מדידות סימולטני של סידן תאיים, פוטנציאל ממברנה אנדותל מוחי העכבר טרי מבודדת ללא פגע

Md A. Hakim; Erik J. Behringer

doi:10.3791/58832

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

המודגמות כאן הם פרוטוקולים לבידוד (1) טרי שלם מוחי אנדותל "צינורות" ומדידות (2) בו זמנית הסידן אנדותל של קרומית אפשרית במהלך אנדותל, נגזר hyperpolarization. עוד, שיטות אלה מאפשרים כוונון תרופתי של תאי אנדותל סידן, איתות חשמלי כמשתנים ניסיוני בודדים או אינטראקטיביות.

Abstract

העורקים המוחיים ו microcirculation בהתאמה שלהם לספק חמצן וחומרים מזינים המוח דרך הדם לזרום ברגולציה. תאי אנדותל קו לומן של כלי דם ושינויים הפקודה קוטר כלי הדם לפי הצורך כדי בדרישה המטבולית של נוירונים. תלויי-אנדותל העיקרי איתות המסלולים של hyperpolarization של תחמוצת החנקן ו קרומית אפשרית (V_m) בדרך כלל פועלים במקביל כדי לתווך vasodilation ובכך להגביר את זרימת הדם. אמנם חלק בלתי נפרד תיאום vasodilation מעל מספר מ מ אורך כלי הדם, רכיבים של אנדותל, נגזר hyperpolarization (EDH) היה מבחינה היסטורית קשה למדוד. רכיבים אלה של EDH כרוכה תאיים Ca^{2 +} [Ca^{2 +}]_אני מגדילה והפעלה עוקבות של קטן - ו ביניים מוליכות Ca^{2 +}-מופעל K⁺ (SK_Caגבירותיי_Ca) ערוצים.

כאן, אנו מציגים דוגמה מפושטת של הבידוד של אנדותל טריים מן העורקים המוחיים העכבר; מדידות סימולטני של אנדותל [Ca^{2 +}]_אניו- V_m באמצעות Fura-2 photometry ואלקטרודות חד תאיים, בהתאמה; של superfusion רציפה של פתרונות מלח וסוכני תרופתי בתנאים פיזיולוגיים (pH 7.4, 37 ° C). העורקים המוחיים האחורי של המעגל של וויליס יוסרו חינם של תקשורת האחורי, העורקים למפרצת. עיכול אנזימטי של נקי האחורי מקטעי עורקי המוח, trituration הבאים מקלה על הסרת adventitia, perivascular העצבים ותאי שריר חלק. וכתוצאה מכך האחורי מוחית עורקית אנדותל "צינורות" ואז מאובטחים תחת מיקרוסקופ ובחן באמצעות מצלמה, האופטיקה צינור, 1 ו- 2 electrometers תחת superfusion מתמשך. באופן קולקטיבי, בשיטה זו ניתן למדוד בו זמנית לשינויים אנדותל [Ca^{2 +}]_אני ו- V_m במיקומים הסלולר דיסקרטית, בנוסף הפצת EDH דרך הפער צמתי עד מילימטר במרחקים לאורך ללא פגע אנדותל. שיטה זו צפוי להניב ניתוח תפוקה גבוהה של הפונקציות אנדותל מוחי שבבסיס מנגנוני ויסות זרימת דם במוח רגיל וחולים.

Introduction

זרימת הדם ברחבי המוח מוסדר על ידי התיאום של vasodilation בין העורקים המוחיים רבים רשתות כלי דם¹. תאי אנדותל רירית מוחי התנגדות העורקים פקודה משתנה קוטר כלי הדם לפי הצורך לפגוש את הדרישה המטבולית של נוירונים¹^,²^,³. בפרט, במהלך hyperpolarization נגזר אנדותל (הידוע בכינויו EDH), Ca תאיים^{2 +}([Ca^{2 +}]_אני) ההספק ואת האותות חשמליים, תאי אנדותל vasodilation לתאם בין תאי אנדותל שלהם תאי שריר חלק שמסביב דרך צמתים הפער עבור הרפיה עורקים⁴. חניכה פיזיולוגיים של EDH כרוכה ברצף גירוי של G_q-בשילוב קולטנים (GPCRs), עלייה [Ca^{2 +}]_אני, והפעלה של אנדותל קטן - ו ביניים-קה^{2 +}-מופעל K⁺(SK_Caגבירותיי_Ca) ערוצים hyperpolarize מוחי ממברנה אנדותל פוטנציאליים (V_m)⁵^,⁶^,⁷. לכן, הקשר האינטימי של אנדותל [Ca^{2 +}]_אני ו- V_m הוא חלק בלתי נפרד ויסות זרימת דם והכרחי cardio -, פונקציה כשאבדן⁶^,⁸. בכל הספרות רחבה יותר, מחקרים רבים דיווחו על איגוד בתפקוד אנדותל כלי הדם עם התפתחותן של מחלות כרוניות (כגון: יתר לחץ דם, סוכרת, אי ספיקת לב, מחלת עורקים כללית, אי ספיקת כליות כרונית, מחלת עורקים היקפיים)⁹^,¹⁰, המציין את המשמעות של הלומדים פונקציה אנדותל בתנאים פיזיולוגיים, כמו גם פתולוגי.

