التعريفي للابتزاز الأمعاء – مقابل – المضيف المرض وتقييمها بالمنظار ميني في الفئران حية

Summary

نقدم هنا، هو بروتوكول وصف زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم متمكنة ويسمح المتكررة التقييمات ميني المنظار في القولون القاصي في الموقع للوجود والخصائص، وشدة التهاب colonic داخل الحي الفئران التي تعاني من الابتزاز الأمعاء – مقابل – المضيف المرض.

Abstract

الاختلاس – مقابل – المضيف الأمراض الحادة (GvHD) تمثل مضاعفات أشد أن المرضى الذين يتلقون سابقا متمكنة من الخلايا الجذعية المكونة للدم (الو-HCT) زرع الوجه، وكثيراً ما يرتبط مع التوصل إلى نتائج سريرية فقراء. بعض الوقت، على سبيل المثال، عادة ما تستجيب للعلاجات المناعية القمعية أنشئت GvHD مظاهر الجلد و، ومن ثم عدم اتخاذ مسار فادح، والوجود وكثافة جفهد المعوية، خصوصا من منتصف إلى انخفاض أجزاء من القناة الهضمية، تؤثر بقوة على النتائج وعموما البقاء على قيد الحياة للمرضى الذين يعانون من الخيارات الحادة GvHD. العلاجية تقتصر أساسا على وكلاء المناعي القمعية الكلاسيكية الغلة معتدلة فقط آثار التخفيف من حدة المرض. ومن ثم معرفة مفصلة حول تتالي المقيم في الأنسجة المناعية، والتغيرات في الحجمية المعوية، والاستجابة stromal السابقة، عليها، وبعد ظهور جفهد المعوية هناك حاجة ماسة لفهم الأحداث والآليات التي تقوم عليها، المرضية ووضع الخيارات العلاجية المبتكرة. نماذج مورين من GvHD غالباً ما يلجأ إلى تحديد وتقييم وظيفيا الجزيئات ومسارات قيادة مزعومة GvHD المعوية. ومع ذلك، يعني على وجه الخصوص رصد وتقييم التهاب الأمعاء على مر الزمن تنعدم أساسا منذ عشرات المتبعة لتقييم والصف GvHD الحادة بشكل روتيني تتألف من مختلف المعايير التي تعكس GvHD النظامية بدلاً من ذلك مظاهرة. التقييم التفصيلي ل GvHD المعوية قد قيدت للدراسات باستخدام الفئران euthanized، وبالتالي أساسا باستثناء طولية (أي الحركية) تحليلات لحجرة colonic تحت شرط تجريبي معين (مثلاً، جسم بوساطة الحصار الذي تفرضه سيتوكين proinflammatory) في الفئران حية (أي، في فيفو). التقييم في الموقع ميني المنظار القولون القاصي الو-كليات التقنية العليا-يعامل الفئران الموصوفة هنا يسمح أ) تقييما مفصلاً عيانية لجوانب مختلفة من التهاب الأمعاء وب) الخيار لجمع عينات الأنسجة لتحليلات المصب في نقاط زمنية مختلفة على مدى فترة الملاحظة. إجمالاً، يوفر نهج ميني المنظار تقدما كبيرا في رصد موسع السريري وتقييم جفهد المعوية.

Introduction

المكونة للدم الأورام الخبيثة الناشئة مباشرة عن حجرة الخلايا الجذعية المكونة للدم وغير المنضبط، تتقدم بسرعة، واضطرابات جهاز المناعة بوساطة شديدة غالباً مؤشرات أداء كليات الو^1،2. ولكن على الرغم من أن المحاسبة لحدوث استجابة الابتزاز مقابل الورم تشخيصية مفيدة، لمفاوية المانحين كثيرا ما حفز وتعزيز هجوم المناعي بوساطة غير المرغوب فيها من مكونات الأنسجة السليمة داخل المتلقي الو-كليات ، عملية التي تسمى الاختلاس – مقابل – المضيف المرض³. مظاهرة في القناة الهضمية، جفهد المعوية ما يسمى، تمثل المضاعفات الأكثر اللعين من الحادة GvHD، الأشكال الخطيرة التي ترتبط بصورة روتينية مع ارتفاع معدل وفيات^1،،من²⁴.

عموما، موريني ونماذج لالو-HCT ظهرت كأدوات لا تقدر بثمن لتحديد ودراسة الآليات المناعية بوساطة الكامنة وراء أمراض ال جفهد⁵. بيد الحركية من، على سبيل المثال، الآثار المفيدة للتدخلات العلاجية رواية على مر الزمن في الفئران الحية بشكل روتيني يعتمد التقييم على تحديد GvHD السريرية عشرات⁶. بينما هذه النقاط مناسبة لكي تعكس، على سبيل المثال، عموما عبء المرض (أي، GvHD النظامية)، السريرية عشرات عدم حساسية موثوق بها تعكس المظاهر الخاصة بالجهاز (مثل، في القناة الهضمية). ومن ثم، الاستنتاجات، على سبيل المثال فيما يتعلق بآثار واقية من القناة الهضمية لتدخل علاجي معين، التي تستند إلى هذه التهديف النظم عادة ما تقع قصيرة.

وعلى الرغم من إحراز تقدم كبير من خلال اختراع رواية كامل الجسم التصوير طرائق في تركيبة مع الاستخدام أما الماوس الوراثية طرحه أو الفلورسنت نماذج^7،8، منهجيات لمباشرة، وعلى وجه التحديد تقييم الأمعاء تنعدم مظاهر جفهد في الفئران الحية. ومن ثم فالأساس المنطقي وراء بروتوكول التقييم بالمنظار للنمط الظاهري GvHD المعوية الموصوفة في المقطع التالي للتغلب على هذه العقبة. وعلاوة على ذلك، أن الدافع أيضا خفض إعداد الفئران التجريبية منذ ذلك الحين، وحتى الآن، إجراء تقييم مفصل للخصائص الخلوية والجزيئية المورفولوجية (مثل، بالتشريح المرضى أو البيولوجيا الجزيئية) من GvHD المعوية في نهاية المطاف استلزم مظاهر التضحية بالماوس التجريبية.

