'intatta endotelio. Questo metodo è previsto un analisi di alto-rendimento delle funzioni endoteliali cerebrali sottesi ai meccanismi di regolazione del flusso sanguigno nel cervello normale e malato.

Introduzione

Il flusso sanguigno in tutto il cervello è regolato dal coordinamento di vasodilatazione tra cerebrale arterie ed arteriole in reti vascolari¹. Cellule endoteliali che allineano i cambiamenti di comando resistenza cerebrale arterie di diametro vascolare come necessaria a soddisfare la richiesta metabolica di neuroni^1,2,3. In particolare, durante il hyperpolarization endotelio-derivato (comunemente noto come EDH), intracellulare di Ca^{2 +} ([Ca^{2 +}]_i) e i segnali elettrici in cellule endoteliali vasodilatazione delle coordinate tra cellule endoteliali e la loro cellule di muscolo liscio circostanti attraverso giunzioni di gap per rilassamento arterioso⁴. Fisiologico iniziazione di EDH in sequenza comporta la stimolazione di G_q-accoppiato i ricevitori (GPCR), un aumento [Ca^{2 +}]_ie l'attivazione endoteliale piccolo - e intermedio-Ca^{2 +}-attivato K⁺ (SK_Ca/IK_Ca) canali per hyperpolarize membrana endoteliale cerebrale potenziale (V_m)^5,6,7. Così, l'intima relazione di endoteliale [Ca^{2 +}]_i e V_m è parte integrante della regolazione del flusso sanguigno e indispensabile per cardio - e cerebrovascolare funzione^6,8. In tutta la letteratura più ampia, numerosi studi hanno segnalato l'associazione di disfunzione endoteliale vascolare con lo sviluppo di malattie croniche (ad es., ipertensione, diabete, insufficienza cardiaca, malattia coronarica, insufficienza renale cronica, malattia delle arterie periferiche)^9,10, che indica l'importanza di studiare la funzione endoteliale in condizioni fisiologiche nonché patologiche.

Endotelio vascolare è parte integrante della produzione di hyperpolarization, vasodilatazione e perfusione tissutale e così, dall'esame delle sue proprietà cellulari nativo è cruciale. Come un modello di studio generale, preparazione del modello di tubo endoteliale arteriosa del topo è stato pubblicato prima per muscolo scheletrico^11,12, gut¹³, polmone¹⁴e recentemente per il cervello⁶. In particolare sono stati pubblicati studi di simultanea [Ca^{2 +}]_i e V_m misure per muscolo scheletrico endotelio arterioso^15,16 , nonché di endotelio linfatico del vaso¹⁷. Oltre a studi primari che utilizzano l'approccio di tubo endoteliale, una rassegna completa dei suoi vantaggi e svantaggi⁸ può essere consultata per determinare se questo strumento sperimentale è adatto per uno studio specifico. In breve, un vantaggio è che la chiave componenti fisiologiche della funzione delle cellule endoteliali sono state conservate (per esempio, afflusso di Ca^{2 +} e rilascio intracellulare, hyperpolarization di V_m fino al potenziale di Nernst per K⁺ via SK_Ca/IK_Ca l'attivazione e l'accoppiamento intercellulari endoteliali tramite giunzioni di gap) senza confondenti quali perivascolare del nervo input, la funzione dei canali voltaggio-dipendenti del muscolo liscio e la contrattilità, circolazione del sangue e influenze ormonali⁸. Al contrario, gli approcci comunemente utilizzati cella cultura introducono alterazioni significative nella morfologia¹⁸ e ioni canale espressione¹⁹ in un modo che può offuscare notevolmente confronti alle osservazioni fisiologiche determinate ex vivo o in vivo. Limitazioni includono la mancanza di integrazione con altri componenti essenziali per la regolazione del flusso sanguigno, come il muscolo liscio e limitata flessibilità in un piano sperimentale, come questo modello viene testato in modo ottimale all'interno di 4 h di isolamento del segmento vascolare intatto dall'animale.