אנדותל כלי הדם הינו חיוני להצלחת תהליך הייצור של hyperpolarization, vasodilation רקמות זלוף, לפיכך, בחינת תכונותיו הסלולר מקורית היא קריטית. כמודל כללי מחקר, הכנת דגם צינור אנדותל עורקי העכבר שפורסם לפני על שרירי השלד¹¹^,¹², הבטן¹³, ריאות¹⁴, ועל לאחרונה את המוח⁶. מחקרים של סימולטני [Ca^{2 +}]_אניומדידות V_m בפרט פורסמו שרירי השלד אנדותל עורקי¹⁵^,¹⁶ , כמו גם כלי הלימפה אנדותל¹⁷. בנוסף ראשי לימודי ניצול הגישה צינור אנדותל, סקירה מקיפה של יתרונות וחסרונות⁸ ניתן להתייעץ עם כדי לקבוע אם כלי ניסיוני זה מתאים למחקר ספציפי. בקצרה, יתרון זה רכיבי מפתח פיזיולוגיים של תפקוד תאי אנדותל נשמרות (למשל, Ca^{2 +} זרם ושחרור תאיים, hyperpolarization של V_m עד פוטנציאל נרנסט עבור K⁺ ויה SK_Caגבירותיי_Ca הפעלה, והצמתים אנדותל צימוד המערכת באמצעות הפער) ללא בלבול גורמים כגון קלט עצבי perivascular, הפונקציה ערוץ ממותגת מתח שריר חלק contractility, מחזור הדם ואת השפעות הורמונליות⁸. לעומת זאת, גישות התרבות התא נפוץ להציג שינויים משמעותיים מורפולוגיה¹⁸ ויון ערוץ ביטוי¹⁹ בצורה מאוד יכול המאפילים על השוואות אל תצפיות פיזיולוגיים נקבע ex-vivo או אין ויוו. מגבלות לכלול חוסר אינטגרציה עם רכיבים חיוניים אחרים כדי לווסת את זרימת הדם, כגון שריר חלק וגמישות מוגבלת, לוח זמנים ניסיוני של מודל זה נבדק בצורה אופטימלית תוך 4 שעות של בידוד קטע כלי הדם ללא פגע מהחיה.

בניין פרוטוקול וידאו קודמים שנכתבו על ידי Socha, סגל¹² התפתחויות ניסיוני ב ביניים⁶^,¹⁵^,¹⁶, נדגים בזאת את ניתוקה של אנדותל צח מ העורקים המוחיים האחורי ומדידות סימולטני של אנדותל [Ca^{2 +}]_אני ו V_m באמצעות Fura-2 photometry ואלקטרודות חד תאיים, בהתאמה. בנוסף, ניסוי זה כרוך superfusion רציפה של פתרונות מלח וסוכני תרופתי במהלך בתנאים פיזיולוגיים (pH 7.4, 37 ° C). בחרנו את עורק המוח האחורי, כפי שהיא נושאת אנדותל מבודד עם שלמות מבנית (תאים מצמידים דרך צמתים הפער), מספיק מידות (רוחב ≥50 מיקרומטר, אורך ≥300 מיקרומטר) לשכנוע אינטרה - והאיתות המערכת לאורך ובקרב תאי אנדותל. בנוסף, מחקרים של עורק המוח האחורי מכרסם מיוצגים באופן משמעותי בספרות ולהכיל בתוכו בחינת יסוד מנגנוני איתות אנדותל, פיתוח כלי דם/הזדקנות, פתולוגיה²⁰^, ²¹ ^, ²². יישום ניסיוני זה צפוי להניב ניתוח תפוקה גבוהה של מוחי אנדותל (ותפקוד לקוי), ובכך יאפשר התקדמות משמעותית ההבנה של תקנה זרימת דם בכל רחבי הזדקנות, התפתחות מחלות ניווניות.

Protocol

לפני ביצוע הניסויים הבאים, להבטיח כי כל טיפול בבעלי חיים להשתמש, פרוטוקולים אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים הוועדה להשתמש (IACUC) וביצע בהסכמה עם המועצה הלאומית למחקר של "מדריך טיפול ושימוש חיות מעבדה" (8^th מהדורה, 2011) ואת ההנחיות יגיעו. IACUC של לומה לינדה האוניברסיטה אישר כל הפרוטוקולים משמש כתב יד זה על עכברים C57BL/6 זכר ונקבה (טווח גילאים: 3-30 מו).

1. ציוד וחומרים

הערה: ניתן למצוא פרטים של החומרים הנדרשים עבור הפרוטוקול שולחן של חומרים, ריאגנטים, וגם מדריכים או המזוהים עם הספקים המתאימים.

