Medidas simultáneas de calcio intracelular y el potencial de membrana en el endotelio Cerebral de ratón recién aislado e intacto

Resumen

Demostrado aquí son protocolos para el aislamiento (1) recién endoteliales cerebrales intactos "tubos" y mediciones (2) simultáneas de calcio endotelial y la membrana potencial durante la hiperpolarización derivados del endotelio. Además, estos métodos permiten ajuste farmacológico de calcio de la célula endotelial y señalización eléctrica como variables experimentales individuales o interactivas.

Resumen

Arterias cerebrales y su respectiva microcirculación entregan oxígeno y nutrientes a la regulación del flujo cerebral por medio de sangre. Las células endoteliales de la línea el lumen de los vasos sanguíneos y cambios de mando en el diámetro vascular según sea necesario para satisfacer la demanda metabólica de las neuronas. Principales vías de señalización de endotelial dependientes de hiperpolarización del potencial de membrana (V_m) y el óxido nítrico normalmente funcionan en paralelo para mediar vasodilatación y consiguiente aumento de flujo sanguíneo. Aunque parte integrante de la coordinación de vasodilatación sobre varios milímetros de longitud vascular, componentes de hiperpolarización derivado de endotelio (EDH) han sido históricamente difíciles de medir. Estos componentes de EDH implica intracelular Ca^{2 +} [Ca^{2 +}] aumenta y la posterior activación de pequeñas e intermedias conductancia de Ca^{2 +}-activado K⁺ (SK_Ca/IK_Ca) canales.

Aquí, presentamos una ilustración simplificada del aislamiento de fresco endotelio de arterias cerebrales de ratón; medidas simultáneas de endotelial [Ca^{2 +}] y V_m con Fura-2 fotometría y electrodos agudos intracelulares, respectivamente; y una superfusion continua de soluciones de sal y agentes farmacológicos bajo condiciones fisiológicas (pH 7,4, 37 º C). Arterias cerebrales posteriores desde el círculo de Willis se quitan de la comunicación posterior y las arterias basilares. Digestión enzimática de segmentos arteriales cerebrales posteriores limpiados y posterior trituración facilita la eliminación de la adventicia, los nervios perivasculares y las células musculares lisas. Resultantes posteriores cerebrales arteriales endoteliales "tubos" entonces están asegurados bajo un microscopio y examinaron usando una cámara, tubo fotomultiplicador, y uno o dos electrómetros bajo superfusion continua. Colectivamente, este método puede medir simultáneamente cambios endoteliales [Ca^{2 +}] y V_m en localizaciones celulares discretos, además de separarse de la EDH a través de uniones comunicantes hasta distancias de milímetros a lo largo de la intacta endotelio. Este método se espera que un análisis de alto rendimiento de las funciones endoteliales cerebrales subyacen mecanismos de regulación de flujo de sangre en el cerebro normal y enferma.

Introducción

Flujo de sangre a través del cerebro está regulado por la coordinación de la vasodilatación cerebrales arterias y arteriolas en redes vasculares¹. Células endoteliales que recubren cambios de comando resistencia cerebral arterias de diámetro vascular cuando sea necesario para satisfacer la demanda metabólica de las neuronas^1,2,3. En particular, durante la hiperpolarización derivado de endotelio (conocido comúnmente como EDH), intracelular Ca^{2 +} ([Ca^{2 +}]) y señalización eléctrica en células endoteliales vasodilatación coordinar entre las células endoteliales y su alrededor de las células musculares lisas a través de uniones comunicantes para relajación arterial⁴. Iniciación fisiológica de EDH secuencialmente implica estimulación de G_q-junto a los receptores (GPCRs), un aumento de [Ca^{2 +}]y la activación endotelial de pequeño y medio Ca^{2 +}-activado K⁺ (SK_Ca/IK_Ca) canales para hyperpolarize la membrana endotelial cerebral potencial (V_m)^5,6,7. Así, la íntima relación de endotelial [Ca^{2 +}] y V_m es parte integral de regulación del flujo sanguíneo e indispensable para cardio - y cerebrovasculares función^6,8. A lo largo de la literatura general, numerosos estudios han reportado la Asociación de la disfunción endotelial vascular con el desarrollo de enfermedades crónicas (p. ej., hipertensión, diabetes, insuficiencia cardíaca, enfermedad coronaria, insuficiencia renal crónica, enfermedad arterial periférica)^9,10, indicando la importancia de estudiar la función endotelial en condiciones fisiológicas como patológicas.

