Hücre içi kalsiyum ve taze izole ve olduğu gibi fare serebral endotel membran potansiyeli eşzamanlı ölçümler

Özet

Burada gösterdi (1) taze olduğu gibi beyin endotel "boru" ve endotel kalsiyum ve membran endotel kaynaklı hyperpolarization sırasında potansiyel (2) eşzamanlı ölçümler sorunlarının yalıtılması iletişim kurallarıdır. Ayrıca, bu yöntemler farmakolojik endotel hücre kalsiyum ve bireysel veya etkileşimli deneysel değişkenler olarak elektrik sinyali ayarlamak için izin verir.

Özet

Serebral arterler ve onların anılan sıraya göre mikro beyin yoluyla kan akışını düzenleme için oksijen ve besin teslim. Endotel hücreleri kan damarları ve komut değişiklikleri damar çapı lümen nöronların metabolik talebi karşılamak için gerektiği kadar satır. Hyperpolarization membran potansiyeli (V_m) ve nitrik oksit birincil endotel bağımlı sinyal yollar genellikle vazodilatasyon aracılık ve böylece kan akışını artırmak için paralel olarak çalışır. Vazodilatasyon damar uzunluğu birkaç milimetre koordine için ayrılmaz rağmen endotel kaynaklı hyperpolarization (EDH) bileşenlerinin ölçmek tarihsel olarak zor olmuş. EDH aşağıdaki bileşenlerden intrasellüler Ca^{2 +} [Ca^{2 +}]_ben artırır ve sonraki harekete geçirmek-in küçük - gerektirecektir ve gürültülerinden Ca^{2 +}orta-K⁺ aktif (SK_Catelefonu_Ca) kanalları.

Burada, fare serebral arterler gelen taze endotel yalıtım basitleştirilmiş bir örnek mevcut; endotel [Ca^{2 +}]_ben ve V_m Fura-2 fotometri ve hücre içi keskin elektrotlar, sırasıyla kullanarak eşzamanlı ölçümler; ve tuz çözümleri ve farmakolojik ajanlar (pH 7.4, 37 ° C) fizyolojik koşullarda sürekli bir superfusion. Posterior serebral arter Willis daire dan kaldırılır posterior iletişim ve baziler arter. Enzimatik sindirim temizlenmiş posterior serebral arter kesimleri ve sonraki toz adventitia, perivasküler sinirler ve düz kas hücreleri kaldırılmasını kolaylaştırır. Elde edilen posterior serebral arter endotel "tüpler" sonra mikroskop altında güvenli ve kullanma a fotoğraf makinesi, photomultiplier Tüp, ve bir iki electrometers sürekli superfusion iken altında inceledi. Toplu olarak, bu yöntem aynı anda endotel [Ca^{2 +}]_ben değişiklikler ve V_m EDH gap kavşak milimetre mesafeler boyunca bozulmadan kadar aracılığıyla yayılan ek olarak ayrı hücresel yerlerde ölçebilirsiniz endotel. Bu yöntem bir yüksek üretilen iş analiz serebral endotel fonksiyonları normal ve hastalıklı beyin kan akışı Yönetmelikte mekanizmaları temel verim bekleniyor.

Giriş

Beyin çevresinde kan akış vazodilatasyon serebral arterler ve arteriyoller damar ağları¹arasında koordinasyonu tarafından düzenlenmiştir. Serebral direnç arterler komut değişiklikleri nöronlar^1,2,3metabolik talebi karşılamak için gerektiği gibi damar çapı astar endotel hücreleri. Özellikle, endotel kaynaklı hyperpolarization (genellikle EDH bilinir), sırasında intrasellüler Ca^{2 +} ([Ca^{2 +}]_ben) ve endotel hücreleri koordinat vazodilatasyon endotel hücreleri arasında içinde elektrik sinyal ve onların arteryel gevşeme⁴için boşluk kavşak ile düz kas hücreleri çevreleyen. EDH fizyolojik inisiyasyon sırayla G_quyarılması gerektirir-reseptörleri (GPCRs), [Ca^{2 +}]_benve harekete geçirmek-in endotel küçük ve orta Ca^{2 +}artış birleştiğinde-K^{aktif +} (SK_Catelefonu_Ca) kanalları serebral endotel membran potansiyeli (V_m)^5,6,7hyperpolarize. Böylece, endotel [Ca^{2 +}]_ben ve V_m samimi ilişki kan akışı düzenleme için ayrılmaz ve vazgeçilmez kardiyo - ve serebrovasküler işlevi^6,8. Daha geniş edebiyat çok sayıda çalışma vasküler endotelyal disfonksiyon Derneği kronik hastalıklar (örn, hipertansiyon, diyabet, kalp yetmezliği, koroner arter hastalığı, kronik böbrek yetmezliği gelişimi ile bildirdin endotel işlevin yanı sıra patolojik fizyolojik koşullarda eğitim önemini belirten periferik arter hastalığı)^9,10.