זרימה קאמרית
1. הדקו תא superfusion עם חלק תחתון coverslip זכוכית לתוך פלטפורמת אלומיניום. אבטח את הפלטפורמה עם הקאמרית לתוך שלב אלומיניום קומפקטי.
2. הגדר micromanipulator בכל קצה של פלטפורמת על הבמה אלומיניום עבור מחזיק את פיפטה ההצמדה.
  הערה: כאפשרות מעשית, השתמש והתותח שלב ניתן להעברה עם זרימה קאמרית יחידה מאובטחת כדי להקל על המעבר בידוד של הצינור אנדותל הביצועים של הניסויים.
מיקרוסקופים
1. שימוש stereomicroscopes (5 x טווח הגדלה x 50) מצוידים עם סיבים אופטיים מקורות אור עבור שגרות מאקרו - ו ניתוח מיקרו.
2. עבור הכנה של צינורות אנדותל, השתמש במיקרוסקופ הפוכה מצויד שלב חדות או דיפרנציאלית הפרעות ניגודיות (DIC) תואם יעדים (10 x, 20 x ו- 40 x), שלב אלומיניום.
3. לבידוד צינורות אנדותל של כלי דם מעוכל חלקית, מקום של בקר משאבת microsyringe סמוכים זה המנגנון הכנה צינור אנדותל.
4. המנגנון ניסיוני, להשתמש במיקרוסקופ הפוכה מצויד עם מטרות רגיל (4 x ו- 10 x) בנוסף יעדים פלורסנט (20 x ו- 40 x, מפתח נומרי 0.75), שלב אלומיניום ידנית על שולחן בידוד רטט.
ציוד הקלטה תאיים
1. כדי להקליט את ה-V_m תאי אנדותל צינורות אנדותל מבודד, להתחבר אלקטרומטר את headstage תואם. במידת הצורך, חבר של מחולל אותות או ממריץ אלקטרומטר לניסויים הדורשים נוכחי הזרקת.
2. להתחבר התוצרים מגבר מערכת רכישת נתונים בסיסית נשמעים צגים, אוסצילוסקופ. לאבטח האלקטרודה הפניה (גלולה Ag/AgCl) ליד היציאה קאמרית זרימה במהלך הניסויים.
3. להשתמש במערכת בהשוואת עם רכיבים משולבים של קרינה פלואורסצנטית מערכת ממשק, גבוהה עוצמת מנורת קשת וכוח האספקה, hyperswitch, האופטיקה צינור (או PMT), ואת המצלמה למדוד [Ca^{2 +}]_אני בתאי האנדותל.
4. השתמש בקר טמפרטורה מצויד שמש בתוך השורה להעלות ולשמור על טמפרטורה פיזיולוגיים (37 מעלות צלזיוס) לאורך כל הניסוי.
5. השתמש פלטפורמה מאגר ששת המחוברים לבקר שסתום עם שסתום בקרת זרימה מוטבעת לשלוט המשלוח של פתרונות המתאימים הצינור אנדותל מאובטח בבית הבליעה.
Micropipettes ואלקטרודות חדה
הערה: כדי לייצר פיפטות trituration וייצוב מכני של צינורות אנדותל מבודד, לשימוש של פולר אלקטרונית מושך את מדי סוכר, מיקרו-פורג לשבירה ואש ליטוש.
1. להפריד המקטע עורקי מעוכל חלקית adventitia שריר חלק, הצינור אנדותל, להכין trituration מכשור ניסוי ברטט (כל אחד בקוטר טיפ פנימי של 80-120 מיקרומטר) לפי הצורך, באמצעות צינורות קפילר זכוכית בורוסיליקט, ואש ללטש את הטיפ.
2. כדי לאבטח את הצינור אנדותל בתחתית תא superfusion, להשתמש פיפטות ההצמדה עם קצה קהות, כדורית (חום-מלוטש, OD של 100 – 150 מיקרומטר; מקריסטלים של צינורות זכוכית בורוסיליקט דק-קיר).
3. כדי להקליט V_m של תא אנדותל, להכין אלקטרודות חדה עם התנגדות עצה של ~ 150 ± 30 MΩ של זכוכית צינורות קפילר באמצעות של פולר אלקטרונית.

