Одновременного измерения внутриклеточного кальция и мембранный потенциал в свеже изолированных и нетронутыми мыши мозгового эндотелия

Резюме

Протоколы изоляции (1) свеже нетронутыми церебральный эндотелиальных «трубы» и (2) одновременных измерений эндотелиальной кальция и мембранного потенциала во время эндотелий производные гиперполяризации продемонстрировали здесь. Кроме того эти методы позволяют для фармакологической тюнинг эндотелиальных клеток кальция и электрической сигнализации как индивидуальных или интерактивные экспериментальные переменные.

Аннотация

Церебральных артерий и их соответствующих микроциркуляции доставить кислород и питательные вещества в мозг через регулирование стока крови. Эндотелиальные клетки линии просвета кровеносных сосудов и изменения в сосудистой диаметр команд, необходимых для удовлетворения спроса метаболизма нейронов. Первичной эндотелия зависимые сигнальные пути гиперполяризации мембранного потенциала (V_m) и оксида азота обычно работают параллельно с посредником вазодилатацию и тем самым увеличить поток крови. Хотя неотъемлемой частью координации вазодилатация на несколько миллиметров сосудистой длины, компоненты эндотелий производные гиперполяризации (EDH) были исторически, трудно измерить. Эти компоненты EDH влекут за собой внутриклеточных Ca^{2 +} [Ca^{2 +}]_я увеличивается и последующей активации малых - и средней проводимости Ca^{2 +}-активированный K⁺ (SK_Ca/IK_Ca) каналы.

Здесь мы представляем упрощенная схема изоляции свежие эндотелий от мыши церебральных артерий; одновременное измерение эндотелиальной [Ca^{2 +}]_я и V_m с помощью фура-2 фотометрии и внутриклеточных резкое электродов, соответственно; и непрерывного superfusion солевых растворов и фармакологических агентов в физиологических условиях (рН 7,4, 37 ° C). Задней мозговой артерии от круг Уиллис удаляются без задней общения и базилярной артерии. Ферментативный пищеварения уборка задней церебральной артериальной сегментов и последующие Тритурация облегчает удаление адвентиции, периваскулярной нервов и гладких мышечных клеток. Результате задняя церебральной артериальной эндотелиальной «трубы» затем закреплены под микроскопом и изучены с помощью камеры, фотоэлектронный умножитель трубки, и одного-двух электрометры под непрерывной superfusion. Коллективно этот метод может одновременно измерять изменения в эндотелиальных [Ca^{2 +}]_я и V_m в дискретных сотовой местах, помимо распространения EDH через разрыв соединения до миллиметра расстояния вдоль нетронутыми эндотелий. Ожидается, что этот метод высок объём анализ церебральный эндотелиальных функций, лежащих в основе механизмов регулирования потока крови в мозге, нормального и больными.

Введение

Поток крови в мозг регулируется координации вазодилатация среди церебральных артерий и артериол в сосудистой сети¹. Эндотелиальных клеток, выстилающих мозгового сопротивление артерий команды изменения сосудов диаметром по мере необходимости для удовлетворения спроса метаболизма нейронов^1,2,3. В частности, во время эндотелий производные гиперполяризации (широко известный как EDH) внутриклеточный Ca^{2 +} ([Ca^{2 +}]_я) и электрической сигнализации в эндотелиальных клеток координат вазодилатация среди эндотелиальных клеток и их окружающие гладкомышечные клетки через разрыв соединения для расслабления артериальной⁴. Физиологического возбуждения EDH последовательно влечет за собой стимуляции G_q-сочетании рецепторов (GPCR), увеличение [Ca^{2 +}]_яи активации эндотелиальной малого и среднего Ca^{2 +}-активированный K⁺ (SK_Ca/IK_Ca) каналы для hyperpolarize церебральный эндотелиальных мембранный потенциал (V_m)^5,6,7. Таким образом интимные отношения эндотелиальной [Ca^{2 +}]_я и V_m является неотъемлемой частью регулирование потока крови и незаменимым для кардио - и цереброваскулярные функции^6,8. На протяжении более широких литературы многочисленные исследования сообщили ассоциации сосудистых эндотелиальной дисфункции с развития хронических заболеваний (например, гипертония, диабет, сердечная недостаточность, ишемическая болезнь сердца, хронической почечной недостаточности, заболевания периферических артерий)^9,10, указав значение изучения функции эндотелия в как физиологические, так и патологических условиях.