قد سبق أن أبلغ مؤسستنا على منهجية التقييم بالمنظار ميني لمظاهر colonic أثناء التهاب القولون سينجينيك نماذج⁹. في البروتوكول المعروضة هنا، لدينا المكرر وتكييفها كولونوسكوبيك التهديف مصفوفة ليحركها اللوريسبونسي التهاب القولون في الفئران حية مع GvHD المعوية عند زرع اللوريكتيفي لمفاوية كليات التقنية العليا والجهات المانحة في فئة MHC تماما متطابقة الإعداد . وقد حددنا أربعة المعلمات المناسبة تعكس آفات colonic المعوية المتصلة GvHD. وعلاوة على ذلك، أنشأنا نظاما يتيح درجات صقل لأي واحد محدد، أسفر عن نقاط جديدة بسهولة إطلاع القارئ شدة GvHD المعوية الموجودة في ماوس معينة في نقطة زمنية معينة. وأكدت تحاليل نسيجية أن درجة المنظار عتبة معينة هو موثوق التنبؤ بدرجة معتدلة إلى عالية التهاب الأنسجة. ومن ثم، يظهر التقييم بالمنظار ميني لتمثيل بديل عامل للأنسجة معيار الذهب الذي يتطلب التضحية بالفئران التجريبية بشكل روتيني. الأهم من ذلك، هذا البروتوكول يمكن تطبيقها في أي نقطة زمنية معينة، ويمكن استخدامها مرارا وتكرارا خلال ال^10،المرض¹¹. وعلاوة على ذلك، على النقيض من استخدام نهج تعتمد على الإضاءة الحيوية، أية تدابير العمل المكثف وتستغرق وقتاً طويلاً مثل إينتيركروسينج وراثيا تعديل الفئران مطلوبة و، ومن ثم يمكن تطبيق المنهجية على أي خط الماوس الفائدة.

أخذت معا، نظراً لمنظور السريرية تضر مرضى الو-HCT GvHD المعوية الحادة، التقدم العلمي السريع ومزيد من التبصر في الآليات الجزيئية الكامنة وراء أمراض المناعة هناك حاجة ماسة. وبالمثل، تتطلب الاعتبارات الأخلاقية الهامة، وأن كسب المعرفة ينبغي أن يتحقق مع استخدام أقل عدد ممكن من الفئران التجريبية. ومن ثم على حد سواء الاعتراف بالمطالبات في أوساط البحث استكشاف GvHD المعوية يمكن أن يخدمها تنفيذ المسلسل التقييمات ميني المنظار في القولون في سلسلة العمل التجريبي لرصد والصف GvHD المعوية في الماوس التجريبية الحية النماذج، كوصف والمصادق عليها في البروتوكول المعروضة هنا.

Protocol

الأساليب التجريبية الموصوفة هنا أقرتها حكومة ميتيلفرانكين، بافاريا، ألمانيا.