2. אופן ההכנה של פתרונות וסמים

תמיסת מלח פיזיולוגית (PSS)
1. בניסוי אחד עם ההכנות סמים, להכין מינימום של 1 ליטר של PSS שימוש: 140 מ מ NaCl, 5 מ מ אשלגן כלורי, 2 מ מ CaCl₂, 1 מ MgCl גלוקוז₂, 10 מ מ N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic חומצה (HEPES) ו- 10 מ מ.
2. כדי להכין את הפתרונות הנדרשים עבור ניתוח, בידוד של עורק המוח, והכנה של צינור אנדותל, להכין PSS חסר CaCl₂(אפס Ca^{2 +}PSS).
3. להכין את כל פתרונות הנדסה גנטית יונים H₂O, להתאים את רמת ה-pH ל 7.4, לעקר אותם דרך מסנן (0.22 µm גודל הנקבוביות) ולהבטיח כי osmolality הפתרונות הוא בין mOsm 290 עד 300.
  הערה: פתרונות שניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך כשבועיים.
10% אלבומין שור (BSA)
1. כדי להכין 10% BSA, יתמוסס 1g של האבקה lyophilized גביע של 10 מ"ל אפס Ca^{2 +}PSS.
2. לכסות את. הספל עם סרט פרפין ולאפשר תקופה של כמה שעות יעברו, ללא ערבוב איטי עבור BSA להתמוסס.
3. לסנן את הפתרון הסופי באמצעות מזרק 10 מ ל בתוספת מסנן מיקרומטר 0.22 ולעשות 1 מ"ל aliquots להיות מאוחסנים ב-20 ° C.
פתרון לנתיחה
1. כדי להכין 50 מ של פתרון לנתיחה, להוסיף 500 µL של BSA (10%) 49.5 מ של אפס Ca^{2 +}PSS.
2. מיד לאחר ההכנה, להעביר פתרון זה דיסקציה לתוך צלחת פטרי עבור ניתוח עורקי.
פתרון דיסוציאציה
1. כדי להכין 50 מיליליטר דיסוציאציה פתרון, להוסיף 5 µL של CaCl₂ (1 מ'), µL 500 של BSA (10%) 49.5 מ של אפס Ca^{2 +}PSS. לאפשר את הפתרון לשבת בטמפרטורת החדר (RT).
אנזימים
1. לעיכול חלקי עורקי המקטעים, להכין 1 מ"ל של פתרון מערכת העיכול עם פפאין 0.31 מ"ג/מ"ל, dithioerythritol 0.5 מ"ג/מ"ל, collagenase 0.75 mg/mL (H סוג מיזוג) elastase 0.13 מ"ג/מ"ל.
  הערה: פעילות האנזים עשויה להשתנות; עם זאת, עבור פרוטוקולים מוצלח שלנו, פעילות האנזים מסחרית שסופקו שימשו כדלקמן: פפאין ≥ 10 יחידות/מ ג; collagenase ≥1 יחידות/mg, עבור מחזור המצע N-[3-(2-Furyl)acryloyl]-Leu-Gly-Pro-Ala או FALGPA; ו elastase ≥ 5 יחידות/mg.
הכנת Fura-2 וסוכני תרופתי
1. להכין מלאי ריכוז (1 מ מ) של Fura-2 AM לצבע דימתיל סולפוקסיד. הכנת ריכוז העבודה (10 מיקרומטר) על-ידי הוספת µL 5 מניות µL 495 של PSS לטעינה.
2. להכין ≥50 מ ל עובד ריכוזים של סוכנים תרופתי (למשל, ATP) ב PSS לפי הצורך.
ניצוח פתרון
1. להכין ניצוח על פתרון, 2 מ' אשלגן כלורי, על ידי המסת אשלגן כלורי יונים H₂O (7.455 גרם אשלגן כלורי 50 מ ל H₂O).
2. לסנן הפתרון דרך מסנן מזרק מיקרומטר 0.22 לפני למלא את משבצות האלקטרודות חדה.
Propidium יודיד (0.1%)
1. להמיס 10 מ ג של יודיד lyophilized propidium ב- 10 מ"ל של 2 מ' אשלגן כלורי.
2. מערבבים היטב ולאחסן ב RT.

3. ניתוח ובידוד של חסימת עורק צרברלי אמצעי

הערה: כל ההליכים לנתיחה דורשים הדגימה הגדלה (עד 50 x) דרך stereomicroscopes ותאורה הניתנים על ידי סיבים אופטיים מקורות אור. כדי לבצע הליכים לנתיחה בידוד של המוח ושל העורקים, להשתמש בכלים לנתיחה מחודדים. Microdissection כלים לבודד ולנקות את העורקים כוללים מחודדים שקצהו הקנס מלקחיים ומספריים Vannas סגנון לנתיחה (להבים 3 ל 9.5 מ מ).