Vasküler endotel hyperpolarization, vazodilatasyon ve doku perfüzyon üretimi için ayrılmaz bir parçasıdır ve bu nedenle yerel hücresel özellikleri incelenmesi önemlidir. Genel çalışma modeli olarak fare arteriyel endotelyal tüp modelinin hazırlanması daha önce iskelet kas^11,12, gut¹³, akciğer¹⁴ve son zamanlarda beyin⁶yayımlandı. Aynı anda [Ca^{2 +}]_ben ve V_m ölçümler özellikle lenf damarı endotel¹⁷yanı sıra kas iskelet damar endotel^15,16 yayınlanmıştır. Endotelyal tüp yaklaşım kullanarak birincil çalışmalar yanı sıra, kendi avantajları ve dezavantajları⁸ kapsamlı bir incelemesini bu deneysel araç belirli bir çalışma için uygun olup olmadığını belirlemek için danışılmalıdır. Kısacası, endotel hücre işlevi temel fizyolojik bileşenleri korunur bir avantaj olduğunu (örneğin, Ca^{2 +} akını ve hücre içi serbest bırakmak, V_m Nernst potansiyel ilâ hyperpolarization K⁺ için yolu ile SK_Catelefonu_Ca harekete geçirmek ve endotelyal hücreler arası bağlantı yolu ile gap kavşak) perivasküler sinir giriş, düz kas voltaj kanal işlevi ve contractility, gibi faktörler semptomlarıdır olmadan kan ve hormonal etkiler⁸dolaşımını. Buna ek olarak, yaygın olarak kullanılan hücre kültür yaklaşımlar morfoloji¹⁸ ve iyon kanal ifade¹⁹ büyük ölçüde karşılaştırmalar için fizyolojik gözlemler ex vivo belirlenen karartmak bir şekilde önemli değişiklikler tanıtmak veya Vivo. Bu model en iyi şekilde sağlam vasküler segment tecrit içinde 4 h test gibi düz kas ve deneysel bir zamanlamada sınırlı esneklik gibi kan akışını düzenleyen diğer temel bileşenleriyle bütünleşme eksikliği sınırlamaları içerir --dan belgili tanımlık hayvan.

Socha ve Segal¹² ve geçici^6,15,16, son deneysel gelişmeler tarafından hazırlanan bir önceki video protokolden bina bu vesile ile taze endotel yalıtım göstermek posterior serebral arter ve endotel [Ca^{2 +}]_ben ve V_m Fura-2 fotometri ve hücre içi keskin elektrotlar, sırasıyla kullanarak eşzamanlı ölçümler. Ayrıca, bu deneyi tuz çözümleri ve farmakolojik sürekli superfusion fizyolojik şartlarda (pH 7.4, 37 ° C) sırasında üzerine kuruludur. Yapısal bütünlük (gap kavşak ile birleştiğinde hücreleri) ve yeterli Boyutlar (Genişlik ≥50 µm, uzunluğu ≥300 µm) içi - ve hücreler arası boyunca ve arasında sinyal için mükellef ile izole endotel verimleri kadar posterior serebral arter seçti endotel hücreleri. Buna ek olarak, kemirgen posterior serebral arter çalışmaları önemli ölçüde literatürde gösterilir ve muayene, temel endotel sinyal mekanizmaları, vasküler geliştirme/yaşlanma ve patoloji^20, kapsayacak ^{21 , 22}. bu deneysel uygulama serebral endotel fonksiyonları (ve fonksiyon bozukluğu) yüksek üretilen iş analizini verim bekleniyor ve böylece kan akışı düzenleme anlamada önemli gelişmeler sağlayacak yaşlanma ve nörodejeneratif hastalık gelişimi.