Edificio da un precedente video protocollo scritto da Socha e Segal¹² e recenti sviluppi sperimentali in provvisorio^6,15,16, dimostriamo dichiara l'isolamento dell'endotelio fresco da arterie cerebrali posteriori e misure simultanee di endoteliale [Ca^{2 +}]_i e V_m utilizzando Fura-2 fotometria e intracellulare degli elettrodi affilati, rispettivamente. Inoltre, questo esperimento comporta superfusione continua di soluzioni saline e agenti farmacologici durante condizioni fisiologiche (pH 7.4, 37 ° C). Abbiamo scelto l'arteria cerebrale posteriore, in quanto produce endotelio isolato con l'integrità strutturale (cellule accoppiate tramite giunzioni gap) e sufficienti dimensioni (larghezza ≥ 50 µm, lunghezza ≥ 300 µm) trattabili per intra e segnalazione intercellulare lungo e tra cellule endoteliali. Inoltre, studi dell'arteria cerebrale posteriore roditore sono sostanzialmente rappresentati nella letteratura e comprendono l'esame dei fondamentali meccanismi di segnalazione endoteliale, sviluppo/invecchiamento vascolare e patologia^{20, 21 , 22}. questa applicazione sperimentale è previsto per produrre un'analisi di alto-rendimento della funzione endoteliale cerebrale (e disfunzione) e permetterà quindi per avanzamenti significativi nella comprensione della regolazione del flusso sanguigno in tutto invecchiamento e lo sviluppo delle malattie neurodegenerative.

Protocollo

Prima di condurre i seguenti esperimenti, assicurarsi che tutte le cure degli animali utilizzare e protocolli sono approvati dalla istituzionale animale cura ed uso Committee (IACUC) ed eseguite in accordo con del Consiglio nazionale delle ricerche "guida per la cura e l'uso di Animali da laboratorio "" (8^th Edition, 2011) e le linee guida ARRIVE. Il IACUC della Loma Linda University ha approvato tutti i protocolli utilizzati per questo manoscritto per topi C57BL/6 maschi e femmine (fascia d'età: 3-30 mo).

1. attrezzature e materiali

Nota: Dettagli dei materiali necessari per il protocollo possono essere trovati nella Tabella materiali, reagentie manuali o siti Web connessi con i rispettivi fornitori.

1. Camera di flusso
   1. Fissare una camera di sopraffusione con un fondo di vetrino coprioggetti di vetro in una piattaforma in alluminio anodizzato. Fissare la piattaforma con alloggiamento in un palcoscenico di compatto in alluminio.
   2. Impostare un micromanipolatore a ciascuna estremità della piattaforma sul palco in alluminio per tenere la pipetta il blocco.
      Nota: Come un'opzione pratica, è possibile utilizzare questo apparecchio fase trasferibili con un'unità di alloggiamento di flusso fissata per agevolare la transizione dall'isolamento del tubo endoteliale alle prestazioni degli esperimenti.
2. Microscopi
   1. Uso stereomicroscopi (5 x 50 gamma di ingrandimento x) dotato di sorgenti di luce ottica di fibra per le procedure di macro - e micro-dissezione.
   2. Per la preparazione dei tubi endoteliali, usare un microscopio rovesciato dotato di contrasto o differenziale interferenza contrasto (DIC) compatibili gli obiettivi di fase (10x, 20x e 40x) e una fase di alluminio.
   3. Per isolare i tubi endoteliali dai vasi sanguigni parzialmente digeriti, posizionare un controller di pompa di microsiringa adiacente all'apparato di preparazione tubo endoteliale.
   4. Per l'apparato sperimentale, è possibile usare un microscopio rovesciato con obiettivi standard (4 x e x 10) oltre a obiettivi fluorescenti (20x e 40x, apertura numerica 0.75) e una fase manuale in alluminio su un tavolo di isolamento delle vibrazioni.
3. Apparecchiatura di registrazione intracellulare
   1. Per registrare i V_m di cellule endoteliali in tubi endoteliali isolate, connettersi Elettrometro l'headstage compatibile. Se necessario, è possibile collegare un generatore di funzioni o stimolatore a Elettrometro per esperimenti che richiedono iniezione di corrente.
   2. Collegare le uscite amplificatore per un sistema di acquisizione dati, monitoraggi di base udibile e un oscilloscopio. Fissare l'elettrodo di riferimento (Ag/AgCl pellet) vicino all'uscita di camera di flusso durante gli esperimenti.
   3. Utilizzare un sistema fotometrico con componenti integrati di fluorescenza sistema interfaccia, alta intensità lampada ad arco e potenza elettrica, hyperswitch, fotomoltiplicatore (o PMT) e la macchina fotografica per misurare [Ca^{2 +}]_i in cellule endoteliali.
   4. Utilizzare un regolatore di temperatura dotato di un riscaldatore di inline per sollevare e mantenere una temperatura fisiologica (37 ° C) in tutto l'esperimento.
   5. Utilizzare una piattaforma di sei-serbatoio collegata a un controller di valvola con una valvola di controllo flusso inline per controllare la consegna delle rispettive soluzioni al cannotto endoteliale, fissata nella camera.
4. Micropipette e degli elettrodi affilati
   Nota: Per la fabbricazione di pipette per la triturazione e la stabilizzazione meccanica dei tubi endoteliali isolati, utilizzare un estrattore elettronico per la trazione le pipette e una micro-fucina per la rottura e lucidatura del fuoco.
   1. Per separare il adventitia, muscolo liscio e il tubo endoteliale dal segmento arterioso parzialmente digerito, preparare triturazione pipette (ciascuna con un diametro interno di punta di 80 – 120 µm) a seconda dei casi, utilizzando tubi capillari in vetro borosilicato e fuoco lucidare la punta.
   2. Per fissare il tubo endoteliale contro il fondo della camera di sopraffusione, usare pipette blocco con un'estremità smussata, sferica (calore-lucidato, OD di 100 – 150 µm; preparato da tubi in vetro borosilicato a parete sottile).
   3. Per registrare V_m di una cellula endoteliale, preparare degli elettrodi affilati con una resistenza di punta di ~ 150 ± 30 MΩ da tubi capillari di vetro usando un estrattore elettronico.