Endotelio vascular es esencial para la producción de hiperpolarización, vasodilatación y perfusión del tejido y por lo tanto, la examinación de sus propiedades nativas de celulares es crucial. Como modelo de estudio general, preparación del modelo de tubo endotelial arterial de ratón ha sido publicado antes por músculo esquelético^11,12,¹³de intestino, pulmón¹⁴y recientemente por el cerebro⁶. Estudios de simultánea [Ca^{2 +}] y V_m medidas en particular se han publicado para músculo esquelético endotelio arterial^15,16 , así como del endotelio de vasos linfáticos¹⁷. Además de los estudios primarios utilizando el enfoque de tubo endotelial, una revisión exhaustiva de sus ventajas y desventajas⁸ puede consultarse para determinar si esta herramienta experimental es apropiada para un estudio específico. En Resumen, una ventaja es que se conservan los componentes fisiológicos clave de la función endotelial de la célula (e.g., Ca^{2 +} afluencia y liberación intracelular, hiperpolarización de V_m hasta el potencial de Nernst para K⁺ a través de /IK de SK_CaCa activación y acoplamiento intercelular endotelial a través de uniones comunicantes) sin confundir factores tales como la entrada de nervios perivasculares, músculo liso canal voltaje-bloqueado función y contractilidad, circulación de la sangre y las influencias hormonales⁸. Por el contrario, enfoques de cultura celular utilizado introducen alteraciones significativas en la morfología¹⁸ y ion canal expresión¹⁹ de manera que puede ofuscar mucho las comparaciones con observaciones fisiológicas determinadas ex vivo o en vivo. Limitaciones incluyen la falta de integración con otros componentes esenciales para la regulación del flujo sanguíneo, como el músculo liso y flexibilidad restringida en un programa experimental, como este modelo es probado óptimamente dentro de 4 h de aislamiento de segmento vascular intacto del animal.

Construcción de un protocolo anterior vídeo por Socha y Segal¹² y las últimas novedades experimentales en el provisional^6,15,16, por este medio demostrar el aislamiento del endotelio fresco de las arterias cerebrales posteriores y mediciones simultáneas de endotelial [Ca^{2 +}] y V_m con Fura-2 fotometría y electrodos agudos intracelulares, respectivamente. Además, este experimento implica superfusion continua de soluciones de sal y agentes farmacológicos durante condiciones fisiológicas (pH 7,4, 37 º C). Elegimos la arteria cerebral posterior, como rendimiento aislado endotelio con la integridad estructural (células juntadas a través de uniones comunicantes) y dimensiones suficientes (≥50 μm de ancho, longitud ≥300 μm) favorables para intra - e intercelular señalización a lo largo y entre células endoteliales. Además, estudios de la arteria cerebral posterior roedor substancialmente están representados en la literatura y abarcan análisis de fundamentales mecanismos de señalización endoteliales, vascular desarrollo/envejecimiento y patología^{20, 21 , 22}. esta aplicación experimental se espera que un análisis de alto rendimiento de la función endotelial cerebral (y disfunción) y así permitirá avances significativos en la comprensión de la regulación del flujo de sangre a lo largo de envejecimiento y el desarrollo de enfermedades neurodegenerativas.