Protokol

Aşağıdaki deneyler gerçekleştirmeden önce tüm hayvan bakımı kullanın ve iletişim kuralları hayvan Kurulusları ve kullanmak Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve Ulusal Araştırma Konseyi ''Kılavuzu ile uyum içinde gerçekleştirilen bakım ve kullanımı için olun Laboratuvar hayvanlarının" (8^th Edition, 2011) ve varış yönergeleri. Loma Linda Üniversitesi IACUC erkek ve dişi C57BL/6 fareler için bu el yazması için kullanılan tüm iletişim kuralları onayladı (Yaş Aralığı: 3-30 gün).

1. ekipman ve malzemeleri

Not: Ayrıntılar iletişim kuralı için gerekli malzemelerin Malzemeler tablo, reaktiflerve kılavuzları veya ilgili satıcıları ile ilişkili Web siteleri bulunabilir.

1. Akış odası
   1. Superfusion odası ile bir cam coverslip alt bir anodize alüminyum platforma bağlayın. Odası platformuyla kompakt alüminyum sahne içine güvenli.
   2. Bir micromanipulator her iki uçta platformu sabitleme pipet tutmak için alüminyum sahnede ayarlayın.
      Not: Pratik bir seçenek olarak, bu transfer edilebilir sahne cihaz deneyler performansını yalıtım endotelyal tüp geçiş kolaylaştırmak için güvenli bir akış odası birim ile kullanın.
2. Mikroskoplar
   1. Kullanım stereomicroscopes (5 x 50 x büyütme aralığı için) fiber optik ışık kaynağı makro ve mikro diseksiyon yordamları için donatılmıştır.
   2. Endotel tüpler hazırlanması için faz kontrast veya diferansiyel girişim kontrast (DIC) uyumlu hedefler (10 x, 20 x ve 40 x) ve bir alüminyum sahne ile donatılmış bir ters mikroskobu kullanın.
   3. Kısmen sindirilmiş kan damarları üzerinden endotel tüpler yalıtmak için bir microsyringe pompa denetleyicisi endotelyal tüp hazırlama cihazları için bitişik yerleştirin.
   4. Deneysel cihazları için standart objektif (4 x ve 10 x) ile donatılmış bir ters mikroskobu (20 x ve 40 x, sayısal diyafram 0,75) Floresan hedefleri ve titreşim yalıtım tabloya el ile alüminyum sahnede ek olarak kullanın.
3. Hücre içi kayıt cihazları
   1. Endotel hücrelerinin V_m izole endotel tüplerde kaydetmek için uyumlu headstage electrometer bağlayın. Gerekirse, bir işlev üreteci veya uyarıcı geçerli enjeksiyon gerektirir deneyleri için electrometer takın.
   2. Amplifikatör çıkış veri toplama sistemi, sesli temel monitörler ve bir osiloskop bağlayın. Referans elektrot (Ag/AgCl Pelet) akış odası çıkış deneyler sırasında güvenli.
   3. Fotometrik sistemle bir floresan sistem arabirimi, yüksek yoğunluk ark lambası ve güç kaynağı, hyperswitch, photomultiplier tüp (veya Devresel_ödeme), entegre bileşenlerle kullanın ve kamera [Ca^{2 +}]_ben endotel hücrelerinde ölçmek için.
   4. Bir satır içi ısıtıcı ile donatılmış bir sıcaklık denetleyicisi yükseltmek ve deneme boyunca fizyolojik bir sıcaklık (37 ° C) güncelleştirmek için kullanın.
   5. Bir satır içi akış kontrol valfi ile vana denetleyicisine bağlı bir altı-rezervuar platform odasında güvenli endotelyal tüp için ilgili çözümleri teslim denetlemek için kullanın.
4. Mikropipetler ve keskin elektrotları
   Not: Pipetler toz ve izole endotel tüpler mekanik stabilizasyon için üretimi için Pipetler ve mikro-demirhane kırma için çekmek için bir elektronik çektirmenin kullanın ve parlatma yangın.
   1. Adventitia, düz kas ve endotel tüp kısmen sindirilir arteryel segmentten ayırmak için borosilikat cam kılcal tüpler, kullanarak toz pipetler (her bir iç uç çapı 80 – 120 µm) uygun olarak hazırlamak ve ateş İpucu Lehçe.
   2. Endotel boru superfusion odası alt karşı güvenliğini sağlamak için sabitleme Pipetler ile körelmenin, küresel bir uçla çalışırsınız (ısı-cilalı, 100-150 µm; OD ince duvar borosilikat cam tüpler hazır).
   3. V_m endotel hücre kaydetmek için bir ipucu direnci ~ 150 ± 30 ile keskin elektrotları hazırlayın cam kılcal tüpler bir elektronik çektirme kullanarak üzerinden MΩ.

