Medições simultâneas de cálcio intracelular e potencial de membrana no endotélio Cerebral rato recém isoladas e intacta

Resumo

Demonstrado aqui são protocolos para isolar (1) recém endoteliais cerebrais intactos "tubos" e medições (2) simultâneas de cálcio endotelial e potencial durante o endotélio-derivado hiperpolarização de membrana. Além disso, esses métodos permitem a otimização farmacológica de cálcio da célula endotelial e sinalização eléctrica como variáveis experimentais individuais ou interativas.

Resumo

Artérias cerebrais e sua respectiva microcirculação entregam oxigênio e nutrientes para o cérebro através do sangue fluxo do regulamento. Células endoteliais linha o lúmen dos vasos sanguíneos e mudanças de comando no diâmetro vascular conforme necessário para atender a demanda metabólica dos neurônios. Primárias vias de sinalização endotélio-dependente de hiperpolarização do potencial de membrana (V_m) e óxido nítrico normalmente operam em paralelo para mediar a vasodilatação e, assim, aumentar o fluxo sanguíneo. Embora integral para coordenar a vasodilatação mais vários milímetros de comprimento vascular, componentes do endotélio-derivado hiperpolarização (EDH) foram historicamente difíceis de medir. Esses componentes de EDH implicar intracelular Ca^{2 +} [Ca^{2 +}]_eu aumenta e subsequente ativação de pequenas e intermediário condutância de Ca^{2 +}-ativado K⁺ (SK_Cacomo_Ca) canais.

Aqui, apresentamos uma ilustração simplificada do isolamento de fresco endotélio de artérias cerebrais do rato; medições simultâneas de endotelial [Ca^{2 +}]_eu e V_m usando fotometria de Fura-2 e eletrodos afiados intracelulares, respectivamente; e uma superfusion contínua de soluções salinas e agentes farmacológicos sob condições fisiológicas (pH 7,4, 37 ° C). Artéria cerebral posterior do círculo de Willis é removida sem a comunicação posterior e as artérias basilar. Digestão enzimática de segmentos de arteriais cerebrais posteriores limpos e posterior trituração facilita a remoção da adventícia, perivascular nervos e células musculares lisas. Resultantes posteriores cerebrais arteriais endoteliais "tubos" Então são protegidos sob um microscópio e examinaram usando uma câmera, tubo fotomultiplicador, e um ou dois Electrómetros sob contínua superfusion. Coletivamente, esse método pode medir simultaneamente alterações endoteliais [Ca^{2 +}]_eu e V_m em locais celulares discretas, além da propagação de EDH através de junções até distâncias milímetros ao longo da intacta endotélio. Este método é esperado para produzir uma análise do elevado-throughput das funções endoteliais cerebrais subjacente mecanismos de regulação de fluxo de sangue no cérebro normal e doente.

Introdução

Fluxo de sangue em todo o cérebro é regulado pela coordenação da vasodilatação entre artérias cerebrais e arteríolas em redes vasculares¹. Células endoteliais que revestem mudanças de comando de artérias de resistência cerebral vascular diâmetro conforme necessário para atender a demanda metabólica dos neurônios^1,2,3. Em particular, durante a hiperpolarização derivado de endotélio (vulgarmente conhecida por EDH), intracelular Ca^{2 +} ([Ca^{2 +}]_eu) e sinalização eléctrica em células endoteliais vasodilatação coordenada entre as células endoteliais e seus células de músculo liso circundante através de junções para relaxamento arterial⁴. Iniciação fisiológica de EDH sequencialmente implica a estimulação do G_q-acoplados a receptores (GPCRs), um aumento de [Ca^{2 +}]_eue ativação de endotelial pequeno - e intermediário-Ca^{2 +}-ativado K⁺ (SK_Cacomo_Ca) canais para hiperpolarizar a membrana endotelial cerebral potenciais (V_m)^5,6,7. Assim, a relação íntima de endotelial [Ca^{2 +}]_eu e V_m é parte integrante do Regulamento de fluxo de sangue e indispensável para cardio e cerebrovascular função^6,8. Em toda a literatura mais ampla, numerosos estudos relataram Associação de disfunção endotelial vascular com o desenvolvimento de doenças crônicas (por exemplo, hipertensão, diabetes, insuficiência cardíaca, doença arterial coronariana, insuficiência renal crônica, doença arterial periférica)^9,10, indicando a importância de se estudar a função endotelial em condições fisiológicas, bem como patológicas.