Protocolo

Antes de realizar los siguientes experimentos, asegurar que todo el cuidado animal y protocolos aprobados por la atención institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) y realizados de acuerdo con del Consejo Nacional de investigación ''guía para el cuidado y uso de Animales de laboratorio" (8^th edición, 2011) y las directrices para llegar. La IACUC la Universidad de Loma Linda ha aprobado todos los protocolos utilizados para este manuscrito para ratones C57BL/6 machos y hembras (rango de edad: 3 a 30 meses).

1. equipos y materiales

Nota: Detalles de materiales necesarios para el protocolo pueden encontrarse en la Tabla de materiales, reactivosy manuales o sitios web asociado a los proveedores respectivos.

1. Cámara de flujo
   1. Fije una cámara superfusion con fondo de vidrio cubreobjetos en una plataforma de aluminio anodizado. Asegure la plataforma con la cámara en un escenario de aluminio compacto.
   2. Establecer un micromanipulador en cada extremo de la plataforma en la etapa de aluminio para sujetar la pipeta de fijación.
      Nota: Como una opción práctica, utilice este aparato etapa transferibles con una unidad de la cámara de flujo para facilitar la transición del aislamiento del tubo endotelial al rendimiento de los experimentos.
2. Microscopios
   1. Estereomicroscopio de uso (5 x rango de aumentos x 50) equipados con fuentes de luz óptica de fibra para los procedimientos de disección macro y micro.
   2. Para la preparación de tubos endoteliales, usar un microscopio invertido, dotado de fase contraste o diferencial de interferencia (DIC) de contraste compatible con objetivos (10 x, 20 x y 40 x) y una etapa de aluminio.
   3. Para aislar los tubos endoteliales de los vasos sanguíneos parcialmente digeridos, coloque un controlador de bomba de microjeringa adyacentes al aparato de preparación tubo endotelial.
   4. Para el aparato experimental, usar un microscopio invertido, dotado de objetivos estándar (4 x y 10 x) además de objetivos fluorescentes (20 x y 40 x, apertura numérica 0.75) y una etapa de aluminio manual en una tabla de aislamiento de vibración.
3. Equipo de grabación intracelular
   1. Para grabar el V_m de las células endoteliales en tubos endoteliales aislados, conecte el electrómetro headstage compatible. Si es necesario, conecte un generador de funciones o estimulador el electrómetro para experimentos que requieren inyección de corriente.
   2. Conecte las salidas del amplificador a un sistema de adquisición de datos, monitores de referencia audible y un osciloscopio. Fije el electrodo de referencia (Ag/AgCl pellet) cerca de la salida de la cámara de flujo durante los experimentos.
   3. Utilizar un sistema fotométrico con componentes integrados de fluorescencia sistema interfaz, alta intensidad lámpara de arco y poder suministro, hyperswitch, tubo fotomultiplicador (o PMT) y la cámara para medir la [Ca^{2 +}] en las células endoteliales.
   4. Utilice un controlador de temperatura con un calentador en línea para elevar y mantener una temperatura fisiológica (37 º C) durante todo el experimento.
   5. Utilizar una plataforma de seis depósito conectada a un controlador de la válvula con una válvula de control de flujo en línea para el control de la entrega de las respectivas soluciones al tubo endotelial asegurada en la cámara.
4. Micropipetas y electrodos afilados
   Nota: Para la fabricación de pipetas para la trituración y la estabilización mecánica de tubos endoteliales aisladas, utilizar un extractor electrónico para tirar de las pipetas y micro-Fragua de última hora y fuego pulido.
   1. Para separar la adventicia, músculo liso y el tubo endotelial del segmento arterial parcialmente digerido, preparar trituración pipetas (cada uno con un diámetro interno de la punta de 80-120 μm) según corresponda, utilizando tubos capilares de vidrio de borosilicato y fuego pulir la punta.
   2. Para asegurar el tubo endotelial contra la parte inferior de la cámara superfusion, utilizar pipetas de fijación con un extremo embotado, esférico (calor-pulido, OD de 100 – 150 μm; preparado a partir de tubos de vidrio de borosilicato de pared delgada).
   3. Para grabar V_m de una célula endotelial, preparar electrodos afilados con una resistencia de punta de ~ 150 ± 30 MΩ de tubos capilares de vidrio utilizando un extractor electrónico.