Эндотелия является неотъемлемой частью производства гиперполяризации, вазодилатацию и перфузии тканей и таким образом, изучение его родной сотовой свойств имеет решающее значение. Как модель общего исследования подготовка модели мыши артериальной эндотелиальной трубка была опубликована до скелетных мышц^11,12,¹³кишки, легких¹⁴и недавно для мозга⁶. В частности исследования одновременных [Ca^{2 +}]_я и V_m измерений были опубликованы для скелетной мускулатуры артериальных эндотелия^15,16 , а также лимфатический сосуд эндотелия¹⁷. Помимо первичного исследования с использованием эндотелиальной трубки подход всеобъемлющий обзор его преимущества и недостатки⁸ можно ознакомиться для определения, если это экспериментальный инструмент подходит для конкретного исследования. Короче говоря, преимуществом является то, что сохраняются основные физиологические компоненты функции эндотелиальных клеток (например,, Ca^{2 +} приток и внутриклеточных релиз, гиперполяризации V_m до Нернста потенциал для K⁺ через SK_Ca/IK_Ca активации и эндотелиальных межклеточные соединения через разрыв соединения) без привходящих факторов, таких как периваскулярной нерва ввода, гладких мышц напряжения закрытого канала функции и сократительную способность, циркуляция крови и гормональных влияний⁸. В отличие от широко используемых ячеек культуры подходов ввести значительные изменения в морфологии¹⁸ и ионного канала выражение¹⁹ в манере, которая значительно может запутывать сравнений физиологических наблюдений определяется ex vivo или в естественных условиях. Ограничения включают в себя отсутствие интеграции с другими важными компонентами для регулирования потока крови, таких как гладких мышц и ограничения гибкости в экспериментальный график, как эта модель оптимально протестирован в течение 4 ч нетронутыми сосудистой сегмент изоляции от животного.

Строительство от предыдущих видео-протокол автором Соча и Сегал¹² и последние экспериментальные разработки в промежуточный^6,,1516, мы настоящим продемонстрировать изоляции свежие эндотелий от задней мозговой артерии и одновременного измерения эндотелиальной [Ca^{2 +}]_я и V_m с помощью фура-2 фотометрии и внутриклеточных резкое электродов, соответственно. Кроме того этот эксперимент предполагает непрерывное superfusion солевых растворов и фармакологических агентов при физиологических условиях (рН 7,4, 37 ° C). Мы выбрали задней мозговой артерии, как он дает изолированных эндотелия с структурной целостности (клеток, Соединенных через разрыв соединения) и достаточные размеры (ширина ≥50 мкм, длина ≥300 мкм) поддаются интра - и межклеточной сигнализации вдоль и среди эндотелиальные клетки. Кроме того исследования грызунов задней мозговой артерии существенно представлены в литературе и охватывать изучение фундаментальных эндотелиальной сигнальных механизмов, развития сосудистой/старения и патологии^{20, 21 , 22}. это экспериментальное приложение ожидается высок объём анализ мозговой функции эндотелия (и дисфункции) и тем самым позволит обеспечить значительный прогресс в понимании регулирования потока крови на протяжении старение и развитие нейродегенеративных заболеваний.

протокол

До проведения следующих экспериментов, обеспечить использование всех животных ухода и протоколы одобрен институциональный уход за животными и использовать Комитет (IACUC) и осуществляется в соответствии с Национальным Советом исследований »руководство для ухода и использования Лабораторных животных» (8-^й издание, 2011) и руководящими принципами прибытия. IACUC Лома Линда университета одобрил все протоколы, используемые для этой рукописи для мужского и женского мышей C57BL/6 (возраст: 3 до 30 мес).

1. оборудование и материалы

Примечание: Подробная информация о материалы, необходимые для вступления протокола можно найти в Таблице материалов, реагентови руководства или веб-сайты, связанные с соответствующими поставщиками.