2. çözüm ve uyuşturucu hazırlanması

1. Fizyolojik tuz solüsyonu (PSS)
   1. Uyuşturucu hazırlıkları ile bir deneme için en az 1 L PSS kullanarak hazırlamak: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic asit (HEPES) ve 10 mM glikoz.
   2. Diseksiyon için gerekli çözümleri hazırlamak için yalıtım serebral arter ve endotelyal Tüp, hazırlanması hazırlamak PSS CaCl₂ (sıfır Ca^{2 +} PSS) eksik.
   3. Ultrasaf deiyonize H₂O tüm çözümler hazırlamak, pH 7.4 için ayarlamak, onları bir filtreden (0,22 µm gözenek boyutu) sterilize ve çözümleri osmolalite 290 ve 300 mOsm arasında olduğundan emin olun.
      Not: Çözümler 4 ° C'de yaklaşık iki hafta boyunca saklanır.
2. % 10 sığır Serum Albumin (BSA)
   1. % 10 BSA hazırlamak için 1 g lyophilized tozu bir ölçek-10 mL sıfır Ca^{2 +} PSS geçiyoruz.
   2. Parafin film ile kabı kapsar ve BSA erimeye için yavaş karıştırma ile geçmek, birkaç saatlik bir süre olanak sağlar.
   3. Nihai çözüm 10 mL şırınga artı 0,22 µm filtre kullanarak filtre ve 1 mL aliquots-20 ° C'de depolanan yapmak
3. Diseksiyon çözüm
   1. 50 mL diseksiyon çözeltisi hazırlamak için BSA (% 10) 500 µL 49,5 mL için sıfır Ca^{2 +} PSS ekleyin.
   2. Hemen hazırlık sonra bu diseksiyon çözüm içine arteriyal diseksiyon için Petri kabına aktarın.
4. Ayrılma çözüm
   1. 50 mL ayrılma çözeltisi hazırlamak için 5 µL CaCl₂ (1 M) ekleyin ve BSA (% 10) 500 µL sıfır Ca^{2 +} PSS 49,5 mL için. Oda sıcaklığında (RT) oturmak çözüm sağlar.
5. Enzimler
   1. Arteryel kesimleri kısmi sindirim için 1 mL sindirim çözeltisi 0.31 mg/mL papain, 0,5 mg/mL dithioerythritol, 0.75 mg/mL collagenase (tip H karışım) ve 0.13 mg/mL elastase hazırlayın.
      Not: Enzim aktiviteleri değişebilir; Ancak, bizim başarılı iletişim kuralları için ticari olarak sağlanan enzim aktiviteleri aşağıdaki gibi kullanılmıştır: papain ≥10 birimleri/mg; collagenase ≥1 birimleri/mg, N-[3-(2-Furyl)acryloyl]-Leu-Gly-Pro-Ala veya FALGPA substrat ciro için; ve elastase ≥ 5 adet/mg.
6. Fura-2 ve farmakolojik hazırlanması
   1. Hisse senedi toplama (1 mM) Fura-2 hazırlamak DMSO AM boya. Bir çalışma konsantrasyonu (10 µM) yükleme için PSS 495 µL için stok 5 µL ekleyerek hazırlayın.
   2. Farmakolojik ajanlar (örneğin, ATP) konsantrasyonları çalışma ≥50 mL PSS içinde uygun şekilde hazırlayın.
7. Çözüm iletken
   1. Bir iletken hazırlamak KCl (7.455 g KCl 50 mL H₂O) deiyonize H₂O içinde eriterek tarafından çözüm, 2 M KCl,.
   2. Çözüm keskin elektrotlar aracılığıyla 0,22 µm şırınga filtre dolgu önce filtre uygulayın.
8. Propidium iyodür (% 0,1)
   1. 10 mg liyofilize propidium iyodür 10 ml 2 m KCl geçiyoruz.
   2. Mix iyi ve RT. mağaza