1-GvHD التعريفي

1. اليوم 0: تشعيع الجسم الكلي للفئران المستفيدة
   1. استخدام الإناث CD45.2⁺ H2kd⁺ بالب/ج الفئران التي على الأقل 10 أسابيع من العمر كمتلقين.
   2. زن وسجل وزن الفئران المستفيدة قبل التعريفي GvHD.
      ملاحظة: ضمان أن المتلقي قد وزن جسم الحد أدنى من 20 غراما. وزن الجسم يبدأ سيكون بمثابة قيمة مرجعية لحساب الوزن من الماوس الفردية GvHD التعريفي والتقدم على مدى.
   3. ضع الفئران يصل إلى خمسة في الحاوية إيرادياتور الأشعة السينية.
   4. تشعيع الفئران تشعيع الجسم الكلي مع جرعة واحدة 8 غراي من الأشعة السينية. استخدام Cs¹³⁷ كمصدر إشعاع.
2. يوم 1: إعادة تشكيل الفئران المشععة مع تي-خلية-نضوب نخاع العظام
   ملاحظة:زرع خلايا نخاع العظام متمكنة، الواردة والمفصلة في الباب 1، 2، ينبغي أن تجري خلال 24 ساعة بعد التشعيع. تنفيذ الإجراءات المذكورة أدناه في ثقافة الأنسجة معقمة هود واستخدام الكواشف التي تمت تصفيتها. استخدام متمكنة CD45.1/Ly5.1 B6. سخل-Ptprca Pepcb/الفئران بويكرل كمانحين لخلية T-المنضب نخاع العظام.
   1. Euthanize CD45.1/Ly5.1 B6. سخل الفئران التي ستتبرع بخلايا نخاع العظام متمكنة وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية، ح 12-24 بعد تشعيع بالب/ج الفئران المستفيدة. ولهذا الغرض، تخدير CD45.1/Ly5.1 B6. سخل الفئران باستنشاق إيسوفلوراني 5%. تواصل مع التعرض إيسوفلوراني أكثر من 1 دقيقة بعد إلقاء القبض في التنفس وتأكيد القتل الرحيم بخلع عنق الرحم.
   2. تطهير الفراء والجلد الماوس تماما مع الإيثانول 70%.
   3. وضع الماوس على بيئة نظيفة تعمل غمد حيث يكون الماوس في موقف معرضة، مع هيندكوارتيرس، تواجه المجرب. رفع الفراء في كعب أخيل مع تلميح الملقط سيمكين بطول 13 سم ونصائح منحنى مسنن. جداً الجلد بين الملقط والكعب مع تصلب 8.5 سم مقص جيد مع نصائح مستقيمة.
   4. تمديد الشق cranially (أي من كعب على الساق والفخذ إلى منطقة الورك السفلي). إزالة الجلد وآلفرو من أطرافهم هند بمساعدة الملقط.
   5. تنفيذ نفس الإجراء على أطرافهم هند الأخرى.
   6. إزالة أطرافه هند بالقطع عن طريق مفاصل الورك المتاخمة.
   7. قص بعيداً الكفوف الخلفي. قطع طريق الركبة. تخزين في الفخذ وساق من كل أطرافهم هند معا في طبق بتري 92 ملم مليئة بالفوسفات مخزنة المحلول الملحي (PBS) على الجليد.
   8. تنظيف عظام الفخذ والساق بعناية عن طريق إزالة أنسجة العضلات قدر ممكن من كل من الفخذ والساق. نقل عظام الفخذ والساق إلى أنبوب 50 مل مليئة بالمتوسط RPMI 1640 العقيمة ومكان على الجليد الرطب حتى عظام الساق والفخذ كافة التي تم جمعها في الخطوة 1.2.7 يتم تنظيفها من أنسجة العضلات.
   9. لعزل نخاع العظام، ونقل عظم الفخذ أو الساق واحدة في وقت واحد (التي تم تنظيفها كما هو موضح في الخطوة 1.2.8) من أنبوب 50 مل إلى طبق بتري (التي يبلغ قطرها ملم 92) مليئة بالمتوسط RPMI 1640. قطع نهايات عظم الفخذ أو الساق مع مشرط للحصول على الوصول إلى تجويف العظام التي تحتوي على نخاع العظم.
   10. إعداد أنبوب جمع 50 مل مع 5 مل متوسط RPMI 1640. أدخل إبرة ز 26 يعلق على 1 مل حقنه مليئة 1 مل متوسط RPMI 1640 في تجويف العظام وتدفق نخاع العظم خارج التجويف في أنبوب جمع عن طريق دفع المكبس.
   11. كرر الخطوة 1.2.10 حتى يظهر العظم خفيفة ولامعة (أي تجويف العظام يخلو من وضوح المحمر نخاع العظام). تجاهل العظام فارغة.
   12. كرر الخطوات 1.2.9-1.2.11، باستخدام جميع عظام الفخذ والساق من الخطوة 1.2.8، وجمع جميع القطع المستردة نخاع العظام في أنبوب جمع 50 مل نفس من الخطوة 1.2.10. الحفاظ على أنبوب جمع على الجليد الرطب حتى تم تجهيز جميع العظام من الخطوة 1.2.8 تبعاً لذلك.
   13. إنشاء تعليق خلية واحدة بهدوء بيبيتينج القطع نخاع العظام متدفق، متفتت صعودا وهبوطاً. تصفية تعليق خلية واحدة نخاع العظام من خلال شاشة مش 40 ميكرومتر خلية مصفاة توضع في أنبوب جمع 50 مل جديدة.
   14. الطرد المركزي جمع 50 مل الأنبوب الذي يحتوي على تعليق خلية واحدة نخاع العظام في 450 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
   15. ريسوسبيند بيليه في 5 مل من المخزن المؤقت ACK ليسينج (يدتا مم 1 غ₂؛ 10 مم كهكو₃؛ 144 مم NH₄Cl؛ الرقم الهيدروجيني 7.2) لتحلل خلايا الدم الحمراء. احتضان تعليق خلية لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. وبعد ذلك فورا إضافة 10 مل من محلول برنامج تلفزيوني إلى تعليق خلية.
   16. الطرد المركزي من التعليق في 450 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 2 مل من محلول PBS.