1. Палата потока
   1. Закрепите superfusion камеры с дном coverslip стекла в платформу из анодированного алюминия. Безопасность платформы с камерой в компактный алюминиевый сцену.
   2. Установите микроманипулятор на каждом конце платформы на сцене алюминия для проведения закрепления пипеткой.
      Примечание: Как практичный вариант Используйте этот аппарат переводные стадии с блоком камеры потока, обеспеченные для содействия переходу от изоляции эндотелиальной трубки к производительности экспериментов.
2. Микроскопы
   1. Использование стереомикроскопов (5 x 50 x увеличение диапазона) оснащены волоконно оптические источники света для макро - и микро рассечение процедур.
   2. Для приготовления эндотелиальной трубок используйте инвертированным микроскопом, оснащенных контраст или дифференциальное вмешательства контраст (DIC) совместимые цели (10 x 20 x и 40 x) и этапа алюминиевые подмости.
   3. Чтобы изолировать эндотелиальной трубы от частично переваренной кровеносных сосудов, разместите контроллер насоса microsyringe рядом с эндотелиальной трубки подготовки аппарат.
   4. Для экспериментальной аппаратуры используйте инвертированным микроскопом, оснащенных Объективы стандартные (4 x и 10 x) Кроме флуоресцентный цели (20 x и 40 x, числовая апертура 0,75) и ручной алюминиевые подмости на столе изоляции вибрации.
3. Внутриклеточные записывающее оборудование
   1. Для записи V_m эндотелиальных клеток в изолированных труб эндотелия, подключите электрометр к совместимый headstage. При необходимости подключите к электрометр для экспериментов, которые требуют текущего инъекции функции генератора или стимулятор.
   2. Соедините выходы усилителя системы сбора данных, звуковой базовые мониторы и осциллографа. Закрепите электрод сравнения (Ag/AgCl Пелле) возле выхода камеры потока во время экспериментов.
   3. Использование фотометрической системы с интегрированные компоненты флуоресценции системы интерфейс, высокой интенсивности дуговая лампа и мощности питания, hyperswitch, фотоэлектронный умножитель трубки (или PMT) и камеры для измерения [Ca^{2 +}]_я в эндотелиальных клетках.
   4. Используйте контроллер температуры с встроенный обогреватель для повышения и поддержания физиологических температура (37 ° C) на протяжении всего эксперимента.
   5. Использование платформы шести водохранилище подключен к контроллеру клапан с клапаном управления встроенного контроля доставки соответствующих решений на эндотелиальных трубу, обеспеченных в камере.
4. Micropipettes и острыми электродов
   Примечание: Для изготовления пипетки для Тритурация и механической стабилизации изолированных труб эндотелия, использовать электронные съемник для натягивая пипетки и микро Кузница ломать и огонь полировки.
   1. Чтобы отделить адвентиции, гладких мышц и эндотелиальных трубки от частично переваренной артериального сегмента, подготовить Тритурация пипетки (каждый с внутренней наконечник диаметром 80-120 мкм) в соответствующих случаях, с использованием капиллярной трубки боросиликатное стекло и огонь Польский совет.
   2. Для обеспечения эндотелиальной трубки против нижней палаты superfusion, используйте закрепление пипетки с затупленными, сферические конца (тепло полированная, ОД 100 — 150 мкм; готовится из боросиликатного стекла тонкостенных труб).
   3. Чтобы записать_m V эндотелиальных клеток, подготовить резкое электроды с кончика сопротивление ~ 150 ± 30 MΩ из стеклянных капиллярных трубок с помощью электронных съемник.