Endotélio vascular é essencial para a produção de hiperpolarização, vasodilatação e perfusão do tecido e assim, o exame de suas propriedades celulares nativas é crucial. Como um modelo de estudo geral, preparação de modelo de tubo endotelial arterial o mouse foi publicada antes por músculo esquelético^11,12, intestino¹³, pulmão¹⁴e, recentemente, para o cérebro⁶. Estudos de simultânea [Ca^{2 +}]_eu e medições de_m V em particular têm sido publicados para o músculo esquelético endotélio arterial^15,16 , bem como de endotélio de vasos linfáticos¹⁷. Além de estudos primários, utilizando a abordagem de tubo endotelial, uma revisão abrangente das suas vantagens e desvantagens⁸ pode ser consultada para determinar se esta ferramenta experimental é apropriada para um estudo específico. Em breve, uma vantagem é que os principais componentes fisiológicos da função endothelial da pilha são retidos (por exemplo,, Ca^{2 +} influxo e liberação intracelular, hiperpolarização de V_m até o potencial de Nernst para K⁺ através SK_Cacomo ativação de_Ca e acoplamento intercelular endoteliais através de junções) sem confusão de fatores tais como a entrada do nervo perivascular, função de canais voltagem-dependentes de músculo liso e contratilidade, circulação do sangue e influências hormonais⁸. Em contraste, abordagens de cultura celular comumente usados introduzir alterações significativas na morfologia¹⁸ e íon canal expressão¹⁹ de uma maneira que grandemente pode ofuscar as comparações fisiológicas observações determinadas ex vivo ou na vivo. Limitações incluem a falta de integração com outros componentes essenciais para regular o fluxo de sangue, tais como músculo liso e flexibilidade restrita em um horário experimental, como este modelo ideal é testado dentro de 4 h de isolamento de segmento vascular intacta do animal.

Construção de um protocolo de vídeo anterior de autoria de Socha e Segal¹² e recentes desenvolvimentos experimentais no intercalar^6,15,16, por este meio demonstrar o isolamento do endotélio fresco de artéria cerebral posterior e medições simultâneas de endotelial [Ca^{2 +}]_eu e V_m usando fotometria de Fura-2 e eletrodos afiados intracelulares, respectivamente. Além disso, esta experiência implica superfusion contínua de soluções salinas e agentes farmacológicos durante condições fisiológicas (pH 7,4, 37 ° C). Escolhemos a artéria cerebral posterior, como rende endotélio isolado com a integridade estrutural (células acopladas através de junções) e dimensões suficientes (largura ≥ 50 µm, comprimento ≥300 µm) favoráveis para intrae sinalização intercelular ao longo e entre células endoteliais. Além disso, estudos da artéria cerebral posterior roedor estão substancialmente representados na literatura e abrangem o exame de mecanismos fundamentais de sinalização endoteliais vascular desenvolvimento/envelhecimento e patologia^{20, 21 , 22}. esta aplicação experimental é esperada para produzir uma análise de alto rendimento da função endotelial cerebral (e disfunção) e desse modo permitirá avanços significativos no entendimento do Regulamento de fluxo de sangue ao longo envelhecimento e o desenvolvimento de doenças neurodegenerativas.