   17. عد الخلايا نخاع العظام، باستخدام هيموسيتوميتير. الاحتفاظ قاسمة 6 × 10⁶ خلايا لتحليل التدفق الخلوي لفحص نقاء الخلايا بعد تنقية الخلية (راجع الخطوة 1.2.20).
   18. لاستنزاف خلايا تي من تعليق خلية واحدة نخاع العظام، استخدام أدوات تنقية خلية متوفرة تجارياً. مغناطيسيا استنفاد الخلايا CD90.2⁺ (أي الخلايا اللمفية) من خلايا نخاع العظام المجموع، يتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
   19. عد الخلايا T-خلية-نضوب نخاع العظام التي تم عزلها كما هو موضح في الخطوة 1.2.18، باستخدام هيموسيتوميتير. الاحتفاظ قاسمة 1 × 10⁶ خلايا للتدفق الخلوي التحليل التي يتعين القيام بها في وقت لاحق كما هو موضح في الخطوة 1.2.20.
       ملاحظة: خلية في المتوسط العائد المستمدة من إحدى الجهات المانحة الماوس عادة من 2 × 10⁷ 3.4 × 10⁷ تي-خلية-نضوب نخاع العظم خلايا.
   20. تأكيد استنفاد تي خلية ناجحة بالتدفق الخلوي. وصمة عار 1 × 10⁶ خلايا، الحفاظ عليه من خطوات 1.2.17 (خلايا نخاع العظام قبل فصل الخلية المغناطيسية) و 1.2.19 (خلايا T-خلية-نضوب نخاع العظام بعد فصل الخلية المغناطيسية)، مع الأضداد التالية: α-CD45.1 (A20), α-CD3 (17A2), (α-CD4 GK1.5)، و α-CD8α (53-6.7). استخدم الخلايا المتبقية من الخطوة 1.2.17 كعنصر تحكم أونستينيد وتلطيخ واحد عناصر التحكم، لإعداد cytometer التدفق.
       1. نقل 1 × 10⁶ خلايا من كل عينة إلى بئر صفيحة 96-جيدا مع V-قاع لأداء سيتوميتريك تدفق تلطيخ الداخلي.
       2. زيادة ونقصان لأسفل الخلايا ضمن لوحة 96-جيدا (الخطوة 1.2.20.1) في 450 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 100 ميليلتر من نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت (برنامج تلفزيوني وتستكمل مع 3% تصفية المصل البقري).
       3. الطرد المركزي الخلايا ضمن لوحة 96-جيدا في 450 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
       4. إضافة مبلغ مناسب للأجسام المضادة للاختيار (مقارنة مع خطوة 1.2.20) للعينات لتلطيخ واحد في 100 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية.
       5. إعداد خليط من جميع الأجسام المضادة (ميكس الرئيسي) التي تحتوي على كميات مناسبة كافية لكل على حدة وصمة عار مختبرين خلية نخاع العظم الحفاظ عليها من قبل (راجع الخطوة 1.2.17) وبعد (راجع الخطوة 1.2.19) المغناطيسي تي خلية استنزاف. إضافة 100 ميليلتر من مزيج الرئيسي إلى مختبرين على حد سواء.
       6. إضافة فقط 100 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية للعينة أونستينيد.
       7. احتضان الخلايا ضمن لوحة 96-جيدا لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية في الظلام.
       8. إضافة 100 ميليلتر من نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت والطرد المركزي الخلايا ضمن لوحة 96-جيدا في 450 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 100 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية.
       9. الطرد المركزي الخلايا في 450 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 250 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية.
       10. نقل العينات إلى أنبوب أسفل المائدة مستديرة 5 مل البوليستيرين وتحليلها مع أداة سيتوميتير تدفق التي قادرة على الكشف عن الجزيئات الفلورسنت التي كانت تستخدم لتسمية الأجسام المضادة المستخدمة لتوصيف عينات الخلايا (راجع الخطوة 1.2.20).
       11. مقارنة تكوين خلية من قبل وبعد انفصال الخلية المغناطيسية.
           ملاحظة: درجة نقاء حوالي 95% CD45.1⁺CD3^– (تي-خلية-المنضب أي نخاع العظام) الخلايا داخل البوابة يعيش عادة ما يتحقق.
   21. أغسل تعليق خلية T-خلية-نضوب نخاع العظام 2 x مع برنامج تلفزيوني الحل (450 x ز لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية)، وأخيراً، ريسوسبيند الخلايا في حل برنامج تلفزيوني، ضبط تركيز الخلية إلى 5 × 10⁷ خلايا/مل. تبقى الخلايا على الجليد الرطب حتى الحقن.
   22. حقن الخلايا T-خلية-نضوب نخاع العظام في الفئران المستفيدة، التي كانت المشع في اليوم السابق (انظر القسم 1-1).
       1. ضع الماوس تجريبية في دائرة مانعة للتسرب، والحث على التخدير بالاستنشاق لتصل إلى 4% إيسوفلوراني، حتى الفأر فاقد الوعي. تأكيد التسكين وفقدان الوعي عن طريق اختبار فقدان المعاكسة رايتينج وسحب الخسائر اللاحقة الدواسة العاكسة.