2. preparazione di soluzioni e farmaci

1. Soluzione salina fisiologica (PSS)
   1. Per un esperimento con le preparazioni di droga, preparare un minimo di 1 L di PSS utilizzando: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2mm CaCl₂, 1mm MgCl₂, acido N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic (HEPES) di 10 mM e 10 mM glucosio.
   2. Per preparare le soluzioni necessarie per dissezione, isolamento dell'arteria cerebrale e la preparazione del tubo endoteliale, preparare PSS carente CaCl₂ (zero Ca^{2 +} PSS).
   3. Preparare tutte le soluzioni in ultrapura deionizzata H₂O, regolare il pH a 7,4, sterilizzarli attraverso un filtro (dimensione dei pori di 0.22 µm) e assicurarsi che l'osmolalità delle soluzioni sia tra 290 e 300 mOsm.
      Nota: Soluzioni possono essere conservati a 4 ° C per circa due settimane.
2. 10% albumina di siero bovino (BSA)
   1. Per preparare 10% BSA, sciogliere 1 g di polvere liofilizzata in un becher di 10ml zero Ca^{2 +} PSS.
   2. Coprire il becher con la pellicola di paraffina e consentire un periodo di diverse ore per passare, con agitazione lenta per i BSA a dissolversi.
   3. Filtrare la soluzione finale utilizzando una siringa da 10 mL più un filtro da 0,22 µm e rendere le aliquote di 1 mL deve essere conservato a-20 ° C.
3. Soluzione di dissezione
   1. Per preparare 50 mL di soluzione di dissezione, aggiungere 500 µ l di BSA (10%) a 49,5 mL di zero Ca^{2 +} PSS.
   2. Immediatamente dopo la preparazione, è possibile trasferire questa soluzione di dissezione in una capsula Petri per dissezione arteriosa.
4. Soluzione di dissociazione
   1. Per preparare 50 mL di soluzione di dissociazione, aggiungere 5 µ l di CaCl₂ (1m) e 500 µ l di BSA (10%) a 49,5 mL di zero Ca^{2 +} PSS. Lasciare la soluzione a temperatura ambiente (TA).
5. Enzimi
   1. Per digestione parziale dei segmenti arteriosi, preparare 1 mL di soluzione di digestione con papaina 0,31 mg/mL, 0,5 mg/mL dithioerythritol, collagenosi 0,75 mg/mL (miscela tipo H) e dell'elastasi 0,13 mg/mL.
      Nota: Attività enzimatiche possono variare; Tuttavia, per i nostri protocolli di successo, le attività enzimatiche in commercio fornito sono state utilizzate come segue: papaina ≥ 10 unità/mg; collagenasi ≥ 1 unità/mg, per fatturato di substrato N-[3-(2-Furyl)acryloyl]-Leu-Gly-Pro-Ala o FALGPA; ed elastasi ≥ 5 unità/mg.
6. Preparazione di Fura-2 e agenti farmacologici
   1. Preparare la concentrazione d'archivio (1 mM) di Fura-2 tintura AM in DMSO. Preparare una concentrazione di lavoro (10 µM) aggiungendo 5 µ l di brodo a 495 µ l di PSS per il caricamento.
   2. Preparare ≥ 50 mL di concentrazioni di agenti farmacologici (ad es., ATP) di lavoro in PSS come appropriato.
7. Lo svolgimento di soluzione
   1. Preparare lo svolgimento di una soluzione, 2 M KCl, sciogliendo KCl deionizzata H₂O (7,455 g KCl in 50 mL di H₂O).
   2. Filtrare la soluzione attraverso un filtro per siringa da 0,22 µm prima del reinterro gli elettrodi taglienti.
8. Ioduro di propidio (0,1%)
   1. Sciogliere 10 mg di ioduro di propidio liofilizzato in 10 mL di KCl M 2.
   2. Mescolare bene e conservare a TA.