2. preparación de soluciones y medicamentos

1. Solución salina fisiológica (PSS)
   1. Para un experimento con preparaciones de la droga, prepare un mínimo de 1 L de utilizar PSS: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, ácido N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic (HEPES) de 10 mM y 10 mM de glucosa.
   2. Para preparar las soluciones necesarias para la disección, aislamiento de la arteria cerebral y la preparación del tubo endotelial, preparar PSS falta CaCl₂ (cero Ca^{2 +} PSS).
   3. Preparar todas las soluciones en ultrapura desionizada H₂O, ajustar el pH a 7.4, esterilizar a través de un filtro (tamaño de poro de 0,22 μm) y asegurarse de que la osmolalidad de las soluciones es entre 290 y 300 mOsm.
      Nota: Soluciones pueden almacenarse a 4 ° C durante aproximadamente dos semanas.
2. 10% de albúmina sérica bovina (BSA)
   1. Para preparar 10% BSA, disolver 1 g de polvo liofilizado en un vaso de precipitados de 10 mL cero Ca^{2 +} PSS.
   2. Cubrir el vaso con la película de parafina y permitir un período de varias horas de pasar, con agitación lenta de la BSA disolver.
   3. Filtrar la solución final usando una jeringa de 10 mL más un filtro de 0,22 μm y hacer alícuotas de 1 mL para ser almacenado a-20 ° C.
3. Solución de disección
   1. Para preparar 50 mL de solución de disección, Añadir 500 μl de BSA (10%) a 49,5 mL de cero Ca^{2 +} PSS.
   2. Inmediatamente después de la preparación, la transferencia esta solución de disección en una placa de Petri para la disección arterial.
4. Solución de disociación
   1. Para preparar 50 mL de solución de disociación, añadir 5 μl de CaCl₂ (1 M) y 500 μl de BSA (10%) a 49,5 mL de cero Ca^{2 +} PSS. Dejar la solución a temperatura ambiente (RT).
5. Enzimas
   1. Para la digestión parcial de los segmentos arteriales, preparar 1 mL de solución de digestión con papaína 0,31 mg/mL, 0.5 mg/mL dithioerythritol, colagenasa de 0,75 mg/mL (mezcla de tipo H) y elastasa de 0,13 mg/mL.
      Nota: Actividades enzimáticas pueden variar; sin embargo, nuestros protocolos exitosos, actividades enzimáticas comercialmente suministrados han sido utilizadas como sigue: papaína ≥ 10 unidades/mg; colagenasa ≥1 unidades/mg, para volumen de sustrato N-[3-(2-Furyl)acryloyl]-Leu-Gly-Pro-Ala o FALGPA; y elastasa ≥ 5 unidades/mg.
6. Preparación de Fura-2 y agentes farmacológicos
   1. Preparar stock concentración (1 mM) de Fura-2 tinte de AM en DMSO. Preparar una concentración de trabajo (10 μm) mediante la adición de 5 μl del stock a 495 μl de PSS para la carga.
   2. Preparar ≥50 mL de las concentraciones de los agentes farmacológicos (p. ej., ATP) de trabajo PSS según el caso.
7. Realización de solución
   1. Preparar la realización de una solución 2 M de KCl, por disolución de KCl en desionizada H₂O (7,455 g KCl en 50 mL de H₂O).
   2. Filtrar la solución a través de un filtro de jeringa 0,22 μm antes de rellenar los electrodos afilados.
8. Yoduro de propidio (0.1%)
   1. Disolver 10 mg de yoduro de propidio liofilizado 10 ml de 2 M de KCl.
   2. Mezclar bien y guardar a TA.