       2. ضخ 5 × 10⁶ خلايا T-خلية-نضوب نخاع العظام (أي 100 ميليلتر من 5 × 10⁷ خلايا/مل) الذي يحتوي على برنامج تلفزيوني الحل باستخدام حقنه 1 مل مزودة بإبرة ز 30 عن طريق الوريد في الفضاء خلف المقلة التي تحتوي على الجيوب الوريدية.
3. يوم 2: نقل الخلايا T
   ملاحظة: تنفيذ الإجراءات الموصوفة أدناه في غطاء زراعة الأنسجة معقمة واستخدام الكواشف التي تمت تصفيتها. استخدام CD45.2 C57Bl/6 (البرية من نوع؛ الفئران WT) كالجهات المانحة للخلايا اللوريكتيفي تي. يسمح استخدام نظم العلامة كونجينيك ديستينجويشابيليتي بين المتلقي (CD45.2⁺ H2kd⁺ بالب/ج الفئران) والجهات المانحة أنواع الخلايا المكونة للدم (خلايا نخاع العظام: CD45.1⁺ H2kb⁺ B6. سخل الفئران؛ متمكنة من خلايا تي: CD45.2⁺ H2kb⁺ C57/Bl6 الفئران).
   1. Euthanize الفئران C57Bl/6 وفقا تطبيق المبادئ التوجيهية للمؤسسات والسلطات. ولذلك، تخدير الفئران بالاستنشاق بتركيز من 5% إيسوفلوراني. تواصل التعرض isoflurane حتى 1 دقيقة بعد إلقاء القبض في التنفس وتأكيد القتل الرحيم بخلع عنق الرحم. تطهير الفراء والجلد الماوس تماما مع الإيثانول 70%.
   2. ضع مصفاة مع شاشة مش 40 ميكرومتر في أنبوب جمع 50 مل. إزالة الطحال ووضعه على المصفاة.
   3. مع المكبس المحاقن، كومينوتي الطحال في المصفاة. أغسل بمصفاة والغطاس المحاقن مع برنامج تلفزيوني لجمع جميع سبلينوسيتيس.
   4. الطرد المركزي الخلايا داخل أنبوب جمع 50 مل في 450 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
   5. ريسوسبيند في سبلينوسيتيس في 3 مل من المخزن المؤقت ليسينج ACK خلايا الدم الحمراء. احتضان تعليق خلية 3 دقيقة بعد ذلك، أضف 10 مل من برنامج تلفزيوني والطرد المركزي الخلايا في 450 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند سبلينوسيتيس في برنامج تلفزيوني.
   6. عد الخلايا الطحال، باستخدام هيموسيتوميتير. تحويل قاسمة 6 × 10⁶ خلايا تحليل التدفق الخلوي، لتقييم حجم تنقية في خطوة 1.3.9.
   7. ل CD3 إجمالي⁺ تي خلية العزلة من مجموع سبلينوسيتيس، استخدام أدوات تنقية خلية متوفرة تجارياً. عزل الخلايا T الطحال، يتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
   8. عد CD3 الطحال⁺ تي الخلايا المعزولة كما هو موضح في الخطوة 1.3.7، استخدام هيموسيتوميتير. الاحتفاظ قاسمة للخلايا⁶ ر 1 x 10 لتحليل التدفق الخلوي.
      ملاحظة: عائد على متوسط تي الطحال الخلايا الواحدة الماوس المانحة معزول بواسطة الخلية المغناطيسي الفاصل تتراوح بين 1.3 × 10⁷ إلى 2 × 10⁷ الخلايا.
   9. تأكيد نجاح عزل تي خلية بالتدفق الخلوي. للاطلاع على وصف تفصيلي للبروتوكول المصبوغة، تمنح واتبع الخطوات 1.2.20.1-1.2.20.10.
      1. وصمة عار سبلينوسيتيس⁶ 1 x 10 خطوات 1.3.6 (قبل فصل الخلية المغناطيسية) و 1.3.8 (بعد فصل الخلية المغناطيسية) مع الأضداد التالية: α-CD45.2 (104) α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) و α-CD8α (53-6.7).
      2. استخدم الخلايا المتبقية من الخطوة 1.3.6 كعنصر تحكم أونستينيد وتلطيخ واحد مع الأجسام المضادة الخاصة بكل منها، لإعداد cytometer التدفق.
      3. مقارنة تكوين خلية قبل وبعد فصل الخلية المغناطيسية.
         ملاحظة: درجة نقاء إيه ناين فايف % من CD45.2⁺CD3⁺ تي الخلايا داخل بوابة اللمفاويات الحية ينبغي أن ينجز.
   10. أغسل تي الخلايا x 2 مع برنامج تلفزيوني (450 x ز لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية)، وأخيراً، ريسوسبيند الخلايا في حل برنامج تلفزيوني، ضبط تركيز الخلية إلى 7 × 10⁶ خلايا/مل. تبقى الخلايا على الجليد حتى الحقن.
   11. حقن اللوريكتيفي، الطحال خلايا تي (راجع الخطوة 1.3.10) إلى المشع بالب/ج الفئران الذين تلقوا سابقا خلايا T-خلية-نضوب نخاع العظم CD45.1⁺ (راجع الخطوة 1.2.22).
       1. حمل التخدير عن طريق وضع الماوس تجريبية في دائرة مانعة للتسرب التي يتعرض لها لتصل إلى 4% إيسوفلوراني حتى أنه يفقد وعيه. تأكيد التسكين وفقدان الوعي عن طريق اختبار فقدان المعاكسة رايتينج وسحب الخسائر اللاحقة الدواسة العاكسة.
       2. حقن 0.7 × 10⁶ اللوريكتيفي CD3⁺ تي الخلايا باستخدام حقنه 1 مل مزودة بإبرة ز 30   (أي، 100 ميليلتر من 7 × 10⁶ خلايا/مل) يتضمن الحل برنامج تلفزيوني (راجع الخطوة 1.3.10)، عن طريق الوريد إلى خلف المقلة مساحة للفئران، للحث على GvHD. سمي هذه الفئران كمجموعة تجريبية.
       3. حقن مجموعة مختلفة من الفئران مع 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني وحدها، عن طريق الوريد في الفضاء خلف المقلة، وسمي هذه المجموعة كمجموعة مراقبة، وفي وقت لاحق دعا "لا-تي-خلية-زرع الفئران (لا)".