3. la dissezione e l'isolamento dell'arteria cerebrale

Nota: Tutte le procedure di dissezione richiedono ingrandimento campione (fino a 50 x) via stereomicroscopi e illuminazione fornita da fonti di luce ottica della fibra. Per eseguire procedure di dissezione per l'isolamento delle arterie e cervello, utilizzare strumenti per la dissezione affilata. Microdissection strumenti per isolare e pulire le arterie includono affilate punta fine pinze e forbici di Allerød stile dissezione (3 a 9,5 mm lame).

1. Isolamento di cervello di topo
   1. Anestetizzare una C57BL/6 mouse (3-30 mesi; maschi o femminile) tramite inalazione di isoflurane (3% per 2 – 3 minuti), poi decapitare l'animale immediatamente dopo completa induzione dell'anestesia. Posizionare la testa in una capsula Petri (diametro 10 cm, profondità 1,5 cm) contenenti freddo (4 ° C) zero Ca^{2 +} PSS sotto un microscopio stereoscopico.
   2. Visualizzazione attraverso il microscopio, rimuovere la pelle e capelli sul cranio e rimuovere sangue eccessivo con freddo zero Ca^{2 +} PSS. Fare un'incisione utilizzando solo le punte delle forbici per dissezione standard (ad es., lama 24 mm), inizia con l'osso occipitale e si estende fino attraverso l'osso nasale del cranio.
   3. Aprire il cranio con attenzione lungo l'incisione utilizzando pinze con la punta grossa e tessuto connettivo separato per isolare il cervello con un cerchio di Willis intatto.
      Nota: In alternativa, Littauer osso-pinze possono essere utilizzate per aprire il cranio ed esporre il cervello.
   4. Lavare delicatamente il cervello isolato con freddo zero Ca^{2 +} PSS in un becher per rimuovere il sangue. Posizionare il lato ventrale del cervello rivolto verso l'alto in una camera contenente soluzione di dissezione freddo per l'isolamento delle arterie cerebrali (Figura 1A).
2. Isolamento delle arterie cerebrali
   Nota: Arteria cerebrale posteriore è stato selezionato come un modello di studio endoteliale cerebrovascolare rappresentativo per questo protocollo.
   1. Proteggere il cervello isolato in soluzione fredda dissezione mediante perni in acciaio inox (diametro 0,2 mm, lunghezza ~ 11 – 12 mm) per essere inserito in un polimero di silicone carbone-infuso rivestimento del fondo (profondità ≥ 50 cm) di un vetro di Petri.
   2. Per mantenere una temperatura refrigerata di PSS durante la dissezione, è necessario utilizzare una camera di dissezione raffreddata da un sistema refrigerante continuamente in bicicletta una miscela di 1:1. acqua-etilene glicole. In alternativa, la dissezione può essere eseguita su ghiaccio fresco.
   3. Chirurgicamente isolare le arterie cerebrali posteriori (~0.3 a segmenti di 0,5 cm, nessuna tensione assiale) posteriore che comunica e arterie basilare mediante microdissezione strumenti Allerød stile forbici e affilato punta fine forcipe (Figura 1B ). Utilizzare perni in acciaio inox (diametro 0,1 mm, lunghezza ~ 13 – 14 mm) di sicuro entrambi isolato le arterie cerebrali posteriori della soluzione di dissezione in di Petri (Figura 1).
   4. Pulire accuratamente le arterie cerebrali posteriori isolate rimuovendo il tessuto connettivo usando il forcipe affilato punta fine (Figura 1). Tagliare le arterie intatte in segmenti (lunghezza 1 – 2 mm) per digestione enzimatica (Figura 1; inserto).