3. disección y aislamiento de la arteria Cerebral

Nota: Todos los procedimientos de disección requieren ampliación de muestra (hasta 50 x) a través de la iluminación proporcionada por fuentes de luz óptica de fibra y Estereomicroscopio. Para realizar procedimientos de disección para el aislamiento de las arterias y el cerebro, utilizar instrumentos de disección afilada. Instrumentos de microdisección para aislar y limpiar las arterias incluyen pinzas de punta fina afiladas y tijeras de Vannas estilo disección (hojas de 3 a 9.5 mm).

1. Aislamiento de cerebro de ratón
   1. Anestesiar una C57BL/6 ratón (3-30 meses viejo, hombres o mujeres) a través de la inhalación de isoflurano (3% para 2 a 3 minutos) y luego decapitar el animal inmediatamente después de la inducción completa de la anestesia. Coloque la cabeza en un plato de Petri (diámetro 10 cm, profundidad 1.5 cm) que contienen frío (4 ° C) cero Ca^{2 +} PSS bajo un estereomicroscopio.
   2. Visualización a través del microscopio, quitar la piel y el cabello sobre el cráneo y retire el exceso de sangre con frío cero Ca^{2 +} PSS. Hacer una incisión usando sólo las puntas de las tijeras de disección estándar (por ejemplo, hoja de 24 mm), empezando por el hueso occipital y que se extiende hacia arriba a través del hueso nasal del cráneo.
   3. Abrir el cráneo con cuidado a lo largo de la incisión utilizando pinzas con punta gruesa y separado del tejido conectivo para aislar el cerebro con un círculo intacto de Willis.
      Nota: Alternativamente, pueden utilizarse Littauer pinzas de corte de hueso para abrir el cráneo y exponer el cerebro.
   4. Lave suavemente el cerebro aislado con frío cero Ca^{2 +} PSS en un vaso de precipitados para eliminar sangre. Coloque el lado ventral del cerebro hacia arriba en un compartimiento que contenga solución de disección en frío para el aislamiento de las arterias cerebrales (figura 1A).
2. Aislamiento de arterias cerebrales
   Nota: La arteria cerebral posterior ha sido seleccionada como modelo de estudio endoteliales cerebrovasculares representativo de este protocolo.
   1. Garantizar el cerebro aislado en la solución de la disección en frío con pernos de acero inoxidable (diámetro 0,2 mm, longitud ~ 11-12 mm) para ser insertado en un polímero de silicio carbón-infundido cubriendo la parte inferior (profundidad ≥ 50 cm) de una placa de Petri de vidrio.
   2. Para mantener una temperatura fría de PSS durante la disección, utilizar una cámara de disección enfriada por un sistema de refrigeración continua ciclismo una mezcla de 1:1 agua-etileno glicol. Alternativamente, puede realizarse la disección en hielo fresco.
   3. Quirúrgico, aislar las arterias cerebrales posteriores (~0.3 a segmentos de 0.5 cm, ninguna tensión axial) de la comunicación posterior y arterias basilares usando el microdissection instrumentos Vannas estilo tijeras y pinzas de punta fina afiladas (figura 1B ). Usar pernos de acero inoxidable (diámetro 0,1 mm, longitud ~ 13-14 mm) a aislaron seguro ambas arterias cerebrales posteriores en la solución de la disección en el plato de Petri (figura 1).
   4. Limpiar cuidadosamente las arterias cerebrales posteriores aisladas mediante la eliminación de tejido conectivo con afiladas pinzas de punta fina (figura 1). Cortar segmentos de arterias intactas (longitud 1-2 mm) para la digestión enzimática (figura 1, recuadro).

4. preparación de tubo endotelial y Superfusion

Nota: El tubo endotelial está preparado como se describió anteriormente¹², con modificaciones para la arteria cerebral⁶.