2-تقييم المنهجية جفهد

ملاحظة: تنفيذ هذا الإجراء في أجواء شبه عقيمة في غرفة تجريبية مرخصة ومجهزة للتعامل مع الفئران الحية داخل مرفق الحيوان.

1. اتبع مسار السريرية جفهد في الفئران الفردية؛ على وجه التحديد، تقييم ونقاط الفئران التجريبية 3 x أسبوع لوجود أعراض سريرية من GvHD، استناداً إلى نظام لتسجيل النقاط المبينة أدناه ومقتبس من نظام التهديف أنشأته سابقا كوك et al.⁶.
   1. وزن الماوس كل على حدة وتسجيل الوزن وحساب خسارة وزن الجسم ثيسبيسيفيك إشارة إلى وزن الجسم أن يتحدد قبل بدء التجربة (المقابلة إلى 100 في المائة) في اليوم 0 (الخطوة 1.1.2). نقاط الوزن أقل من 10% من وزن يبدأ مع الصف 0 وفقدان وزن بين 10% و 25% مع الصف 1، وفقدان وزن أكثر من 25% مع الصف 3.
   2. نقاط مستوى النشاط لكل الماوس، الفئران تميز بمستوى نشاط عادي (نقاط = 0) من الفئران بمستوى نشاط انخفاض معتدل (درجة = 1) والفئران مع السلوك ثابتة ما لم تكن حفز خارجياً (نقاط = 2).
   3. نقاط نسيج الفراء، وبذلك تميز الفراء الطبيعي ولامعة و kempt (نقاط = 0) من الفراء تكدرت معتدل (درجة = 1) ووجود البقع أصلع (نقاط = 2).
   4. نقاط نسيج الجلد، تميز الجلد الطبيعي (النتيجة = 0) من بقع متفرقة من تحجيم الجلد (على سبيل المثال، في الذيل والكفوف) (درجة = 1) والقياس الواضح ومناطق التهاب الجلد (نقاط = 2).
   5. تحليل اتساق البراز يفرز الكسور. نقاط البراز مع عادي (أي، الاتساق الثابت) مع الصف 0 والبراز مع البراز تشوه ولينة مع الصف 1 والبراز دون أي الاتساق، ومن ثم، مع إسهال شديد مع الصف 2.
   6. تلخيص كافة المعلمات سجل منفصل لنقاط سريرية قصوى من 12 للماوس.
2. النظر وتقييم المعايير للتوقف عن هذه التجربة بسبب مستوى خطورة المرض الحالي الماوس الفردية، وفقا لتطبيق المبادئ التوجيهية المؤسسية وأذن بروتوكول الحيوان.