2. Подготовка решений и наркотиков

1. Физиологический раствор соли (PSS)
   1. Для одного эксперимента с лекарственных препаратов, подготовить как минимум 1 Л с помощью PSS: 140 мм NaCl, 5 мм KCl, 2 мм CaCl₂, 1 мм MgCl глюкозы₂, 10 мм N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic кислоты (HEPES) и 10 мм.
   2. Подготовить необходимые решения для вскрытия, изоляции мозговой артерии и подготовка эндотелиальной трубки, подготовить PSS хватает CaCl₂ (нулевой Ca^{2 +} PSS).
   3. Подготовить все решения в сверхчистого дейонизированной H₂O, скорректировать рН 7,4, стерилизовать их через фильтр (размером пор 0,22 мкм) и убедитесь, что между 290 и 300 мОсм осмоляльность решений.
      Примечание: Решения могут храниться при температуре 4 ° C для примерно двух недель.
2. 10% бычьим сывороточным альбумином (БСА)
   1. Для приготовления 10% BSA, Растворите 1 г лиофилизированный порошок в стакан 10 мл 0 Ca^{2 +} PSS.
   2. Накрыть стакан с парафином фильм и в течение нескольких часов, чтобы пройти с медленное перемешивание для БСА Растворить.
   3. Фильтр окончательное решение, используя шприц 10 мл плюс 0,22 мкм фильтром и сделать 1 мл аликвоты храниться при температуре-20 ° C.
3. Рассечение решение
   1. Подготовить 50 мл раствора рассечение, добавьте 500 мкл BSA (10%) 49.5 мл нулевой Ca^{2 +} PSS.
   2. Сразу же после подготовки передачи этот рассечение решения в чашке Петри для артериальной рассечение.
4. Диссоциация решение
   1. Для приготовления 50 мл раствора диссоциации, добавить 5 мкл CaCl₂ (1 М) и 500 мкл до 49,5 мл нулевой Ca^{2 +} PSS БСА (10%). Дайте раствору сидеть при комнатной температуре (RT).
5. Ферменты
   1. Для частичного пищеварения артериальных сегментов Подготовьте 1 мл раствора пищеварения с 0,31 мг/мл папаин, 0.5 мг/мл dithioerythritol, коллагеназа 0,75 мг/мл (тип H смесь) и эластаза 0,13 мг/мл.
      Примечание: Ферментативной активности может варьироваться; Однако, для нашего успешного протоколов, коммерчески предоставленного ферментативной активности были использованы следующим образом: папаин ≥10 единиц/мг; коллагеназы ≥1 единиц/мг, N-[3-(2-Furyl)acryloyl]-Leu-Gly-Pro-Ala или FALGPA субстрата оборот; и эластаза ≥ 5 единиц/мг.
6. Подготовка фура-2 и фармакологических агентов
   1. Подготовка запасов концентрации (1 мм) фура-2 AM красителя в ДМСО. Подготовьте рабочие концентрации (10 мкм), добавив 5 мкл запасов до 495 мкл PSS для загрузки.
   2. Подготовьте ≥50 мл рабочей концентрации фармакологических агентов (например, АТФ) в PSS при необходимости.
7. Проведение решение
   1. Подготовка проведения раствор, 2 M KCl, путем растворения KCl в дейонизированной H₂O (7.455 г KCl в 50 мл H₂O).
   2. Фильтр решение через фильтр шприц 0,22 мкм до закапывания резкое электродов.
8. Пропидий йодидом (0.1%)
   1. Растворите 10 мг лиофилизированных пропидий йодидом в 10 мл 2 м KCl.
   2. Хорошо перемешать и хранить в рт.

3. Вскрытие и изоляции мозговой артерии

Примечание: Все рассечение процедуры требуют увеличения образца (до 50 x) через стереомикроскопов и освещения, предоставляемые волоконно оптические источники света. Для выполнения процедур вскрытия для изоляции мозга и артерии, используйте инструменты заостренный рассечение. Microdissection инструменты для изоляции и очистить артерии включают заостренный штраф наконечником щипцы и беззаботными стиль Рассечение ножницами (3 до 9,5 мм лезвия).