Protocolo

Antes de realizar os experimentos seguintes, certifique-se de que usar de todos os cuidados com animais e protocolos são aprovados pelos cuidados institucionais do Animal e usar Comité (IACUC) e executados de acordo com do Conselho Nacional de pesquisa "guia para o cuidado e o uso de ' De animais de laboratório (8^th Edition, 2011) e as diretrizes de chegada. O IACUC da Loma Linda University aprovou todos os protocolos utilizados para este manuscrito para masculinos e femininos camundongos C57BL/6 (faixa etária: 3 a 30 mo).

1. equipamentos e materiais

Nota: Detalhes do material necessário para o protocolo podem ser encontrados na Tabela de materiais, reagentese manuais ou sites associados com os respectivos fornecedores.

1. Câmara de fluxo
   1. Fixe uma câmara de superfusion com um fundo de lamela de vidro em uma plataforma de alumínio anodizado. Proteger a plataforma com a câmara em um estágio de alumínio compacto.
   2. Defina um micromanipulador em cada extremidade da plataforma na fase de alumínio para segurar a pipeta de fixação.
      Nota: Como uma opção prática, use este aparato de palco transferível com uma unidade de câmara de fluxo protegida para facilitar a transição do isolamento do tubo endotelial para desempenho dos experimentos.
2. Microscópios
   1. Microscópios de duas oculares uso (5x a gama de ampliação x 50) equipado com fontes de luz da fibra óptica para procedimentos de macro e microdissecação.
   2. Para a preparação dos tubos endoteliais, use um microscópio invertido equipado com fase diferencial ou contraste interferência contraste (DIC) compatível com os objectivos (10x, 20x e 40x) e numa fase de alumínio.
   3. Para isolar tubos endoteliais dos vasos de sangue parcialmente digeridos, coloque um controlador de bomba micro-seringa adjacente ao aparelho de preparação de tubo endotelial.
   4. Para o aparato experimental, use um microscópio invertido equipado com objectivos padrão (4 x e x 10) Além de objectivos fluorescentes (20x e 40x, abertura numérica 0,75) e um palco de manual de alumínio em uma tabela de isolamento de vibração.
3. Equipamento de gravação intracelular
   1. Para gravar o V_m de células endoteliais em tubos endoteliais isolados, conecte o eletrômetro para o headstage compatível. Se necessário, conecte um gerador de função ou estimulador para o eletrômetro para experimentos que requerem injeção atual.
   2. Conecte as saídas do amplificador para um sistema de aquisição de dados, monitores audível de base e um osciloscópio. Fixe o eléctrodo de referência (pellet de Ag/AgCl) perto da saída de câmara de fluxo durante as experiências.
   3. Usar um sistema fotométrico com componentes integrados de uma fluorescência sistema interface, alta intensidade lâmpada de arco e poder abastecimento, hyperswitch, tubo fotomultiplicador (ou PMT) e uma câmera para medir [Ca^{2 +}]_eu nas células endoteliais.
   4. Use um controlador de temperatura equipado com um aquecedor embutido para aumentar e manter a temperatura fisiológica (37 ° C) durante todo o experimento.
   5. Use uma plataforma de seis-reservatório conectada a um controlador de válvula com uma válvula de controle de fluxo inline para controlar a entrega das respectivas soluções para o tubo endotelial garantido na câmara.
4. Micropipetas e eletrodos afiados
   Nota: Para fabricar pipetas para trituração e a estabilização mecânica dos tubos endoteliais isolados, use um extrator eletrônico para puxar as pipetas e forjar um micro para quebrar e polimento de fogo.
   1. Para separar a adventícia, músculo liso e o tubo endotelial do segmento arterial parcialmente digerido, preparem trituração pipetas (cada um com um diâmetro interno de ponta de 80 – 120 µm) conforme apropriado, usando tubos capilares de vidro de borosilicato e fogo polir a ponta.
   2. Para fixar o tubo endotelial contra o fundo da câmara superfusion, usar pipetas de fixação com uma extremidade cega, esférica (calor-lustrado, OD de 100 – 150 µm; preparados a partir de tubos de vidro de borosilicato de parede fina).
   3. Para gravar V_m de uma célula endotelial, preparar eletrodos afiados com resistência de ponta de ~ 150 ± 30 MΩ de tubos capilares de vidro usando um extrator de eletrônico.