4. preparazione del tubo endoteliale e superfusione

Nota: Il tubo endoteliale è preparato come descritto in precedenza¹², con le modifiche per l' arteria cerebrale⁶.

1. Preparare l'apparato di triturazione utilizzando un microscopio dotato di obiettivi (10x, 20x e 40x), una fotocamera e una fase di alluminio che tiene una camera e micromanipolatori. Fissare una microsiringa con un regolatore della pompa adiacente al palco e campione (Figura 2A).
2. Completamente backfill una triturazione pipetta con olio minerale e fissarlo sopra il pistone di micro-siringa. Quindi, usando la micro-siringa con regolatore della pompa, aspirare la soluzione di dissociazione nella pipetta (~ 130 nl) sopra l'olio minerale, garantendo nel contempo l'assenza di bolle d'aria nella pipetta.
3. Posizionare i segmenti arteriosi intatti in 1 mL di soluzione di dissociazione in un tubo di vetro da 10 mL (Figura 2B), contenenti papaina 0,31 mg/mL, 0,5 mg/mL dithioerythritol, collagenosi 0,75 mg/mL e dell'elastasi 0,13 mg/mL. Incubare a 34 ° C per 10 – 12 min per digestione parziale.
4. In seguito la digestione, sostituire la soluzione di enzima con ~ 5 mL di soluzione fresca di dissociazione. Utilizzando una pipetta da 1 mL, trasferire un segmento in una camera contenente la soluzione di dissociazione a TA.
5. Inserire la pipetta la soluzione di dissociazione nella camera e la posizione vicino a un'estremità della nave digerita. Impostare una velocità all'interno della gamma di 2 a 5 nL/s sul controller pompa per triturazione delicato (Figura 2; inserto).
6. Durante la visualizzazione attraverso 100x ingrandimento 200x, prelevare ed espellere il segmento arterioso per dissociare le cellule di muscolo liscio, producendo un tubo endoteliale. Se necessario, accuratamente di utilizzare pinze a punta fine per separare adventitia dissociato e lamina elastica interna dal tubo endoteliale. Confermare che tutte le cellule di muscolo liscio sono dissociate e che rimangano solo endothelial cellule come un intatto "tubo" (Figura 2).
7. Utilizzando micromanipolatori, fissare ciascuna estremità del tubo endoteliale nella distinta di copertura di vetro della camera di sopraffusione usando vetro borosilicato pinning pipette (Figura 2D).
8. Sbiaditura dissociato adventitia e cellule di muscolo liscio dall'aula e sostituire la soluzione di dissociazione con 2 mM CaCl₂ PSS. Trasferire la piattaforma mobile con tubo protetto endoteliale sul microscopio di sopraffusione e sperimentale rig.
9. Utilizzare 6 serbatoi pulito 50 mL (Figura 3A) per una distribuzione continua di PSS e droga rispettive soluzioni durante l'esperimento, come appropriato. Utilizzare la valvola di controllo flusso inline per impostare manualmente la velocità di flusso in tutto come coerente con flusso laminare durante il flusso di alimentazione per aspirazione di vuoto di corrispondenza. Consegnare PSS all'alloggiamento (Figura 3B) per il superfusione del tubo endoteliale per ≥ 5 min prima di registrare i dati in background e tintura di caricamento.