3. diseksiyon ve yalıtım serebral arter

Not: Tüm diseksiyon yordamlar örnek büyütme (50 x) stereomicroscopes ve fiber optik ışık kaynağı tarafından sağlanan aydınlatma yoluyla gerektirir. Beyin ve damar yalıtımı için diseksiyon yordamları gerçekleştirmek için keskin diseksiyon aletleri kullanın. İzole ve arterler temiz mikrodiseksiyon araçlar bilenmiş ince uçlu forseps ve kenasen tarzı diseksiyon makası (3-9,5 mm bıçaklar) içerir.

1. Yalıtım fare beyin
   1. Bir C57BL/6 fare (3-30 ay eski; erkek veya kadın) üzerinden zehirlenmesinden isoflurane (2-3 dakika için % 3) anestezi, sonra hemen ardından tam anestezi indüksiyon hayvan başını kesmek. Başından bir Petri kabına yerleştirin (çapı 10 cm, derinliği 1,5 cm) soğuk (4 ° C) içeren sıfır Ca^{2 +} PSS bir stereomicroscope altında.
   2. İle mikroskop ile ilgilenen, cilt ve saç üzerinde kafatasını ve soğuk ile aşırı kan sıfır Ca^{2 +} PSS kaldırın. Oksipital kemik ile başlayan ve kafatası burun kemiği uzanan sadece ipuçlarını standart diseksiyon makası (örneğin, 24 mm bıçak) kullanarak bir kesi yapmak.
   3. Kafatası dikkatle Willis bir bozulmamış daire ile beyin yalıtmak için kaba uçlu forseps ve ayrı bağ dokusu kullanarak kesi boyunca açın.
      Not: Alternatif olarak, Littauer kemik kesme forseps kafatasını açıp beyin ortaya çıkarmak için kullanılabilir.
   4. Sıfır Ca^{2 +} kan kaldırmak için PSS bir ölçek yavaşça soğuk ile izole beyin yıkama. Yukarı bakacak şekilde soğuk diseksiyon çözüm için yalıtım serebral arter (Şekil 1A) içeren bir odasında beyin ventral yanına koyun.
2. Yalıtım serebral arter
   Not: Posterior serebral arter bu iletişim kuralı için bir temsilci serebrovasküler endotel çalışma modeli olarak seçilmiş olabilir.
   1. Paslanmaz çelik pim kullanarak soğuk diseksiyon çözüm izole beyin güvenli (çapı 0.2 mm, uzunluğu ~ 11-12 mm) bir cam Petri kabına (Derinlik ≥50 cm) alt kaplama bir kömür-infüzyon silikon polimer eklenecek.
   2. Diseksiyon sırasında PSS soğutulmuş sıcaklığını korumak için sürekli bir 1:1 su-etilen glikol karışımı Bisiklete binme bir soğutucu sistem tarafından soğutmalı bir diseksiyon odası kullanın. Alternatif olarak, diseksiyon taze buz üzerinde gerçekleştirilebilir.
   3. Cerrahi olarak posterior önlememek posterior serebral arter (0.5 cm kesimine ~0.3, eksenel gerginlik yok) ve baziler arter mikrodiseksiyon aletleri kenasen tarzı makas ve keskinleşmiş ince uçlu forseps (Şekil 1B kullanarak izole etmek ). Paslanmaz çelik pim kullanmak (çapı 0.1 mm, uzunluğu ~ 13-14 mm) için güvenli her ikisi de posterior serebral arter Petri kabına (Şekil 1 c) diseksiyon çözümde izole.
   4. İzole posterior serebral arter dikkatle bağ dokusu bilenmiş ince uçlu forseps (Şekil 1 d) kullanarak kaldırarak temizleyin. Sağlam damar parça halinde kesilmiş (uzunluğu 1-2 mm) (Şekil 1 d; iç metin) enzimatik sindirim için.