2. preparação de soluções e drogas

1. Solução salina fisiológica (PSS)
   1. Para um experimento com preparações da droga, prepare um mínimo de 1 L de PSS usando: 140 mM de NaCl, KCl, 2 mM CaCl₂, de 5 mM 1 mM MgCl₂, ácido N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic (HEPES) de 10 mM e 10 mM de glicose.
   2. Para preparar as soluções necessárias para dissecação, isolamento da artéria cerebral e preparação do tubo endotelial, preparar PSS falta CaCl₂ (zero Ca^{2 +} PSS).
   3. Preparar todas as soluções em desionizada ultrapura H₂O, ajustar o pH para 7,4, esterilizá-los através de um filtro (tamanho de poros de 0,22 µm) e certifique-se de que a pressão osmótica das soluções é entre 290 e 300 mOsm.
      Nota: Soluções podem ser armazenadas a 4 ° C por aproximadamente duas semanas.
2. 10% albumina de soro bovino (BSA)
   1. Para preparar 10% BSA, dissolva 1 g de pó liofilizado em um béquer de 10 mL zero Ca^{2 +} PSS.
   2. Cobrir o béquer com filme de parafina e permitir um período de várias horas para passar, com agitação lenta para a BSA dissolver.
   3. Filtrar a solução final, utilizando uma seringa de 10 mL além de um filtro de 0,22 µm e fazer alíquotas de 1 mL para ser armazenado a-20 ° C.
3. Solução de dissecação
   1. Para preparar 50 mL de solução de dissecação, adicione 500 µ l de BSA (10%) a 49,5 mL de zero Ca^{2 +} PSS.
   2. Imediatamente após o preparo, transferi esta solução de dissecação em uma placa de Petri para dissecção arterial.
4. Solução de dissociação
   1. Para preparar 50 mL de solução de dissociação, adicione 5 µ l de CaCl₂ (1 M) e 500 µ l de BSA (10%) a 49,5 mL de zero Ca^{2 +} PSS. Permitir que a solução sentar-se à temperatura ambiente (RT).
5. Enzimas
   1. Para a digestão parcial dos segmentos arteriais, prepare-se 1 mL de solução de digestão com papaína 0,31 mg/mL, 0,5 mg/mL dithioerythritol, colagenase 0,75 mg/mL (mistura de tipo H) e elastase 0,13 mg/mL.
      Nota: Actividades enzimáticas podem variar; no entanto, para nossos bem sucedidos protocolos, actividades enzimáticas fornecido comercialmente têm sido utilizadas como segue: papaína ≥ 10 unidades/mg; colagenase ≥ 1 unidades/mg, para o volume de substrato de N-[3-(2-Furyl)acryloyl]-Leu-Gly-Pro-Ala ou FALGPA; e elastase ≥ 5 unidades/mg.
6. Preparação de Fura-2 e agentes farmacológicos
   1. Preparar a concentração das ações (1mm) de Fura-2 corante AM em DMSO. Prepare uma concentração de trabalho (10 µM), acrescentando 5 µ l de estoque a 495 µ l de PSS para o carregamento.
   2. Prepare ≥ 50 mL de concentrações de agentes farmacológicos (por exemplo, ATP) a trabalhar no PSS, conforme apropriado.
7. Realização de solução
   1. Preparar a realização de uma solução, 2m KCl, dissolvendo KCl em desionizada H₂O (g 7,455 KCl em 50 mL de H₂O).
   2. Filtre a solução através de um filtro de seringa 0,22 µm antes de aterrar os eléctrodos afiados.
8. Iodeto de propidium (0,1%)
   1. Dissolva 10 mg de iodeto de propidium liofilizado em 10 mL de 2m KCl.
   2. Misture bem e guarde em RT