1. Preparar el aparato de trituración utilizando un microscopio equipado con objetivos (10 x, 20 x y 40 x), una cámara y una etapa de aluminio con una cámara y micromanipuladores. Asegure una microjeringa con un controlador de bomba junto a la etapa y la muestra (figura 2A).
2. Totalmente relleno una trituración pipetear con aceite mineral y fijarlo sobre el émbolo de la jeringa de micro. Luego, con la jeringa de micro controlador de la bomba, retirar solución disociación dentro de la pipeta (~ 130 nl) en la parte superior el aceite mineral al tiempo que garantiza la ausencia de burbujas de aire en la pipeta.
3. Lugar intactos segmentos arteriales en 1 mL de solución de disociación en un tubo de vidrio de 10 mL (figura 2B), que contiene papaína 0,31 mg/mL, 0.5 mg/mL dithioerythritol, colagenasa de 0,75 mg/mL y elastasa de 0,13 mg/mL. Incubar a 34 ° C por 10 – 12 min para una digestión parcial.
4. Después de la digestión, reemplazar la solución de enzima con ~ 5 mL de solución fresca de disociación. Con una pipeta de 1 mL, transferir un segmento en una cámara que contiene la solución de disociación a TA.
5. Coloque la pipeta en la solución de disociación en la cámara y colocarlo cerca de un extremo de la embarcación digerido. Establecer una tasa dentro del rango de 2 a 5 nL/s del controlador de bomba para trituración suave (figura 2, encarte).
6. Mientras la visión a través de x 100 a 200 aumentos, retirar y extraer el segmento arterial para disociar las células de músculo liso produciendo un tubo endotelial. Si es necesario, cuidadosamente utilizar pinzas de punta fina para separar el tubo endotelial disociado de la adventicia y la lámina elástica interna. Confirmar que todas las células del músculo liso son disociadas y que las células endoteliales sólo permanecen como un intacto "tubo" (figura 2).
7. Con micromanipuladores, Asegure cada extremo del tubo endotelial en la hoja de cubierta de vidrio de la cámara superfusion usando el vidrio de borosilicate fijación pipetas (Figura 2D).
8. Lavado había disociado adventicia y las células musculares lisas de la cámara y reemplazar la solución de disociación con 2 mM de CaCl₂ PSS. La transferencia de la plataforma móvil con seguro tubo endotelial en el microscopio del aparejo superfusion y experimental.
9. Utilice 6 embalses de 50 mL limpio (Figura 3A) para la entrega continua de PSS y soluciones respectivas drogas durante el experimento, según corresponda. Utilice la válvula de control de flujo en línea para ajustar manualmente el caudal a lo largo como constante con flujo laminar mientras que empareja a la succión del vacío de flujo. Entregar PSS a la cámara (figura 3B) para la superfusion del tubo endotelial para ≥ 5 minutos antes de grabar los datos de fondo y carga de tinte.

5. carga tinte, lavado y temperatura

1. Encender todos los componentes del sistema de fotometría para medir la [Ca^{2 +}]. Utilizar el microscopio en la plataforma experimental (figura 3) que ve el tubo endotelial a 400 aumentos y enfoque en las células en la ventana fotométrica utilizando la suite de software de sistema de fotometría.
2. Mida el diámetro del tubo endotelial y anote los valores de Autofluorescencia de fondo de acuerdo con 510 emisión nm durante la excitación alterna a 340 y 380 nm (≥ 10 Hz).
3. Para medir la [Ca^{2 +}]_yo respuestas, carga el tubo endotelial con Fura-2 soy del tinte (concentración final de 10 μm) a temperatura ambiente y permiten ~ 30-40 min en ausencia de luz.
4. Reiniciar superfusion del tubo endotelial con dulce PSS de ~ 30-40 minutos de lavado el exceso de colorante y permite intracelular Fura-2 estoy a esterificar. Durante el período de lavado, levante la temperatura gradualmente de RT a 37 ° C con un calentador en línea con el regulador de temperatura (Figura 3A) y mantener a 37 ° C durante todo el experimento.
   Nota: La transición incremental recomendada entre RT a 37 ° C conlleva tres pasos (por ejemplo, 5 ° C) con un tiempo de equilibrado de ≥5 min en cada paso.