4. endotel tüp ve Superfusion hazırlanması

Not: Endotelyal tüp¹², değişiklikler için serebral arter⁶ile daha önce açıklandığı gibi hazırlanır.

1. Hedefler (10 x, 20 x ve 40 x), bir kamera ve bir oda ve micromanipulators tutan bir alüminyum sahne ile donatılmış bir mikroskop kullanarak toz aparatı hazırlayın. Bir microsyringe sahne ve numune (Şekil 2A) bitişik bir pompa denetleyicisiyle güvenli.
2. Tamamen backfill bir toz mineral yağ ile pipet ve mikro-şırınga pistonu üzerinde güvenli. O zaman, mikro şırınga pompa denetleyicisi ile kullanarak, ayrılma çözüm pipet çekilme (~ 130 nl) madeni yağ pipet hava kabarcıkları yokluğu sağlanması sırasında üstüne.
3. Sağlam arteryel kesimleri 0.31 mg/mL papain, 0,5 mg/mL dithioerythritol, 0.75 mg/mL collagenase ve 0.13 mg/mL elastase içerir bir 10 mL Cam Tüp (Şekil 2B), ayrılma çözeltinin 1 mL içine yerleştirin. Kısmi sindirim için 10-12 dakika 34 ° C'de kuluçkaya.
4. Sindirim, enzim çözüm ~ 5 mL taze ayrılma çözeltisi ile değiştirin. 1 mL pipet kullanarak, bir kesimi RT., ayrılma solüsyon içeren bir odaya transfer
5. Ayrılma çözüm odasında pipet yerleştirin ve sindirilmiş gemi bir ucunu yakın konumlandırın. Pompa denetleyicisindeki nazik toz (Şekil 2C; iç metin) için 2 ile 5 nL/s aralığında bir oranını ayarlamak.
6. 100 x 200 x büyütme ile görüntüleme, süre geri çekilin ve düz kas hücreleri bir endotelyal tüp üretirken ayırmak için arteryel segment dışarı atmak. Dikkatle gerekirse, ince uçlu forseps Disosiye adventitia ve iç elastik lamina endotel tüpünden ayırmak için kullanın. Tüm düz kas hücreleri ayrışmış ve sadece endotel hücreleri bir bozulmamış "tüp" (Şekil 2C) kalmadığından emin olun.
7. Micromanipulators kullanarak, her iki ucuna borosilikat cam pipetler (Şekil 2B) bağlantılarını kullanarak superfusion odasının cam kapak notu üzerindeki endotelyal tüp güvenli.
8. Wash-out adventitia ve düz kas hücrelerinden odası ve Değiştir ayrılma çözüm 2 mM CaCl₂ PSS ile ilişkisini. Mobil platformu ile güvenli endotelyal tüp mikroskop superfusion ve deneysel teçhizat üzerine aktarın.
9. 6 temiz 50 mL rezervuar (Şekil 3A) uygun olarak deney sırasında PSS ve ilgili ilaç çözümleri sürekli teslimi için kullanın. Satır içi akış kontrol vanası el ile ayarlamak debi boyunca laminar akış ile tutarlı olarak vakum emme için yem akışı eşleştirme için kullanın. PSS odasına (Şekil 3B) ≥ 5 min için endotelyal tüp superfusion için arka plan veri ve yükleme boya kaydetmeden önce teslim.

5. boya yük, Wash-Out ve sıcaklık ayarları

1. [Ca^{2 +}]_benölçme fotometri sisteminin tüm bileşenleri etkinleştirin. Mikroskop deneysel Kulesi (Şekil 3 c) 400 x büyütme ve odak endotelyal tüp hücreleri fotometri sistem yazılım paketi kullanarak fotometrik penceresinde görüntülemek için kullanın.
2. Endotelyal tüp çapı ölçmek ve 510 nm Emisyon 340 ve 380 nm (≥10 Hz), alternatif uyarma sırasında ile uyum içinde arka plan autofluorescence değerlerini kaydedin.
3. [Ca^{2 +}]_ben yanıt-e doğru ölçmek için yük Fura-2 ile endotel tüp RT boya (10 µM son konsantrasyonu) kulüpler ve ~ 30-40 izin ışık yokluğunda min.
4. Superfusion ~ 30 – 40 için taze PSS ile endotel tüpün yeniden wash-out için dakika fazla boya ve hücre içi izin Fura-2 de-esterify üzereyim. Wash-out süresi içinde yavaş yavaş üzerinden RT sıcaklığı 37 ° c sıcaklık kontrolörü (Şekil 3A) ile bir satır içi ısıtıcı kullanarak artırmak sonra deneme boyunca 37 ° C'de korumak.
   Not: RT 37 ° c arasında önerilen artımlı geçiş ≥5 min denge teker teker her adım ile üç adım (örneğin, 5 ° C) üzerine kuruludur.