5. carico dye, Wash-Out e impostazioni della temperatura

1. Accendere tutti i componenti del sistema per la misurazione [Ca^{2 +}]_iofotometria. Utilizzare il microscopio sulla piattaforma sperimentale (Figura 3) per visualizzare la provetta endoteliale a 400 ingrandimenti e messa a fuoco sulle cellule nella finestra fotometrica utilizzando la suite di software di sistema di fotometria.
2. Misurare il diametro del tubo endoteliale e registrare valori di autofluorescenza del fondo in accordo con 510 nm emissione durante l'eccitazione alternati a 340 e 380 nm (≥ 10 Hz).
3. Per misurare [Ca^{2 +}]_ho risposte, carico il tubo endoteliale con Fura-2 AM tingere (concentrazione finale di 10 µM) a RT e consentire ~ 30 – 40 min in assenza di luce.
4. Riavviare superfusione del tubo endoteliale con PSS fresco per circa 30 – 40 min di wash-out l'eccesso di colorante e consentire intracellulare Fura-2 AM a-esterificare. Durante il periodo di interruzione, aumentare la temperatura gradualmente da RT a 37 ° C con il regolatore di temperatura (Figura 3A) con un riscaldatore in linea, quindi mantenere a 37 ° C in tutto l'esperimento.
   Nota: La transizione incrementale consigliata tra RT a 37 ° C comporta tre passaggi (ad es., 5 ° C) con un tempo di equilibramento ≥ 5 min ad ogni passo.

6. simultanea misurazione della [Ca^{2 +}]_i e V_m

1. Accendere tutte le altre apparecchiature e la suite di software Elettrometro per misurare V_m (Vedi Figura 3, Figura 4). Regolare velocità di acquisizione dati di conseguenza (≥ 10 Hz).
2. Tirare un elettrodo tagliente e backfill con 2 M KCl. Per gli studi di intercellulare accoppiamento tramite sublimazione, recupero informazioni i microelettrodi con ioduro di propidio 0,1% disciolto in 2 M KCl.
3. Fissare l'elettrodo sopra un filo d'argento ricoperto in cloruro nel supporto pipetta attaccato ad una fase di testa Elettrometro fissata con un micromanipolatore. Utilizzare il micromanipolatore per posizionare brevemente la punta dell'elettrodo in PSS che scorre nella camera durante la visualizzazione attraverso l'obiettivo 4x.
4. Impostare il riposo V_m 0 come coerente con vasca a terra potenziale. Posizionare la punta dell'elettrodo di poco più di una cella del tubo endoteliale. Se lo si desidera, è possibile utilizzare monitoraggi di base acustico collegati a elettrometri per associare pitch del suono con registrazioni potenziali.
5. Aumentare l'ingrandimento di 400 x utilizzando l'obiettivo 40x e riposizionare la punta dell'elettrodo come necessario. Modificare la finestra fotometrica usando il software di fotometria di concentrarsi sulle cellule endoteliali ~ 50 a 80.
6. Delicatamente posizionare l'elettrodo in una delle cellule del tubo endoteliale utilizzando il micromanipolatore e ≥ 2 min per il riposo V_m stabilizzare l'ora. Allo stesso modo, è possibile inserire un secondo elettrodo in un'altra cella (distanza ≥ 100 µm) dalla prima cella impalata con primo elettrodo.
7. Una volta V_m di riposo è stabile a suoi valori previsti (da -30 a -40 mV)⁶, accendere la PMT nell'interfaccia di fluorescenza in assenza di luce e iniziare acquisizione di intracellulare [Ca^{2 +}]_io di emozionante Fura-2 alternativamente (10 Hz) presso 340 e 380 nm, mentre la raccolta l'emissione di fluorescenza a 510 nm.
   Nota: Alla prova intercellulare accoppiamento elettrico, corrente (± 0.5-3 nA, durata di impulso di s ~ 20) possono essere consegnati tramite uno Elettrometro come "Sito 1", e cambiamenti di V_m possono essere registrati con un altro Elettrometro come "sito 2" (distanza ≥ 100 µm).
8. Una volta che vengono stabilite misure simultanee di V_m e [Ca^{2 +}]_i , consentire ~ 5 min di superfusione del tubo endoteliale con PSS ad un tasso costante flusso laminare prima dell'applicazione di farmaci.
9. Applicare il farmaco (ad es., ATP) preparato in PSS alla camera di sopraffusione con il tasso di flusso costante. Dopo circa 3 min (o un periodo di tempo appropriato per la cinetica del farmaco), lavare con PSS fino al V_m e il rapporto di₃₈₀ F/f₃₄₀tornare loro condizioni di base. Contrassegnare le rispettive registrazioni come temporalmente sincronizzato attraverso la suite di software fotometro ed Elettrometro durante ogni transizione di soluzioni.
10. Una volta fatto l'esperimento, ritirare elettrodo dalla cella utilizzando il micromanipolatore e notare V_m ~ 0 mV a cui fa riferimento tramite l'elettrodo di vasca. Interrompere le rispettive registrazioni di V_m e [Ca^{2 +}]_i e salvare i record su file per l'analisi dei dati.