6. medida simultánea de [Ca^{2 +}]_i y V_m

1. Encienda todos los equipos y la suite de software de Electrómetro para medir V_m (ver figura 3, figura 4). Ajustar en consecuencia la tasa de adquisición de datos (≥ 10 Hz).
2. Tire un afilado electrodo y rellene con 2 M de KCl. Estudios de intercelular de acoplamiento mediante transferencia del tinte, relleno los microelectrodos con yoduro de propidio 0.1% disuelto en 2 M de KCl.
3. Fije el electrodo sobre un alambre de plata cubierto con cloruro en el soporte de pipeta adjunto a una etapa principal de Electrómetro con un micromanipulador. Utilizar el instrumental quirúrgico para brevemente, coloque la punta del electrodo en el PSS que fluye en la cámara mientras la visualización a través del objetivo de 4 x.
4. Establecer el descanso V_m 0 como constante con baño conectado a tierra potencial. Coloque la punta del electrodo a poco más de una célula del tubo endotelial. Si lo desea, utiliza monitores de referencia audible electrómetros se relaciona a asociar tono sonido de posibles grabaciones.
5. Aumentar la magnificación 400 x utilizando el objetivo 40 x y vuelva a colocar la punta del electrodo según sea necesario. Ajustar la ventana fotométrica mediante el software de fotometría para centrarse en las células endoteliales ~ 50 a 80.
6. Suavemente Coloque el electrodo en una de las células del tubo endotelial utilizando el instrumental quirúrgico y esperar ≥ 2 min de reposo V_m a estabilizar. Del mismo modo, inserte un segundo electrodo en otra celda (distancia ≥100 μm) de la primera célula empalada con el primer electrodo.
7. Una vez que reposo V_m es estable a los valores esperados (-30 a -40 mV)⁶, encienda el PMT en la interfaz de fluorescencia en ausencia de luz y comenzar la adquisición de intracelular [Ca^{2 +}] por emocionante Fura-2 alternativamente (10 Hz) en 340 y 380 nm mientras que recoge la emisión de fluorescencia a 510 nm.
   Nota: Para probar el acoplamiento eléctrico intercelular, actual (± 0.5-3 nA, duración del pulso del ~ 20 s) se puede entregar a través de un Electrómetro "Sitio 1", y cambios de V_m se pueden grabar con otro Electrómetro como "sitio 2" (distancia ≥100 μm).
8. Una vez que se establecen medidas simultáneas de V_m y [Ca^{2 +}] , permiten ~ 5 min para la superfusion de tubo endotelial con PSS en un flujo laminar constante antes de la aplicación de medicamentos.
9. Aplicar la droga (e.g., ATP) preparada en PSS la superfusion cámara con flujo constante. Después de ~ 3 minutos (o un período de tiempo apropiado para la cinética de la droga), lavado con PSS hasta V_m y F340/f₃₈₀ relación regresan a sus condiciones de línea de base. Marque las grabaciones respectivas como temporal sincronizado a través de las suites de software fotómetro y Electrómetro durante cada transición de soluciones.
10. Una vez hecho el experimento, retirar el electrodo de la celda usando el instrumental quirúrgico y aviso V_m ~ 0 mV como referencia por el electrodo del baño. Deje de respectivas grabaciones de V_m y [Ca^{2 +}] y guardar los registros en el archivo de análisis de datos.