6. aynı zamanda yapılan ölçüm [Ca^{2 +}]_ben ve V_m

1. Diğer ekipman ve V_m ölçme electrometer yazılım paketi açın (bkz: Şekil 3, Şekil 4). Veri toplama hızı uygun şekilde ayarlayın (≥10 Hz).
2. Bir keskin elektrot ve IS ile 2 M KCl çekin. Hücreler arası çalışmaları için %0,1 propidium iyodür 2 M KCl çözünmüş ile microelectrodes boya transferi, backfill kaplin.
3. Elektrot bir micromanipulator ile güvenli bir electrometer kafa sahne bağlı pipet tutucu klorür ile kaplı bir gümüş tel üzerinde güvenli. Micromanipulator kısa bir süre ise 4 x objektif aracılığıyla görüntüleme odasında akan PSS içine elektrot ucunu konumlandırmak için kullanın.
4. Dinlenme V_m potansiyel için topraklı banyo ile tutarlı olarak 0 olarak ayarlanır. Elektrot ucunu sadece endotelyal tüp bir hücrenin üzerine getirin. İsterseniz, sesli temel monitörler için electrometers bağlı ses pitch potansiyel kayıtları ile ilişkilendirmek için kullanın.
5. 400 x 40 x amacı istimal büyütmeyi ve elektrot ucunu gerektiği gibi yeniden konumlandırın. ~ 50-80 endotel hücreleri üzerinde odaklanmaya fotometri yazılımını kullanarak fotometrik penceresi ayarlamak.
6. Yavaşça elektrot micromanipulator kullanarak endotelyal tüp hücrelerinin yerleştirin ve ≥2 dakika stabilize etmek dinlenme V_m için bekleyin. Benzer şekilde, ikinci bir elektrot ile ilk elektrot Impaled ilk hücreden başka bir hücreye (mesafe ≥100 µm) ekleyin.
7. V_m dinlenme onun beklenen değerler stabil bir kez (-30 -40 ile mV)⁶, Devresel_ödeme ışık yokluğunda floresans arabirimde etkinleştirin ve hücre içi [Ca^{2 +}]_ben heyecan verici Fura-2 edinimi dönüşümlü olarak başlar (10 Hz), 510, floresans emisyon toplarken 340 ve 380 nm nm.
   Not: Hücreler arası elektrik bağlantı, geçerli test etmek için (± 0,5-3 nA, ~ 20 s darbe süresi) ile bir electrometer "Site 1" olarak teslim edilebilir ve değişiklikleri V_m başka bir electrometer ile kaydedilen "2" (mesafe ≥100 µm) Site.
8. V_m ve [Ca^{2 +}]_ben eşzamanlı ölçümler kurulur, ~ 5 min için uygulamadan önce ilaçların sürekli laminer akış hızında PSS ile endotel tüp superfusion izin verme.
9. Sürekli akış hızı ile superfusion odasına PSS içinde hazırlanan ilaç (örneğin, ATP) uygulanır. ~ 3 dk (veya ilaç kinetik için uygun bir süre) sonra V_m kadar PSS ile yıkama ve F₃₄₀/F₃₈₀ oranı temel durumları döndürür. İlgili kayıtları geçici eşitlenmiş olarak foto ölçüler ve electrometer yazılım paketleri arasında çözümler her geçişinde işaretleyin.
10. Deneme yaptıktan sonra elektrot micromanipulator kullanarak hücreden çekilme ve V_m fark ~ 0 olarak banyo elektrot tarafından başvurulan mV. İlgili kayıtları V_m ve [Ca^{2 +}]_ben durdurmak ve kayıtları veri analizi için dosyayı kaydedin.