1. Изоляция мозга мыши
   1. Анестезировать C57BL/6 мышь (3-30 месяцев старый, мужчина или женщина) через вдыхание изофлюрановая (3% для 2-3 мин), а затем обезглавить животное, сразу же после завершения индукции анестезии. Установите головку в чашке Петри (диаметр 10 см, глубина 1,5 см) содержащий холодной (4 ° C) нулевой Ca^{2 +} PSS под стереомикроскопом.
   2. Просмотр через микроскоп, удалите кожи и волос над черепа и чрезмерной крови с холодной нулевой Ca^{2 +} PSS. Сделайте надрез, используя только советы стандартных Рассечение ножницами (например, лезвие 24 мм), начиная с затылочной кости и вверх через носовой кости черепа.
   3. Откройте черепа внимательно вдоль разреза с помощью грубой наконечником щипцы и отдельной соединительной ткани изолировать мозга с нетронутыми круг Уиллис.
      Примечание: Кроме того щипцами кости резки Littauer может использоваться для открытия черепа и подвергнуть мозг.
   4. Осторожно промойте изолированных мозга с холодной нулевой Ca^{2 +} PSS в стакан для удаления крови. Место вентральной стороне мозга вверх в камере, содержащей холодной рассечение решение для изоляции церебральных артерий (рис. 1A).
2. Изоляция церебральных артерий
   Примечание: Задней мозговой артерии был выбран в качестве представителя цереброваскулярные исследование эндотелиальной модель для этого протокола.
   1. Обеспечить изолированное мозга в холодной рассечение решения с использованием нержавеющей стали (диаметром 0,2 мм, длина ~ 11 – 12 мм) вставляется в древесный уголь проникнуты кремния полимерное покрытие нижней (глубина ≥50 см) стекла Петри.
   2. Для поддержания охлажденной температуры PSS во время вскрытия, используйте рассечение палате охлаждаются хладагента непрерывно Велоспорт водой 1:1-этилен гликоль смеси. Кроме того рассечение может выполняться на свежий лед.
   3. Хирургически изолируйте задней мозговой артерии (~0.3 до 0,5 см сегменты, не осевая) от задней общения и базилярной артерии, с помощью инструментов microdissection беззаботными стиль ножницы и заточенные штраф наконечником щипцы (Рисунок 1B ). Использование нержавеющей стали (диаметром 0,1 мм, длина ~ 13 – 14 мм) безопасные и изолированные задней мозговой артерии в решении рассечение в Петри (рис. 1 c).
   4. Тщательно очистите изолированное задней мозговой артерии, удалив соединительной ткани, используя заостренный штраф наконечником щипцы (рис. 1 d). Нарезать сегменты нетронутыми артерий (длина 1 – 2 мм) для ферментативного пищеварения (рис. 1 d; врезные).

4. Подготовка эндотелиальной трубы и Superfusion

Примечание: Эндотелиальной трубка готовится, как описано ранее,¹²модификаций для мозговой артерии⁶.

1. Подготовьте Тритурация аппарат, с помощью микроскопа с целями (10 x 20 x и 40 x), камеры и алюминиевые подмости, держа камеру и микроманипуляторов. Безопасный microsyringe с контроллером насоса, прилегающих к сцене и образца (рис. 2A).
2. Полностью засыпки Тритурация Пипетка с минеральным маслом и закрепите его на микро Шприц поршневой. Затем, используя микро шприц с контроллер насоса, снять диссоциации решение в дозатор (~ 130 nl) поверх минерального масла, обеспечивая отсутствие воздушных пузырьков в пипетку.
3. Место нетронутыми артериальных сегментов в 1 мл раствора диссоциации в 10 мл стеклянной трубки (рис. 2B), содержащие папаин 0,31 мг/мл, 0.5 мг/мл dithioerythritol, 0,75 мг/мл коллагеназы и эластаза 0,13 мг/мл. Инкубируйте на 34 ° C для 10-12 мин для частичной пищеварение.
4. После переваривания замените фермента решение ~ 5 мл раствора свежие диссоциации. С помощью пипетки 1 мл, перевести один сегмент в камеру, содержащую решение диссоциация на RT.
5. Поместите дозатор в раствор диссоциации в камере и расположите его рядом с одного конца переваренной судна. Установите скорость в диапазоне от 2 до 5 nL/s на контроллер насоса для нежный Тритурация (рис. 2 c; врезные).
6. Во время просмотра через 100 x 200 x увеличение, снять и извлечь артериального сегмента не присоединяться гладкомышечные клетки при производстве эндотелиальной трубки. При необходимости, осторожно используйте штраф наконечником щипцы для разделения диссоциированных адвентиции и внутренней упругой пластинки от эндотелия трубки. Убедитесь, что все гладкомышечные клетки отделить и что только эндотелиальных клеток остаются нетронутыми «трубки» (рис. 2 c).
7. С помощью микроманипуляторов, обеспечить каждого конца эндотелиальной трубки на стекла Крышка выскальзования superfusion камеры с использованием боросиликатного стекла, закрепление пипетки (Рисунок 2D).
8. Вымывание отделить адвентиции и гладкомышечные клетки от камеры и заменить диссоциации решение с 2 мм CaCl₂ PSS. Передачи мобильной платформы с обеспеченным эндотелиальной трубу на Микроскоп superfusion и экспериментальные установки.
9. Использование 6 резервуаров чистой 50 мл (Рисунок 3А) для непрерывной доставки PSS и решений соответствующих наркотиков во время эксперимента, в случае необходимости. Используйте встроенный клапан контроля вручную установить скорость потока во всем согласуется с ламинарным потоком во время сопоставления потока корма для вакуумного всасывания. Доставлять PSS камеры (рис. 3B) для superfusion эндотелиальная трубки для ≥ 5 мин до запись исходных данных и загрузки красителя.