7. visualización de acoplamiento de célula a célula

1. Para visualizar la celda a celda de acoplamiento a través de propidio, uso un 40 x o 60 x fluorescente objetivo con una apertura numérica relativamente alta (por ejemplo, 0.95) y filtro de rodamina con iluminación de estado sólida, una cámara de alta resolución (por ejemplo, 16- megapíxeles) y una suite de software de proyección de imagen.

Resultados

La demostración esquemática del protocolo descrito anteriormente se muestra en las figuras adjuntas. Un cerebro de un ratón C57BL/6N macho adulto joven (5 meses) se muestra en la figura 1A. Arterias cerebrales posteriores están cuidadosamente aisladas del círculo de Willis, retira el tejido conectivo y cortar en segmentos (figura 1B-D). De segmentos arteriales parcialmente digeridos, el tubo endotelial intac...

Discusión

A la luz de recientes desarrollos^6,15,16,17demostramos ahora el método para aislar el endotelio arterial cerebral de ratón en preparación para la medición simultánea de [Ca^{2 +}] _i y V de_m subyacentes EDH constantemente para ~ 2 h a 37 ° C. Aunque es técnicamente difícil, podemos medir células así de acoplamiento (véase la referencia^6<...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glucose	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	G7021
NaCl	Sigma	S7653
MgCl2	Sigma	M2670
CaCl2	Sigma	223506
HEPES	Sigma	H4034
KCl	Sigma	P9541
NaOH	Sigma	S8045
ATP	Sigma	A2383
HCl	ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)	A466250
Collagenase (Type H Blend)	Sigma	C8051
Dithioerythritol	Sigma	D8255
Papain	Sigma	P4762
Elastase	Sigma	E7885
BSA	Sigma	A7906
Propidium iodide	Sigma	P4170
DMSO	Sigma	D8418
Fura-2 AM dye	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	F14185
Recirculating chiller (Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Scientific	13874647
Plexiglas superfusion chamber	Warner Instruments, Camden, CT, USA	RC-27
Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm)	ThermoFisher Scientific	12-548-5M
Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm)	Warner Instruments	PM6 or PH6
Compact aluminum stage	Siskiyou, Grants Pass, OR, USA	8090P
Micromanipulator	Siskiyou	MX10
Stereomicroscopes	Zeiss, NY, USA	Stemi 2000 & 2000-C
Fiber optic light sources	Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss	Fostec 8375
Nikon inverted microscope	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA	Ts2
Phase contrast objectives	Nikon Instruments Inc	(Ph1 DL; 10X & 20X)
Fluorescent objectives	Nikon Instruments Inc	20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor)
Nikon inverted microscope	Nikon Instruments Inc	Eclipse TS100
Microsyringe pump controller (Micro4 )	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	SYS-MICRO4
Vibration isolation table	Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA	Micro-g
Amplifiers	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Headstages	Molecular Devices	HS-2A & HS-9A
Function generator	EZ Digital, Seoul, South Korea	FG-8002
Data Acquision System	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Digidata 1550A
Audible Baseline Monitors	Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA	BM-A-TM
Digital Storage Oscilloscope	Tektronix, Beaverton, Oregon, USA	TDS 2024B
Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	IonOptix Systems
Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344B or C
Inline Heater	Warner Instruments	SH- 27B
Valve Controller	Warner Instruments	VC-6
Inline Flow Control Valve	Warner Instruments	FR-50
Electronic Puller	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97 or P-1000
Microforge	Narishige, East Meadow, NY, USA	MF-900
Borosilicate Glass Tubes (Trituration)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	1B100-4
Borosilicate Glass Tubes (Pinning)	Warner Instruments	G150T-6
Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes)	Warner Instruments	GC100F-10
Syringe Filter (0.22 µm)	ThermoFisher Scientific	722-2520
Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard	Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA	DD-90-S-BLK
Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm)	World Precision Instruments	555640S, 14364
Scissors 3 & 7 mm blades	Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA	Moria MC52 & 15000-00
Sharpened fine-tipped forceps	FST	Dumont #5 & Dumont #55