בידוד של מוח העכבר
1. עזים ומתנגד העכבר (3-30 חודשים ישן; זכר או נקבה) של C57BL/6 דרך שאיפה של איזופלוריין (3% למשך 2-3 דקות) ולאחר מכן לערוף את החיה מיד לאחר אינדוקציה מלאה של הרדמה. שים את ראשך בצלחת פטרי (בקוטר 10 ס מ, עומק 1.5 ס מ) המכיל קר (4 ° C) אפס Ca^{2 +}PSS תחת stereomicroscope.
2. הצגת מבעד למיקרוסקופ, להסיר את העור והשיער על הגולגולת ולהסיר מוגזמת בדם קר אפס Ca^{2 +} PSS. לעשות חתך באמצעות רק הקצוות של ניתוח סטנדרטי מספריים (למשל, 24 מ מ להבים), החל עצם העורף ולהרחיב את דרך העצם באף של הגולגולת.
3. לפתוח את הגולגולת בקפידה לאורך החתך באמצעות מלקחיים גס שקצהו, רקמת חיבור נפרד כדי לבודד את המוח עם מעגל שלם של וויליס.
  הערה: לחלופין, ניתן להשתמש מלקחיים חיתוך עצם Littauer כדי לפתוח את הגולגולת וחושפים את המוח.
4. לשטוף בעדינות המוח מבודדים עם הקור אפס Ca^{2 +}PSS בתוך ולהסיר את הדם. מניחים בצד הגחוני במוח פונה למעלה בחדר המכיל ניתוח קר פתרון עבור בידוד של העורקים המוחיים (איור 1 א').
בידוד של העורקים המוחיים
הערה: עורק המוח האחורי נבחרה כמודל נציג מחקר אנדותל כשאבדן עבור פרוטוקול זה.
1. לאבטח את המוח מבודדים בתמיסה לנתיחה קר באמצעות פינים מנירוסטה (קוטר 0.2 מ מ, אורך ~ 11 – 12 מ מ) שיוכנס לתוך פולימר סיליקון חלוטים פחם ציפוי התחתון (עומק ≥50 ס מ) של כוס, צלחת פטרי.
2. כדי לשמור מקורר לטמפרטורה של PSS במהלך ניתוח, השתמש תא לנתיחה מקורר על ידי מערכת צינון ללא הרף על אופניים תערובת 1:1 מים אתילן גליקול. לחלופין, ניתן לבצע חיתוך קרח טרי.
3. בניתוח לבודד את העורקים המוחיים האחורי (~0.3 עד 0.5 ס מ מקטעים, אין מתח צירית) תקשורת האחורי ואת למפרצת העורקים באמצעות microdissection מכשירים Vannas סגנון מספריים ומלקחיים מחודדים שקצהו פיין (איור 1B ). השתמש פינים מנירוסטה (בקוטר 0.1 מ"מ, אורך ~ 13 – 14 מ מ) כדי מאובטח שניהם מבודדים האחורי העורקים המוחיים בפתרון לנתיחה בצלוחית הפטרי (איור 1C).
4. לנקות את העורקים המוחיים האחורי מבודד היטב על-ידי הסרת רקמת חיבור באמצעות מלקחיים שקצהו הקנס מחודדים (איור 1D). לחתוך את העורקים שלם לחלקים (אורך 1-2 מ מ) לעיכול אנזימטי (איור 1D; שיבוץ).

4. הכנת צינור אנדותל, Superfusion

הערה: הצינור אנדותל מוכן כפי שתואר לעיל¹², עם השינויים עבור עורק המוח⁶.

הכינו את המנגנון trituration באמצעות מיקרוסקופ מצוידים עם מטרות (10 x, 20 x ו- 40 x), מצלמה, שלב אלומיניום מחזיקים תא micromanipulators. מאובטחת microsyringe עם בקר המשאבה סמוך לשלב הדגימה (איור 2 א).
לחלוטין מילוי trituration פיפטה עם שמן מינרלי ואבטח אותו מעל הבוכנה מיקרו-מזרק. לאחר מכן, באמצעות המזרק המיקרו עם משאבת בקר, להתכנס דיסוציאציה פתרון בתוך פיפטה (~ 130 nl) מעל שמן מינרלי תוך הקפדה על העדר של בועות אוויר פיפטה.
מקם מקטעי עורקי שלם לתוך 1 מיליליטר דיסוציאציה פתרון שפופרת זכוכית 10 מ ל (איור 2B), המכיל פפאין 0.31 מ"ג/מ"ל, dithioerythritol 0.5 מ"ג/מ"ל, collagenase 0.75 mg/mL, elastase 0.13 מ"ג/מ"ל. דגירה ב 34 מעלות צלזיוס למשך 10 – 12 דקות לעיכול חלקי.
בעקבות העיכול, החלף את הפתרון האנזים ~ 5 מיליליטר דיסוציאציה טריים פתרון. באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, להעביר קטע אחד לתא המכיל את הפתרון דיסוציאציה-RT.
למקם את פיפטה הפתרון דיסוציאציה בבית הבליעה ומקם אותה ליד קצה אחד של כלי השיט מעוכל. לקבוע שיעור בטווח של 2-5 nL/s הבקר משאבת עבור trituration עדין (איור 2C; שיבוץ).
תוך כדי צפייה דרך x 100 200 x הגדלה, לסגת והוצא על קטע עורקי מביצועם תאי שריר חלק תוך ייצור של צינור אנדותל. במידת הצורך, השתמש בזהירות מלקחיים שקצהו בסדר כדי להפריד adventitia הפומבית ו פרופריה אלסטית פנימית מהצינור אנדותל. לאשר כי הם חלופה מועדפת של כל תאי שריר חלק, כי תאי אנדותל רק להישאר שלם "צינור" (איור 2C).
באמצעות micromanipulators, אבטח בכל קצה הצינורית אנדותל על תגית כיסוי זכוכית לשכת superfusion באמצעות זכוכית בורוסיליקט הצמדה מכשור ניסוי ברטט (איור דו-ממדי).
שטיפת-אאוט הפומבית adventitia ותאי שריר חלק קאמרית, החלף הפתרון דיסוציאציה עם 2 מ מ CaCl₂ PSS. להעביר את פלטפורמת הניידים עם צינור אנדותל מאובטחת אל המיקרוסקופ של האסדה superfusion וניסויים.
השתמש נקי 50 מ ל 6 מאגרים (איור 3 א) למסירה רציפה של PSS ופתרונות בהתאמה סמים במהלך הניסוי, לפי הצורך. השתמש את השסתום בקרת זרימה בתוך השורה להגדיר ידנית את קצב הזרימה ברחבי כמו עקבי עם זרימה שכבתית תוך התאמת זרימת להאכיל שאיבה ואקום. לספק PSS לתא (איור 3B) בשביל superfusion של הצינור אנדותל עבור ≥ 5 דקות לפני הקלטת נתוני רקע וצבע טעינה.