7. görsel olarak hücre hücre kaplin

1. Hücre hücre kaplin yoluyla propidium iyodür görselleştirmek için 40 x veya 60 x floresan amacı ile nispeten yüksek bir sayısal diyafram kullanın (örneğin, 0.95) ve rodamine filtre ayarlamak katı hal aydınlatma ile bir yüksek çözünürlüklü kamera (örneğin, 16- megapiksel) ve bir görüntüleme yazılım paketi.

Sonuçlar

Yukarıda açıklanan protokol şematik gösterimi ekli resimler gösterilir. Bir genç yetişkin erkek C57BL/6N fare (5 ay) izole bir beyin Şekil 1Aile gösterilir. Posterior serebral arterler gelen daire, bağ dokusu kaldırıldı ve kesimleri (Şekil 1B-D) içine kesilmiş Willis, dikkatli bir şekilde izole edilmiştir. Kısmen sindirilir arteryel kesimleri sağlam endotel tüp üretilen ve cam kapak sabitle...

Tartışmalar

Son gelişmeler^6,15,16,17ışığında, biz şimdi fare serebral damar endotel [Ca^{2 +}] eşzamanlı ölçümü için hazırlık yalıtmak için yöntem göstermek _ben ve sürekli olarak 37 ° C'de ~ 2 h için EDH temel V_m Her ne kadar teknik olarak zor, hücre hücre de (bkz: başvuru⁶, Şekil 1) kaplin ölçebilirsiniz. Bu şekilde, ayrı...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glucose	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	G7021
NaCl	Sigma	S7653
MgCl2	Sigma	M2670
CaCl2	Sigma	223506
HEPES	Sigma	H4034
KCl	Sigma	P9541
NaOH	Sigma	S8045
ATP	Sigma	A2383
HCl	ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)	A466250
Collagenase (Type H Blend)	Sigma	C8051
Dithioerythritol	Sigma	D8255
Papain	Sigma	P4762
Elastase	Sigma	E7885
BSA	Sigma	A7906
Propidium iodide	Sigma	P4170
DMSO	Sigma	D8418
Fura-2 AM dye	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	F14185
Recirculating chiller (Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Scientific	13874647
Plexiglas superfusion chamber	Warner Instruments, Camden, CT, USA	RC-27
Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm)	ThermoFisher Scientific	12-548-5M
Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm)	Warner Instruments	PM6 or PH6
Compact aluminum stage	Siskiyou, Grants Pass, OR, USA	8090P
Micromanipulator	Siskiyou	MX10
Stereomicroscopes	Zeiss, NY, USA	Stemi 2000 & 2000-C
Fiber optic light sources	Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss	Fostec 8375
Nikon inverted microscope	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA	Ts2
Phase contrast objectives	Nikon Instruments Inc	(Ph1 DL; 10X & 20X)
Fluorescent objectives	Nikon Instruments Inc	20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor)
Nikon inverted microscope	Nikon Instruments Inc	Eclipse TS100
Microsyringe pump controller (Micro4 )	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	SYS-MICRO4
Vibration isolation table	Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA	Micro-g
Amplifiers	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Headstages	Molecular Devices	HS-2A & HS-9A
Function generator	EZ Digital, Seoul, South Korea	FG-8002
Data Acquision System	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Digidata 1550A
Audible Baseline Monitors	Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA	BM-A-TM
Digital Storage Oscilloscope	Tektronix, Beaverton, Oregon, USA	TDS 2024B
Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	IonOptix Systems
Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344B or C
Inline Heater	Warner Instruments	SH- 27B
Valve Controller	Warner Instruments	VC-6
Inline Flow Control Valve	Warner Instruments	FR-50
Electronic Puller	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97 or P-1000
Microforge	Narishige, East Meadow, NY, USA	MF-900
Borosilicate Glass Tubes (Trituration)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	1B100-4
Borosilicate Glass Tubes (Pinning)	Warner Instruments	G150T-6
Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes)	Warner Instruments	GC100F-10
Syringe Filter (0.22 µm)	ThermoFisher Scientific	722-2520
Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard	Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA	DD-90-S-BLK
Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm)	World Precision Instruments	555640S, 14364
Scissors 3 & 7 mm blades	Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA	Moria MC52 & 15000-00
Sharpened fine-tipped forceps	FST	Dumont #5 & Dumont #55