7. visualizzazione della cellula--cellula accoppiamento

1. Per visualizzare la cellula--cellula accoppiamento tramite ioduro di propidio, utilizzare una x 40 o 60 x fluorescente obiettivo con un'apertura numerica relativamente elevata (ad es., 0.95) e filtro rodamina impostato con illuminazione allo stato solido, una fotocamera ad alta risoluzione (ad esempio, 16- megapixel) e una suite di software di imaging.

Risultati

La dimostrazione schematica del protocollo descritto sopra è illustrata nelle figure allegate. Un cervello isolato da un giovane maschio adulto C57BL/6N topo (5 mesi) è mostrato in Figura 1A. Arterie cerebrali posteriori sono accuratamente isolate dal cerchio di Willis, rimosso senza tessuto connettivo e tagliato in segmenti (Figura 1B-D). Da segmenti arteriosi parzialmente digeriti, il tubo endoteliale intatto...

Discussione

Alla luce dei recenti sviluppi^6,15,16,17, ora dimostriamo il metodo per isolare endotelio arterioso cerebrale del mouse in preparazione per la misura simultanea della [Ca^{2 +}] _i e V_m sottostante EDH costantemente per ~ 2 h a 37 ° C. Anche se tecnicamente difficile, possiamo misurare la cellula--cellula che accoppiamento pure (Vedi riferimento^6<...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glucose	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	G7021
NaCl	Sigma	S7653
MgCl2	Sigma	M2670
CaCl2	Sigma	223506
HEPES	Sigma	H4034
KCl	Sigma	P9541
NaOH	Sigma	S8045
ATP	Sigma	A2383
HCl	ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)	A466250
Collagenase (Type H Blend)	Sigma	C8051
Dithioerythritol	Sigma	D8255
Papain	Sigma	P4762
Elastase	Sigma	E7885
BSA	Sigma	A7906
Propidium iodide	Sigma	P4170
DMSO	Sigma	D8418
Fura-2 AM dye	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	F14185
Recirculating chiller (Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Scientific	13874647
Plexiglas superfusion chamber	Warner Instruments, Camden, CT, USA	RC-27
Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm)	ThermoFisher Scientific	12-548-5M
Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm)	Warner Instruments	PM6 or PH6
Compact aluminum stage	Siskiyou, Grants Pass, OR, USA	8090P
Micromanipulator	Siskiyou	MX10
Stereomicroscopes	Zeiss, NY, USA	Stemi 2000 & 2000-C
Fiber optic light sources	Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss	Fostec 8375
Nikon inverted microscope	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA	Ts2
Phase contrast objectives	Nikon Instruments Inc	(Ph1 DL; 10X & 20X)
Fluorescent objectives	Nikon Instruments Inc	20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor)
Nikon inverted microscope	Nikon Instruments Inc	Eclipse TS100
Microsyringe pump controller (Micro4 )	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	SYS-MICRO4
Vibration isolation table	Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA	Micro-g
Amplifiers	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Headstages	Molecular Devices	HS-2A & HS-9A
Function generator	EZ Digital, Seoul, South Korea	FG-8002
Data Acquision System	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Digidata 1550A
Audible Baseline Monitors	Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA	BM-A-TM
Digital Storage Oscilloscope	Tektronix, Beaverton, Oregon, USA	TDS 2024B
Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	IonOptix Systems
Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344B or C
Inline Heater	Warner Instruments	SH- 27B
Valve Controller	Warner Instruments	VC-6
Inline Flow Control Valve	Warner Instruments	FR-50
Electronic Puller	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97 or P-1000
Microforge	Narishige, East Meadow, NY, USA	MF-900
Borosilicate Glass Tubes (Trituration)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	1B100-4
Borosilicate Glass Tubes (Pinning)	Warner Instruments	G150T-6
Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes)	Warner Instruments	GC100F-10
Syringe Filter (0.22 µm)	ThermoFisher Scientific	722-2520
Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard	Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA	DD-90-S-BLK
Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm)	World Precision Instruments	555640S, 14364
Scissors 3 & 7 mm blades	Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA	Moria MC52 & 15000-00
Sharpened fine-tipped forceps	FST	Dumont #5 & Dumont #55