5. צבע עומס, שטיפת-אאוט והגדרות טמפרטורה

הפעל את כל הרכיבים של מערכת photometry למדידת [Ca^{2 +}]_אני. השתמש המיקרוסקופ על האסדה ניסיוני (איור 3C) כדי להציג את הצינור אנדותל-400 x הגדלה, ולהתרכז על תאים בחלון בהשוואת באמצעות חבילת התוכנות של מערכת photometry.
למדוד את הקוטר של הצינור אנדותל והקלטה של ערכי autofluorescence הרקע בהסכמה עם פליטה 510 ננומטר במהלך עירור חלופי-340 ו 380 nm (≥ 10 Hz).
כדי למדוד [Ca^{2 +}]_אני תגובות, טען הצינור אנדותל עם Fura-2 אני צובע (10 מיקרומטר ריכוז סופי) ב RT ולאפשר ~ 30-40 דקות בהיעדרו של אור.
מחדש superfusion של הצינור אנדותל עם PSS טריים ~ 30 – 40 דקות לשטוף-out עודף צבע ולאפשר תאיים Fura-2, אני מבטל את esterify. במהלך תקופת שטיפת-אאוט, להעלות את הטמפרטורה בהדרגה מ- RT עד 37 ° C באמצעות בקר טמפרטורה (איור 3A) עם חימום בתוך השורה ולאחר מכן לשמור ב 37 מעלות צלזיוס לאורך כל הניסוי.
הערה: המעבר מצטבר המומלץ בין RT עד 37 ° C כרוכה בשלושה שלבים (למשל, 5 ° C) עם זמן equilibration ≥5 דקות בכל שלב.

6. סימולטני מדידה של [Ca^{2 +}]_אני ו- V_m

הפעל כל ציוד אחר ואת חבילת התוכנות אלקטרומטר למדידת V_m(ראו איור 3, איור 4). להתאים את קצב רכישת נתונים בהתאם (≥ 10 Hz).
משוך אלקטרודה חדה עם מילוי עם 2 מ' אשלגן כלורי. ללימודים של המערכת צימוד באמצעות העברה צבע, מילוי של microelectrodes עם יודיד propidium 0.1% מומס 2 מ' אשלגן כלורי.
לאבטח את האלקטרודות על חוט כסף מצופה כלורי המחזיק פיפטה צמוד לשלב ראש אלקטרומטר מאובטח עם micromanipulator. השתמש את micromanipulator למיקום בקצרה את קצה האלקטרודה לתוך PSS זורמים בבית הבליעה תוך כדי צפייה דרך המטרה 4 x.
הגדר את מנוחתו V_m 0 בקנה אחד עם אמבטיה מוארק פוטנציאליים. מקמו את קצה האלקטרודה רק תא של הצינור אנדותל. במידת הצורך, השתמש צגים בסיסית נשמעים קשורה electrometers לשייך גובה צליל הקלטות פוטנציאליים.
הגברת ההגדלה 400 x באמצעות המטרה 40 x, ולמקם מחדש את קצה האלקטרודה כנדרש. התאם לחלון בהשוואת באמצעות התוכנה photometry להתמקד על תאי אנדותל ~ 50 עד 80.
בעדינות מניחים אחד התאים של הצינור אנדותל באמצעות micromanipulator את האלקטרודה ולא לחכות מינימום ≥2 מנוחתו V_m לייצב. באופן דומה, הכנס את האלקטרודה השנייה של תא אחר (מרחק ≥100 מיקרומטר) מהתא הראשון עם אלקטרודה הראשון.
לאחר מנוחה V_m יציב על ערכיה צפוי (-30 ל-40 mV)⁶, להפעיל את PMT בממשק פלורסצנטיות, בהעדר אור ולהתחיל רכישת תאיים [Ca^{2 +}]_אנימאת מרגש Fura-2 לסירוגין (10 Hz)- 340 ו 380 nm תוך איסוף פליטת קרינה פלואורסצנטית-510 ננומטר.
הערה: כדי לבדוק את המערכת צימוד חשמלי, הנוכחי (± 0.5-3 נה, משך פעימה s ~ 20) יכולה להיות מועברת דרך אחד אלקטרומטר כאתר"1", ניתן לרשום שינויים של V_m אלקטרומטר אחר כמו "באתר 2" (מרחק ≥100 מיקרומטר).
מרגע בו זמנית מדידות של V_m ו [Ca^{2 +}]_אנימבוססים, תאפשר ~ 5 דקות עבור superfusion צינור אנדותל עם PSS בקצב קבוע זרימה שכבתית לפני היישום של סמים.
להחיל את התרופה (למשל, ATP) המבושלות PSS לתא superfusion עם קצב הזרימה מתמדת. לאחר ~ 3 דקות (או פרק זמן מתאים קינטיקה של התרופה), לשטוף עם PSS עד V_m והיחס₃₈₀ F /F₃₄₀להחזיר את תנאי התוכנית הבסיסית שלהם. סמן הקלטות בהתאמה כמו חנותם מסונכרן על פני הסוויטות תוכנה photometer ו אלקטרומטר במהלך כל המעבר של פתרונות.
ברגע נעשה את הניסוי, לסגת אלקטרודה מהתא באמצעות micromanipulator את ושים לב V_m ~ 0 mV כמו המופנה על ידי האלקטרודה אמבט. לעצור הקלטות בהתאמה של V_m ו [Ca^{2 +}]_אני ולהציל את הרשומות בקובץ לניתוח נתונים.