3-تقييم GvHD المعوية

1. التهديف من الآفات ذات الصلة جفهد عن طريق التنظير المصغر لمنطقة المستقيم القاصي
   ملاحظة:تنفيذ ذلك في المحيطة سيميستيريلي في غرفة تجريبية مرخصة ومجهزة للتعامل مع الفئران الحية داخل مرفق الحيوان. استخدام محطة عمل مصغرة المنظار الذي تمت الموافقة على استخدام الحيوانات الصغيرة.
   1. تحضير جهاز المنظار التي تغطي التلسكوب مع (قطره 1.9 مم) ويبلغ طوله 10 سم مع غمد فحص بالمنظار. تنظيف وتعقيم المنظار مع الإيثانول والماء.
   2. التبديل على جهاز الكمبيوتر، ومصدر الضوء زينون قابل للتعديل، ووحدة الكاميرا، وتعيين التركيز بطريقة أن كائنات قريبة من العدسة تعطي صورة واضحة.
   3. قم بتوصيل مضخة الهواء غمد بالمنظار. تصور تيار الهواء، وتراجع تلميح المنظار في زجاج الكأس مليء بالماء. تنظيم مجرى الهواء عن طريق ضبط الصمام بين مضخة الهواء وغمد بالمنظار. تتكيف مع تيار هواء ثابتة، بطيئة، تنعكس ببضع تصاعدي مستمر الفقاعات.
   4. ضع ماوس في دائرة مانعة للتسرب. حمل التخدير بالاستنشاق لتصل إلى 4% إيسوفلوراني حتى الفأر فاقد الوعي. تأكيد التسكين ودولة غائبة من ردود الفعل عن طريق اختبار فقدان المعاكسة رايتينج وسحب الخسائر اللاحقة الدواسة العاكسة.
   5. استخدام جهاز تخدير بيطرية مناسبة وفقا لبروتوكول الحيوانية المستخدمة. نقل الماوس من الدائرة إلى مساحة عمل تنظير القولون. موقف الماوس أنيسثيتيزيد، مع انفها في نوسيكوني (التي يتم توصيلها إلى الصك التخدير)، على تنظيف العمل هنا، غمد حيث أن الفأر في موقف معرضة، التي تواجه المجرب مع ما هيندكوارتيرس.
   6. للحفاظ على التخدير أثناء إجراء تنظير القولون، خفض تركيز إيسوفلوراني بحوالي 2%. مراقبة التنفس واستجابة للتحفيز أثناء تنظير القولون الماوس وضبط تركيز إيسوفلوراني في المبخر إذا لزم الأمر. تغطية العينين للماوس مع مرهم لمنعهم من الحصول على الجاف.
   7. مراقبة فعالية التخدير معسر بين أصابع القدم الماوس. في الحالة تغيب مفاعليه، تابع إلى الخطوة 3.1.8.
   8. رفع الذيل تماما فوق جذر الذيل مع جهة وإدراج بعناية المنظار، المتمركزة في اليد الأخرى، عن طريق الشرج في المستقيم.
   9. وفي حين يضخم تيار الهواء التجويف القولون والمستقيم، تتحرك ببطء وبعناية المنظار إلى الأمام في اتجاه aboral.
   10. ضع المنظار في منتصف التجويف colonic والحفاظ على هذا الموقف من أجل التقليل إلى أدنى حد من الاتصال مع الجدار colonic وتجنب إجراء خدوش، أعمق الإصابات المتصلة بالجدار (مثلاً، مما أدى إلى نزيف)، أو حتى على الحائط تثقيب (راجع الخطوة 3.1.17) . التحكم بهذه الخطوة بمشاهدة دفق الفيديو (أي، بموجب التصور المستمر من حجرة colonic) بشكل دائم.
   11. إذا كان البراز انقباض الرأي، إزالتها المنظار وإجراء حقنه شرجية بالتنظيف مستقيمي مع تصل إلى 2 مل من المحلول الملحي، باستخدام ماصة باستور ناعمة. استخدم كسائل قليلاً قدر الإمكان، لمنع تمييع البراز وغيرها من الآثار الثانوية التي تؤثر سلبا على خصائص السطح المخاطي، وفي نهاية المطاف، سجل نتائج غير مقصودة.
   12. محاولة لوضع بانتظام المنظار في محددة (أي، متميزة) موقع التشريحية داخل القولون القاصي على توحيد التسجيل من التهاب colonic وتحسين إمكانية مقارنة النتائج بين الفئران وعبر التجارب وسجل.
       ملاحظة: عادة، يمكن الوصول بالمنظار جامدة، أقصى عمق 4 سم عبر الطريق المستقيم. بين 2 و 4 سم أبورالي، القولون بانتظام يتحول فليشر أنه لا يمكن تمرير مع colonoscope جامدة. استخدام منطقة القولون ديستالي المتاخمة فليشر كالتسجيل الافتراضي الموضعية.
   13. بدء تسجيل دفق الفيديو والبدء بالتسجيل من التهاب.
   14. تقييم التهاب القولون GvHD المتصلة بتسجيله المعلمات وأوضح وهو مبين في الجدول 1 و الشكل 3.
       1. تحريك المنظار في التهديف البقعة بلطف وقليلاً مرة أخرى--وإلى الأمام لتقييم معلمات مختلفة.
       2. تقييم المعلمة "الشفافية"، فضلا عن "اتساق البراز"، بتحديد المواقع المنظار في مسافة أوسع بالنسبة إلى الجدار colonic.
       3. تقييم معلمات "التفاصيل" و "الأوعية الدموية" بتحديد المواقع المنظار بالقرب من الجدار colonic. للقيام بهذه المهمة، بعناية تطبيق التوتر محسوبة جيدا للجدار colonic مع تلميح المنظار.
   15. عند انتهاء عملية التسجيل، إيقاف التسجيل.
       ملاحظة: بعد ذلك، يمكن استخدامها في مجموعة مقطع فيديو مسجل أو المستخدمة لتوليد الصور التمثيلية (أي الصور) للمعايير المقررة ميني اندوسكوبيكالي المساهمة الشاملة لالتهاب colonic.
   16. بعناية إزالة المنظار.
   17. وقف المعرض isoflurane بنقل الماوس إلى قفص منفصل الذي يتعرض إلى الهواء المحيط. الحارة الماوس مع مصباح الضوء الأحمر ومراقبة الماوس حتى يستعيد من المخدر ويستعيد وعيه الكامل.
       ملاحظة: نظراً لتضخم القولون الهواء أثناء التنظير، ستظهر منطقة البطن من الماوس ينفخ حتى بعد ذلك مباشرة. بينما هذا أمر طبيعي وذات طبيعة عابرة، علامات طويلة من التضخم الهائل وتدريجية حتى البطن وفشل استرداد الماوس قد يشير إلى غير مقصودة انثقاب القولون (في هذه الحالة، احتياجات الماوس أن euthanized فورا).
   18. بعد اكتمال شفائهم، ضع الماوس مرة أخرى إلى قفصة كل منهما.
   19. النهج الاختياري: من الممكن أيضا يأخذ خزعات الأنسجة تسترشد رأي. اتخاذ الخطوات التالية.
       ملاحظة: سيتم إجراء تنظير القولون بنفس الطريقة كما هو موضح في الخطوات 3.1.1-3.1.18، مع إدخال التعديلات التالية.
       1. في الخطوة 3.1.1، استخدم فحص بالمنظار غمد مع قناة عامل مدمج، بدلاً من غمد فحص بسيط دون قنوات العمل، لتغطي التلسكوب. إدخال ملقط خزعة في القناة العامل حتى طرفها مرئياً فقط أمام المنظار في شاشة الفيديو لأن هذا إلى حد كبير ما يمنع الإصابات غير المقصودة للامعاء.
       2. المضي قدما في خطوات 3.1.2-3.1.11. إدراج المنظار في القولون والدفع إلى الأمام بعناية إلى مكان الحادث للفائدة.
       3. تستخدم المساعدة من المجرب الثاني للمهمة لأخذ خزعات الأنسجة colonic. اسأل المجرب الثانية للتنقل غيض الملقط خزعة إلى منطقة colonic الاختيار عن طريق دفع الملقط داخل القناة العامل ببطء إلى الأمام حتى يمكن فتح فكي الملقط. استمرار مشاهدة دفق الفيديو أثناء هذا الإجراء للحد من مخاطر إصابة الجدار colonic.
       4. استرداد عينة أنسجة colonic جدار بعناية الافتتاح والاختتام فكي الملقط خزعة.
          ملاحظة: القيام بذلك بحذر لمنع ثقب الجدار colonic. في حالة نادرة من ثقب colonic، فورا التضحية الماوس المتأثرة عن طريق تطبيق المقاييس وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية وتحت الإدارة المستمر للمسكنات.
       5. التراجع وإزالة الملقط مغلقة خارج القناة العامل. إزالة العينة من بين فكي الملقط خزعة بالغمس وتهز الملقط فتحت بعناية في حل PBS العقيمة. وبعد ذلك، اختر شروط التخزين السليم لعينات الأنسجة، وفقا لتحليلات المصب المخططة. بعد تطهير مع الإيثانول 70%، إمكانية إعادة استخدامها الملقط اتخاذ مزيد من الخزعات.
       6. وبعد أخذ الخزعات، إزالتها المنظار وإنهاء تنظير القولون كما هو موضح في الخطوات 3.1.16-3.1.18.
2. تحليل نسيجية
   1. بين يومي 26 و 30 بعد التشعيع بالأشعة السينية، euthanize HCT الو الفئران المستفيدة وفقا لتطبيق المبادئ التوجيهية للمؤسسات والسلطات. ولهذا الغرض، تخدير الفئران باستنشاق إيسوفلوراني 5%. تواصل مع التعرض إيسوفلوراني لمدة 1 دقيقة بعد إلقاء القبض في التنفس وتأكيد القتل الرحيم بخلع عنق الرحم. دقة تطهير الفراء والجلد للماوس مع الإيثانول 70%.
   2. فتح تجويف البطن وإزالة القولون. أنه نقل إلى طبق بتري (التي يبلغ قطرها ملم 92) مع برنامج تلفزيوني.
   3. ملء نصيحة الصيدلي 5 مل مع برنامج تلفزيوني. بمساعدة الملقط سيمكين بطول 13 سم ونصائح منحنى مسنن، كشف الجزء الأعلى من القولون (حوالي 5 ملم) على غيض غيض موزع. عناية إصلاح القولون باستخدام الملقط في تلميح موزع ومسح القولون مع برنامج تلفزيوني بالضغط أسفل المكبس طرف موزع لإزالة البراز من الأمعاء.
   4. قطع شريحة colonic يقع حوالي 5 مم من فتحه الشرج، مع المساعدة من مشرط.
   5. إصلاح العينة مستأصل القناة الهضمية في فورمالدهايد 4.5% بين عشية وضحاها. قبل تضمينه في البارافين، وضع الأنسجة في وضع رأسي.
   6. قص 3 ميكرومتر عبر أجزاء من أنسجة القولون جزءا لا يتجزأ من البارافين ووصمة عار لهم والهيماتوكسيلين ويوزين (أنه)، تستخدم بروتوكولات قياسية المصبوغة.
   7. إعداد الملطخة بأنه المقاطع العرضية لعينات الأنسجة القولون.
   8. مقتبس من المصفوفة التهديف عنها كابلان et al.¹², هيستوباثولوجيكالي نقاط نشاط التهاب سيميكوانتيتاتيفيلي، مع عشرات من 0-3: لا التهاب (النتيجة = 0)، التهاب معتدل (درجة = 1)، معتدلة التهاب (نقاط = 2)، والتهاب حاد (نقاط = 3).
      ملاحظة: ومن الناحية المثالية، توظف لهذه المهمة إلى خبرة الطبيب الشرعي الذي هو من ذوي الخبرة في تقييم مورين جفهد المعوية وأعمى لطبيعة التجريبية ومجموعات التحكم.