3. dissecção e o isolamento da artéria Cerebral

Nota: Todos os procedimentos de dissecação requerem ampliação espécime (até 50 x) através de duas oculares e iluminação fornecida por fontes de luz de fibra óptica. Para executar os procedimentos de dissecação para isolamento do cérebro e as artérias, use instrumentos de dissecção afiada. Microdissection ferramentas para isolar e limpar as artérias incluem pinças de ponta fina afiadas e Vannas para dissecação estilo (lâminas de 3 a 9,5 mm).

1. Isolamento de cérebro de rato
   1. Anestesiar uma C57BL/6 rato (3-30 meses velhos; masculinos ou femininos) através de inalação de isoflurano (3% para 2-3 min) e, em seguida, decapitar o animal imediatamente após completa da indução da anestesia. Coloque a cabeça em uma placa de Petri (diâmetro 10 cm, profundidade de 1,5 cm) contendo a frio (4 ° C) zero Ca^{2 +} PSS sob um estereomicroscópio.
   2. Visualização através do microscópio, retire a pele e os cabelos sobre o crânio e remover sangue excessiva com frio zero Ca^{2 +} PSS. Fazer uma incisão utilizando apenas as pontas da tesoura padrão de dissecação (por exemplo, lâmina de 24 milímetros), começando com o osso occipital e estendendo-se através do osso nasal do crânio.
   3. Abra o crânio cuidadosamente ao longo da incisão utilizando pinças de ponta grossa e separada do tecido conjuntivo para isolar o cérebro com um círculo de Willis intacta.
      Nota: Alternativamente, fórceps de Littauer osso-corte pode ser usado para abrir o crânio e expor o cérebro.
   4. Lave delicadamente o cérebro isolado com frio zero Ca^{2 +} PSS num copo para remover sangue. Coloque o lado ventral do cérebro virado para cima em uma câmara contendo solução fria de dissecação para isolamento de artérias cerebrais (figura 1A).
2. Isolamento de artérias cerebrais
   Nota: A artéria cerebral posterior foi selecionada como um modelo de estudo endotelial vascular representativa para este protocolo.
   1. Proteger o cérebro isolado na solução fria de dissecação usando pinos de aço inoxidável (diâmetro de 0,2 mm, comprimento ~ 11 – 12 mm) para ser inserido em um polímero de silicone de carvão-infundido revestimento do fundo (profundidade ≥ 50 cm) de uma placa de Petri de vidro.
   2. Para manter uma temperatura refrigerada de PSS durante a dissecção, use uma câmara de dissecação resfriada por um sistema refrigerante continuamente ciclismo uma mistura de 1:1 água-etileno glicol. Alternativamente, poderá efectuar-se a dissecação no gelo fresco.
   3. Cirurgicamente, isolar a artéria cerebral posterior (~0.3 aos segmentos de 0,5 cm, sem tensão axial) da comunicação posterior e artérias basilar usando microdissection instrumentos Vannas estilo tesoura e pinça de ponta fina afiada (figura 1B ). Usar os pinos de aço inoxidável (diâmetro de 0,1 mm, comprimento ~ 13 – 14 mm) seguro ambos isolaram artérias cerebrais posteriores na solução de dissecação na prato de Petri (Figura 1).
   4. Limpa as artérias cerebrais posteriores isoladas cuidadosamente, removendo tecido conjuntivo usando pinças de ponta fina afiadas (Figura 1). Corte as artérias intactas em segmentos (comprimento 1-2 mm) para digestão enzimática (Figura 1; inserir).

4. preparação do tubo endotelial e Superfusion

Nota: O tubo endotelial é preparado conforme descrito anteriormente,¹², com as modificações para a artéria cerebral⁶.