7. ויזואליזציה של צימוד לתא

כדי להמחיש צימוד לתא דרך propidium יודיד, להשתמש סימן x 40 או 60 x המטרה פלורסנט עם צוהר מספרי גבוה יחסית (למשל, 0.95) rhodamine מסנן מוגדר עם תאורה של מצב מוצק, מצלמה ברזולוציה גבוהה (למשל, 16- מגה פיקסל), ואת חבילת תוכנות הדמיה.

תוצאות

ההפגנה סכמטי של הפרוטוקול המתואר לעיל מוצג הדמויות המצורפת. מוח מבודד צעירים למבוגרים זכר C57BL/6N עכבר (5 חודשים) מוצג איור 1A. העורקים המוחיים האחורי מבודדים היטב מן מעגל ויליס, להסיר אותן ללא רקמת חיבור, ולחתוך לחלקים (איור 1B-D). מ מקט?...

Discussion

לאור האחרונות התפתחויות⁶^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷, נדגים כעת את השיטה כדי לבודד את העכבר אנדותל עורקי מוחין לקראת מדידה סימולטני של [Ca^{2 +}] _אני ו- V_m שבבסיס EDH בעקביות על ~ 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס. למרות שטכנית קשה, אנו יכולים למדוד-?...

Disclosures

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgements

אנו מודים צ'ארלס יואיט לסיוע טכני מעולה בזמן הקמת ציוד ואספקה הדרושים עבור הפרוטוקולים הנוכחי. אנו מודים ד"ר שון וילסון ו כריסטופר וילסון, מהמרכז LLU על ביולוגיה הלידה, על מתן אותנו עם מיקרוסקופ הפוכה נוספים ו אלקטרומטר, בהתאמה. מחקר זה היא נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים גרנט R00-AG047198 (EJB), לומה לינדה הספר לרפואה של אוניברסיטת סגל חדש ראשונית. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של מכוני הבריאות הלאומיים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glucose	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	G7021
NaCl	Sigma	S7653
MgCl2	Sigma	M2670
CaCl2	Sigma	223506
HEPES	Sigma	H4034
KCl	Sigma	P9541
NaOH	Sigma	S8045
ATP	Sigma	A2383
HCl	ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)	A466250
Collagenase (Type H Blend)	Sigma	C8051
Dithioerythritol	Sigma	D8255
Papain	Sigma	P4762
Elastase	Sigma	E7885
BSA	Sigma	A7906
Propidium iodide	Sigma	P4170
DMSO	Sigma	D8418
Fura-2 AM dye	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	F14185
Recirculating chiller (Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Scientific	13874647
Plexiglas superfusion chamber	Warner Instruments, Camden, CT, USA	RC-27
Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm)	ThermoFisher Scientific	12-548-5M
Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm)	Warner Instruments	PM6 or PH6
Compact aluminum stage	Siskiyou, Grants Pass, OR, USA	8090P
Micromanipulator	Siskiyou	MX10
Stereomicroscopes	Zeiss, NY, USA	Stemi 2000 & 2000-C
Fiber optic light sources	Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss	Fostec 8375
Nikon inverted microscope	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA	Ts2
Phase contrast objectives	Nikon Instruments Inc	(Ph1 DL; 10X & 20X)
Fluorescent objectives	Nikon Instruments Inc	20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor)
Nikon inverted microscope	Nikon Instruments Inc	Eclipse TS100
Microsyringe pump controller (Micro4 )	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	SYS-MICRO4
Vibration isolation table	Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA	Micro-g
Amplifiers	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Headstages	Molecular Devices	HS-2A & HS-9A
Function generator	EZ Digital, Seoul, South Korea	FG-8002
Data Acquision System	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Digidata 1550A
Audible Baseline Monitors	Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA	BM-A-TM
Digital Storage Oscilloscope	Tektronix, Beaverton, Oregon, USA	TDS 2024B
Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	IonOptix Systems
Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344B or C
Inline Heater	Warner Instruments	SH- 27B
Valve Controller	Warner Instruments	VC-6
Inline Flow Control Valve	Warner Instruments	FR-50
Electronic Puller	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97 or P-1000
Microforge	Narishige, East Meadow, NY, USA	MF-900
Borosilicate Glass Tubes (Trituration)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	1B100-4
Borosilicate Glass Tubes (Pinning)	Warner Instruments	G150T-6
Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes)	Warner Instruments	GC100F-10
Syringe Filter (0.22 µm)	ThermoFisher Scientific	722-2520
Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard	Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA	DD-90-S-BLK
Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm)	World Precision Instruments	555640S, 14364
Scissors 3 & 7 mm blades	Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA	Moria MC52 & 15000-00
Sharpened fine-tipped forceps	FST	Dumont #5 & Dumont #55