5. краска нагрузки, вымывание и температурные режимы

1. Включите все компоненты системы фотометрии для измерения [Ca^{2 +}]_я. Для просмотра эндотелиальной трубки на 400 x увеличение и внимание на клетки в окне фотометрических, используя набор программного обеспечения системы фотометрии используйте Микроскоп на экспериментальном стенде (рис. 3 c).
2. Измерьте диаметр эндотелиальной трубки и записывать значения Аутофлюоресценция фона в согласии с 510 нм выбросов во время альтернативных возбуждения на 340 и 380 Нм (≥10 Гц).
3. Для измерения [Ca^{2 +}]_я ответы, нагрузки эндотелиальной трубка с фура-2 AM красителя (конечная концентрация 10 мкм) на RT и позволяют ~ 30-40 мин при отсутствии света.
4. Перезагрузите superfusion эндотелиальная трубки с свежими PSS для ~ 30 – 40 мин до вымывания избыточного красителя и позволяют внутриклеточных фура-2 AM к де эстерифицировать. В период вымывания поднять температуру постепенно от комнатной до 37 ° C, используя регулятор температуры (рис. 3A) с встроенным обогревателем, а затем сохранить при 37 ° C на протяжении всего эксперимента.
   Примечание: Рекомендуется добавочного перехода между RT до 37 ° C влечет за собой три шага (например, 5 ° C) с ≥5 мин время уравновешивания на каждом шагу.

6. одновременное измерение [Ca^{2 +}]_я и V_m

1. Включите все другое оборудование и электрометр набор программного обеспечения для измерения V_м (см. рис. 3, рис. 4). Отрегулируйте скорость сбора данных соответственно (≥10 Гц).
2. Потяните резко электрода и обратной засыпки с 2 М KCl. Для исследования межклеточных муфты переводом красителя, засыпки микроэлектродов с 0.1% пропидий йодидом растворяют в 2 М KCl.
3. Закрепите электрода серебряной проволоки с хлорид в держателе пипетки, придает электрометр главный этап, обеспеченные микроманипулятор покрытием. Используйте микроманипулятор для кратко Расположите наконечник электрода в пропуская PSS в зале во время просмотра через цели 4 x.
4. Установите покоя V_m 0 в соответствии с заземлением Ванна потенциал. Расположите наконечник электрода чуть больше клеток эндотелия трубки. При необходимости, используйте звуковой базовых мониторов, связанных с электрометры связываемый с потенциальными записи звука поле.
5. Увеличить масштаб до 400 x с использованием 40 x цель и повторно установите наконечник электрода при необходимости. Измените фотометрические окно, с помощью программного обеспечения фотометрии сосредоточиться на эндотелиальных клеток ~ 50 – 80.
6. Осторожно поместите электрода в одной из клеток эндотелия трубки с помощью микроманипулятор и ждать ≥2 мин для отдыха V_m для стабилизации. Аналогичным образом вставьте второй электрод в другой ячейке (расстояние ≥100 мкм) из первой ячейки пронзил с первым электродом.
7. После того, как отдыхает V_m является стабильным на уровне его ожидаемые значения (-30 -40 МВ)⁶, включите ПМТ на интерфейсе флуоресценции в отсутствие света и начать приобретение внутриклеточных [Ca^{2 +}]_я захватывающие фура-2 попеременно (10 Гц) в 340 и 380 Нм при сборе флуоресценции выбросов на 510 нм.
   Примечание: Для тестирования межклеточных электрические муфты, текущий (± 0,5-3 nA, длительность импульса ~ 20 s) могут быть доставлены через один электрометр «Сайт 1», и изменения V_m могут быть записаны с другой электрометр как «сайт 2» (расстояние ≥100 мкм).
8. После создания одновременных измерений V_m и [Ca^{2 +}]_я , позволяют ~ 5 мин для superfusion эндотелиальная трубки с PSS со скоростью постоянной ламинарного потока перед применением наркотиков.
9. Примените препарат (например, АТФ), подготовленный в PSS в superfusion палату с постоянной скоростью потока. После ~ 3 мин (или период времени для кинетика препарата) мыть с PSS до V_m и соотношение 380/f F₃₄₀вернуться в их исходных условий. Марк соответствующих записей как височно синхронизированные через фотометр и электрометр комплекты программного обеспечения при каждом переходе решений.
10. После этого эксперимента, снять электрод из ячейки с помощью микроманипулятор и заметить V_m ~ 0 mV как ссылается Ванна электрода. Остановить соответствующие записи V_m и [Ca^{2 +}]_я и сохранить записи файла для анализа данных.