1. Prepare o equipamento de trituração usando um microscópio equipado com objetivos (10x, 20x e 40x), uma câmera e um palco de alumínio segurando uma câmara e Micromanipuladores. Fixe uma micro-seringa com um controlador da bomba ao lado do palco e a amostra (Figura 2A).
2. Completamente uma trituração de aterramento pipetar com óleo mineral e fixá-lo sobre o êmbolo da seringa. Em seguida, usando a microseringa com controlador da bomba, retirar solução de dissociação para a pipeta (~ 130 nl) em cima do óleo mineral, garantindo a ausência de bolhas de ar na pipeta.
3. Coloque intactos segmentos arteriais em 1 mL de solução de dissociação em um tubo de vidro de 10 mL (Figura 2B), contendo papaína 0,31 mg/mL, 0,5 mg/mL dithioerythritol, colagenase 0,75 mg/mL e elastase 0,13 mg/mL. Incube a 34 ° C por 10 – 12 min para a digestão parcial.
4. Após a digestão, substitua a solução de enzima ~ 5 mL de solução fresca de dissociação. Utilizando uma pipeta de 1 mL, transferir um segmento em uma câmara que contém a solução de dissociação no RT
5. Colocar a pipeta na solução de dissociação na câmara e posicioná-lo perto de uma extremidade do navio digerido. Defina uma taxa dentro do intervalo de 2 a 5 nL/s no controlador de bomba para trituração suave (Figura 2; inserir).
6. Enquanto a visualização através de 100x para ampliação de 200x, retirar e ejetar o segmento arterial para dissociar as células do músculo liso ao produzir um tubo endotelial. Se necessário, use cuidadosamente pinças de ponta fina para separar o tubo endotelial adventícia dissociada e lâmina elástica interna. Confirme que todas as células do músculo liso são dissociadas e que as células endoteliais só permanecem como um tubo"intacto" (Figura 2).
7. Usando Micromanipuladores, prenda cada extremidade do tubo endotelial sobre a lamela de vidro da câmara superfusion usando o vidro de borosilicato fixando pipetas (Figura 2D).
8. Wash-out dissociou adventícia e células musculares lisas da sala e a substituir a solução de dissociação com 2 mM CaCl₂ PSS. Transferi a plataforma móvel com tubo endotelial segura sobre o microscópio de equipamento experimental e superfusion.
9. Use 6 reservatórios de 50ml limpo (Figura 3A) para a entrega contínua de PSS e respectivas drogas soluções durante o experimento, conforme apropriado. Use a válvula de controle de fluxo inline para definir manualmente a taxa de fluxo ao longo como consistente com fluxo laminar enquanto correspondência fluxo alimentar de sucção à vácuo. Entrega o PSS para a câmara (Figura 3B) para a superfusion do tubo endotelial para ≥ 5 min antes de gravar os dados de fundo e tintura de carregamento.

5. corante carga, Wash-Out e ajustes de temperatura

1. Liga todos os componentes do sistema de medição [Ca^{2 +}]_eude fotometria. Use o microscópio na plataforma experimental (Figura 3) para exibir o tubo endotelial em 400 x de ampliação e foco em células na janela fotométrica usando a suite de software de sistema de fotometria.
2. Medir o diâmetro do tubo endotelial e gravar valores de autofluorescência de fundo de acordo com a emissão de nm 510 durante a excitação alternativa em 340 e 380 nm (≥ 10 Hz).
3. Para medir [Ca^{2 +}]_eu respostas, carga o tubo endotelial com Fura-2 vou tingir (concentração final de 10 µM) em RT e permitir ~ 30 – 40 min na ausência de luz.
4. Reiniciar superfusion do tubo endotelial com PSS fresco para ~ 30-40 min para lavagem-para fora o excesso de corante e permitir intracelular Fura-2 estou a eliminação esterificar. Durante o período de lavagem, elevar a temperatura gradualmente de RT a 37 ° C, usando o controlador de temperatura (Figura 3A), com um aquecedor embutido e, em seguida, manter a 37 ° C durante todo o experimento.
   Nota: A transição incremental recomendada entre RT a 37 ° C envolve três etapas (por exemplo, de 5 ° C) com um tempo de equilibração ≥ 5 min em cada etapa.