References

Longden, T. A., Hill-Eubanks, D. C., Nelson, M. T. Ion channel networks in the control of cerebral blood flow. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (3), 492-512 (2016).
Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. A critical role for the vascular endothelium in functional neurovascular coupling in the brain. Journal of the American Heart Association. 3 (3), e000787 (2014).
Iadecola, C., Yang, G., Ebner, T. J., Chen, G. Local and propagated vascular responses evoked by focal synaptic activity in cerebellar cortex. Journal of Neurophysiology. 78 (2), 651-659 (1997).
Bagher, P., Segal, S. S. Regulation of blood flow in the microcirculation: role of conducted vasodilation. Acta Physiologica (Oxford, England). 202 (3), 271-284 (2011).
Garland, C. J., Dora, K. A. EDH: endothelium-dependent hyperpolarization and microvascular signalling. Acta Physiologica (Oxford, England). 219 (1), 152-161 (2017).
Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels. Pharmacology Research & Perspectives. 6 (2), e00391 (2018).
Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), H1590-H1599 (2003).
Behringer, E. J. Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function. Microcirculation. 24 (3), (2017).
Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. Endothelial dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology. 15 (8), 1983-1992 (2004).
Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).
Socha, M. J., Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. Temperature effects on morphological integrity and Ca2+ signaling in freshly isolated murine feed artery endothelial cell tubes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (3), H773-H783 (2011).
Socha, M. J., Segal, S. S. Isolation of microvascular endothelial tubes from mouse resistance arteries. Journal of Visualized Experiments. (81), (2013).
Ye, X., Beckett, T., Bagher, P., Garland, C. J., Dora, K. A. VEGF-A inhibits agonist-mediated Ca2+ responses and activation of IKCa channels in mouse resistance artery endothelial cells. The Journal of Physiology. , (2018).
Norton, C. E., Segal, S. S. Calcitonin gene-related peptide hyperpolarizes mouse pulmonary artery endothelial tubes through KATP channel activation. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular. , (2018).
Behringer, E. J., Segal, S. S. Membrane potential governs calcium influx into microvascular endothelium: integral role for muscarinic receptor activation. The Journal of Physiology. 593 (20), 4531-4548 (2015).
Behringer, E. J., Segal, S. S. Impact of Aging on Calcium Signaling and Membrane Potential in Endothelium of Resistance Arteries: A Role for Mitochondria. The Journal of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72 (12), 1627-1637 (2017).
Behringer, E. J., et al. Calcium and electrical dynamics in lymphatic endothelium. The Journal of Physiology. 595 (24), 7347-7368 (2017).
Simmers, M. B., Pryor, A. W., Blackman, B. R. Arterial shear stress regulates endothelial cell-directed migration, polarity, and morphology in confluent monolayers. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiolog. 293 (3), H1937-H1946 (2007).
Sandow, S. L., Grayson, T. H. Limits of isolation and culture: intact vascular endothelium and BKCa. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297 (1), H1-H7 (2009).
Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), H365-H375 (2016).
Kochukov, M. Y., Balasubramanian, A., Abramowitz, J., Birnbaumer, L., Marrelli, S. P. Activation of endothelial transient receptor potential C3 channel is required for small conductance calcium-activated potassium channel activation and sustained endothelial hyperpolarization and vasodilation of cerebral artery. Journal of the American Heart Association. 3 (4), (2014).
Zhang, L., Papadopoulos, P., Hamel, E. Endothelial TRPV4 channels mediate dilation of cerebral arteries: impairment and recovery in cerebrovascular pathologies related to Alzheimer's disease. British Journal of Pharmacology. 170 (3), 661-670 (2013).
Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries. Microcirculation. 19 (8), 757-770 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143 microcirculation hyperpolarization G Ca2 K Fura 2 photometry microelectrodes

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated:

Method Article