7. Визуализация муфта к ячейке

1. Для визуализации ячеек для сцепления через пропидий йодидом, используйте x 40 или 60 x флуоресцентные цель с относительно высокой числовой апертуры (например, 0,95) и набор фильтров родамин с твердотельного освещения, Камера высокого разрешения (например, 16- мегапикселей) и набор изображений программного обеспечения.

Результаты

Схематические демонстрации протокола, описанные выше показан на вложенные фигуры. Мозг, изолированных от молодых взрослых мужчины C57BL/6Н мышь (5 месяцев) показан на рисунке 1A. Задней мозговой артерии, тщательно изолированы от круг Уиллис, удалены без сое...

Обсуждение

В свете недавних событий^6,,1516,17мы теперь продемонстрировать метод, чтобы изолировать мыши церебральной артериальной эндотелия в подготовке для одновременного измерения [Ca^{2 +}] _i и V_m лежащие в основе EDH ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glucose	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	G7021
NaCl	Sigma	S7653
MgCl2	Sigma	M2670
CaCl2	Sigma	223506
HEPES	Sigma	H4034
KCl	Sigma	P9541
NaOH	Sigma	S8045
ATP	Sigma	A2383
HCl	ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)	A466250
Collagenase (Type H Blend)	Sigma	C8051
Dithioerythritol	Sigma	D8255
Papain	Sigma	P4762
Elastase	Sigma	E7885
BSA	Sigma	A7906
Propidium iodide	Sigma	P4170
DMSO	Sigma	D8418
Fura-2 AM dye	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	F14185
Recirculating chiller (Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Scientific	13874647
Plexiglas superfusion chamber	Warner Instruments, Camden, CT, USA	RC-27
Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm)	ThermoFisher Scientific	12-548-5M
Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm)	Warner Instruments	PM6 or PH6
Compact aluminum stage	Siskiyou, Grants Pass, OR, USA	8090P
Micromanipulator	Siskiyou	MX10
Stereomicroscopes	Zeiss, NY, USA	Stemi 2000 & 2000-C
Fiber optic light sources	Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss	Fostec 8375
Nikon inverted microscope	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA	Ts2
Phase contrast objectives	Nikon Instruments Inc	(Ph1 DL; 10X & 20X)
Fluorescent objectives	Nikon Instruments Inc	20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor)
Nikon inverted microscope	Nikon Instruments Inc	Eclipse TS100
Microsyringe pump controller (Micro4 )	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	SYS-MICRO4
Vibration isolation table	Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA	Micro-g
Amplifiers	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Headstages	Molecular Devices	HS-2A & HS-9A
Function generator	EZ Digital, Seoul, South Korea	FG-8002
Data Acquision System	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Digidata 1550A
Audible Baseline Monitors	Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA	BM-A-TM
Digital Storage Oscilloscope	Tektronix, Beaverton, Oregon, USA	TDS 2024B
Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	IonOptix Systems
Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344B or C
Inline Heater	Warner Instruments	SH- 27B
Valve Controller	Warner Instruments	VC-6
Inline Flow Control Valve	Warner Instruments	FR-50
Electronic Puller	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97 or P-1000
Microforge	Narishige, East Meadow, NY, USA	MF-900
Borosilicate Glass Tubes (Trituration)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	1B100-4
Borosilicate Glass Tubes (Pinning)	Warner Instruments	G150T-6
Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes)	Warner Instruments	GC100F-10
Syringe Filter (0.22 µm)	ThermoFisher Scientific	722-2520
Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard	Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA	DD-90-S-BLK
Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm)	World Precision Instruments	555640S, 14364
Scissors 3 & 7 mm blades	Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA	Moria MC52 & 15000-00
Sharpened fine-tipped forceps	FST	Dumont #5 & Dumont #55