6. medida simultânea de [Ca^{2 +}]_eu e V_m

1. Ligue todos os outros equipamentos e a suíte de softwares eletrômetro para medir V_m (ver Figura 3, Figura 4). Ajustar de acordo com a taxa de aquisição de dados (≥ 10 Hz).
2. Puxe um eletrodo afiado e aterramento com 2m KCl. Para estudos de intercelular acoplamento através de transferência de tinta, aterramento de microeletrodos com iodeto de propidium 0,1% dissolvido em 2m KCl.
3. Fixe o eletrodo ao longo de um fio de prata revestido com cloreto no porta-pipetas anexado a um estágio de cabeça eletrômetro protegido com um micromanipulador. Use o micromanipulador para brevemente, posicione a ponta do eletrodo para o PSS fluindo na câmara durante a visualização através do objectivo de 4x.
4. Como o descanso V_m 0 como consistente com banho de terra potencial. Posicione a ponta do eletrodo, pouco mais de uma célula do tubo endotelial. Se desejar, use monitores audível de base ligados à Electrómetros para associar som campo potenciais gravações.
5. Amplie a 400 x usando o objectivo de 40 x e re-Posicione a ponta do eletrodo, conforme necessário. Ajuste a janela fotométrica usando o software de fotometria para concentrar-se em células endoteliais ~ 50 a 80.
6. Cuidadosamente coloque o eletrodo em uma das células do tubo endotelial usando o micromanipulador e esperar ≥2 min para o descanso de V_m estabilizar. Da mesma forma, inserir um segundo eletrodo em outra célula (distância ≥100 µm) da primeira célula empalada com primeiro eletrodo.
7. Uma vez descansar V_m é estável em seus valores esperados (-30 a -40 mV)⁶, ligue o pgto na interface de fluorescência na ausência de luz e começar a aquisição de intracelular [Ca^{2 +}]_eu por emocionante Fura-2 alternadamente (10 Hz) no 340 e 380 nm enquanto coleta de emissão de fluorescência em 510 nm.
   Nota: Para testar o acoplamento elétrico intercelular, atual (± 0.5-3 at, duração do pulso de ~ 20 s) podem ser entregues através de um eletrômetro como "Site 1", e mudanças de V_m podem ser gravadas com outro eletrômetro como "Site 2" (distância ≥100 µm).
8. Uma vez estabelecidas medições simultâneas de V_m e [Ca^{2 +}]_eu , permita ~ 5 min para superfusion do tubo endotelial com PSS a uma taxa constante de fluxo laminar, antes da aplicação de drogas.
9. Aplica a droga (por exemplo, ATP) preparada no PSS para a câmara de superfusion com a taxa de fluxo constante. Depois de ~ 3 min (ou um período de tempo adequado para a cinética da droga), lavagem com PSS até V_m e o rácio de₃₈₀ F/f de₃₄₀retornam às suas condições de linha de base. Marca respectivas gravações como temporalmente sincronizados através do fotômetro e eletrômetro suites de software durante cada transição de soluções.
10. Uma vez feito o experimento, retirar o eletrodo da célula usando o micromanipulador e observe V_m ~ 0 mV como referenciado pelo eléctrodo de banho. Parar as respectivas gravações de V_m e [Ca^{2 +}]_eu e salvar os registros no arquivo para análise de dados.