النتائج

أنشئ البروتوكول الحالي، وصف التقييم بالمنظار ميني الآفات المرتبطة GvHD المعوية القولون القاصي، والتحقق من صحتها في الفئران تعرض سابقا للاستقراء المنهجي من طراز GvHD الحادة الشديدة. في هذه الدراسة، ونحن استخدام فئة MHC أنا متطابقة تماما النظام النموذجي في أي بالب/ج الفئران ك?...

Discussion

وصف البروتوكول منهجية الاستقراء والتقييم ميني المنظار من النمط الظاهري colonic لاحظ أثناء جفهد المعوية. أنه يخدم الغرض الأوسع نطاقا لتمكين العلماء لدراسة جفهد المعوية طوليا ونونينفاسيفيلي على مدى كامل من المرض (أي من بداية مظاهر colonic والتقدم حتى نشاط المرض القصوى).

ومع ذلك، هن...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator	Gamma-Service Meical GmbH
Phosphate-buffered saline (PBS )	Sigma-Aldrich Co. LLC.	D8662-6x500ML
Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips)	Fine Science Tools	11009-13
Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm)	Fine Science Tools	14090-09
RPMI-1640 Medium	Sigma-Aldrich Co. LLC.	R8758-500ML
Hypodermic needle (26 G)	B. Braun Melsungen AG	4657683
1 mL syring	B. Braun Melsungen AG	9166017V
50 mL tube	Sarstedt Ag & Co.KG	62,547,254
Cell strainer with a 40 µm mesh screen	BD Falcon	352340
Ammonium chloride (NH4Cl)	Sigma-Aldrich Co. LLC.	11209	ingredient of ACK lysing buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA)	Carl Roth GmbH & Co.KG	8043.2	ingredient of ACK lysing buffer
Potassium bicarbonate (KHCO3)	Merck KGaA	1,048,540,500	ingredient of ACK lysing buffer
CD90.2 MicroBeads, mouse	Miltenyi Biotec GmbH	130-049-101	magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells
Pan T Cell Isolation Kit II, mouse	Miltenyi Biotec GmbH	130-095-130	magnet cell separation to isolate splenic T cells
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731)	Biolegend	109822
Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645)	Biolegend	100214
FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691)	Biolegend	100406
PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168)	Biolegend	110730
APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753)	Biolegend	100714
Filtrated bovine serum	Pan Biotec	P40-47500	ingredient of FACS buffer
96-well polystyrene V-bottom plates	Greiner Bio-One	651201
Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL)	Falcon	352052
BD LSRFortessa II flow cytometer	BD Bioscience Co.
Insulin syringe with sterile interior (30 G)	BD	324826
Oxy Vet Oxymat 3	Eickemeyer		oxygen concentrator  for anesthesia
NarkoVet	Eickemeyer	213062
Plexiglass chamber	Eickemeyer	214620
Straight Forward Telescope	KARL STORZ SE &Co KG	64301 AA	part of the experimental setup for colonoscopy
Protection and Examination Sheath	KARL STORZ SE &Co KG	61029 C	part of the experimental setup for colonoscopy
Examination Sheath with working channel	KARL STORZ SE &Co KG	61029 D	part of the experimental setup for colonoscopy
Biopsy Forceps	KARL STORZ SE &Co KG	61071 ZJ	part of the experimental setup for colonoscopy
175 Watt SCB XenonLight Source	KARL STORZ SE &Co KG	20132120	part of the experimental setup for colonoscopy
Fiber Optic Light Cable	KARL STORZ SE &Co KG	495 NL	part of the experimental setup for colonoscopy
Image 1 S3 Camera Head	KARL STORZ SE &Co KG	22220030	part of the experimental setup for colonoscopy
Image 1 SCB Camera Control Unit	KARL STORZ SE &Co KG	22200020	part of the experimental setup for colonoscopy
LCD monitor	Olympus	OEV181H	part of the experimental setup for colonoscopy
Forane / Isofluran	AbbVie Inc.	B506
Formaldehyde solution 37 %	Carl Roth GmbH & Co.KG	7398.1
5.0 mL Dispenser tip	Eppendorf AG	30089456