7. visualização de acoplamento de célula para célula

1. Para visualizar o acoplamento de célula para célula através do iodeto de propidium, use um x 40 ou 60 objetivo fluorescente de x com uma abertura numérica relativamente alta (por exemplo, 0,95) e rodamina filtro definido com iluminação de estado sólida, uma câmera de alta resolução (por exemplo, 16- megapixels) e um pacote de software de imagem.

Resultados

A demonstração esquemática do protocolo descrito acima é mostrada nas figuras anexadas. Um cérebro isolado de um jovem macho C57BL/6N rato adulto (5 meses) é mostrado na figura 1A. Artérias cerebrais posteriores são cuidadosamente isoladas do círculo de Willis, removido sem tecido conjuntivo e cortado em segmentos (figura 1B-D). De segmentos arteriais parcialmente digeridos, o tubo endotelial intacto é ...

Discussão

À luz dos recentes desenvolvimentos^6,15,16,17, demonstraremos agora o método para isolar o endotélio arterial cerebral de rato em preparação para a medida simultânea de [Ca^{2 +}] _eu e o V_m subjacentes EDH consistentemente para ~ 2 h a 37 ° C. Embora tecnicamente difícil, podemos medir a-celular acoplamento também (veja referência⁶...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glucose	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	G7021
NaCl	Sigma	S7653
MgCl2	Sigma	M2670
CaCl2	Sigma	223506
HEPES	Sigma	H4034
KCl	Sigma	P9541
NaOH	Sigma	S8045
ATP	Sigma	A2383
HCl	ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)	A466250
Collagenase (Type H Blend)	Sigma	C8051
Dithioerythritol	Sigma	D8255
Papain	Sigma	P4762
Elastase	Sigma	E7885
BSA	Sigma	A7906
Propidium iodide	Sigma	P4170
DMSO	Sigma	D8418
Fura-2 AM dye	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	F14185
Recirculating chiller (Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Scientific	13874647
Plexiglas superfusion chamber	Warner Instruments, Camden, CT, USA	RC-27
Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm)	ThermoFisher Scientific	12-548-5M
Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm)	Warner Instruments	PM6 or PH6
Compact aluminum stage	Siskiyou, Grants Pass, OR, USA	8090P
Micromanipulator	Siskiyou	MX10
Stereomicroscopes	Zeiss, NY, USA	Stemi 2000 & 2000-C
Fiber optic light sources	Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss	Fostec 8375
Nikon inverted microscope	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA	Ts2
Phase contrast objectives	Nikon Instruments Inc	(Ph1 DL; 10X & 20X)
Fluorescent objectives	Nikon Instruments Inc	20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor)
Nikon inverted microscope	Nikon Instruments Inc	Eclipse TS100
Microsyringe pump controller (Micro4 )	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	SYS-MICRO4
Vibration isolation table	Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA	Micro-g
Amplifiers	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Headstages	Molecular Devices	HS-2A & HS-9A
Function generator	EZ Digital, Seoul, South Korea	FG-8002
Data Acquision System	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Digidata 1550A
Audible Baseline Monitors	Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA	BM-A-TM
Digital Storage Oscilloscope	Tektronix, Beaverton, Oregon, USA	TDS 2024B
Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	IonOptix Systems
Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344B or C
Inline Heater	Warner Instruments	SH- 27B
Valve Controller	Warner Instruments	VC-6
Inline Flow Control Valve	Warner Instruments	FR-50
Electronic Puller	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97 or P-1000
Microforge	Narishige, East Meadow, NY, USA	MF-900
Borosilicate Glass Tubes (Trituration)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	1B100-4
Borosilicate Glass Tubes (Pinning)	Warner Instruments	G150T-6
Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes)	Warner Instruments	GC100F-10
Syringe Filter (0.22 µm)	ThermoFisher Scientific	722-2520
Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard	Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA	DD-90-S-BLK
Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm)	World Precision Instruments	555640S, 14364
Scissors 3 & 7 mm blades	Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA	Moria MC52 & 15000-00
Sharpened fine-tipped forceps	FST	Dumont #5 & Dumont #55