장 이식-비교-호스트 질병 및 라이브 쥐에서 미니 내 시경 평가의 유도

요약

여기, 선물이 수용자 조 혈 줄기 세포 이식에 설명 합니다 및 원심 콜론의 반복적인 미니 내 시경 평가 존재, 특성, 그리고 라이브 내 저 승 염증의 심각도 대 한 현장에서 프로토콜 쥐 장 이식-비교-호스트 질병에서 고통.

초록

급성 이식-비교-호스트 질병 (GvHD) 가장 심각한 합병증을 환자 이전 수용자 조 혈 줄기 세포 이식 (여 보세요-HCT) 얼굴 나타내고 빈약한 임상 결과와 자주 연결 됩니다. 예를 들어, GvHD 발현 피부의 설립된 면역 진압 치료에 일반적으로 반응 및, 따라서, 복용 하지 치명적인 코스, 존재와 용기, 중간-낮은 부분 중 특히 장 GvHD의 강도 강하게 승부를 하 고 전반적으로 급성 GvHD. 치료 옵션을 가진 환자의 생존은 본질적으로 고전 면역 진압 요원 양보만 적당 한 질병 완화 효과. 따라서, 조직 상주 면역 폭포에 대 한 상세한 지식을 장 microbiota에 변화와 stromal 응답, 그리고 장 GvHD 발병 후 사전 이벤트 및 기본 메커니즘을 이해 필요가 긴급의 병 인 혁신적인 치료 옵션을 개발 하 고. GvHD의 murine 모델 식별 하 고 기능적으로 평가 하는 분자와 상 장 GvHD 운전 경로 자주 고용 된다. 그러나, 구체적으로 모니터링 하 고 시간이 지남에 장 염증 평가 수단 본질적으로 부족 때문에 평가 하 고 급성 GvHD 학년 설립된 점수는 정기적으로 오히려 조직의 GvHD를 반영 하는 다양 한 매개 변수 구성 발현입니다. 장 GvHD의 상세한 평가를 연구 함으로써 본질적으로 경도 제외 안락사 마우스를 사용 하 여 제한 되었습니다 (즉, 운동) 주어진된 실험 조건 하에서 저 승 구획의 분석 (예를 들어, 항 체 중재 proinflammatory cytokine의 봉쇄) (즉, vivo)에서 살아있는 쥐에서. 여기에 설명 된 여 보세요 HCT 취급 생쥐의 원심 결 장의 미니 내 시경 현장 평가 수 장의 염증과 b)에서 다운스트림 분석에 대 한 조직 샘플을 수집 하는 옵션의 다양 한 측면의 상세한 거시적인 평가 a)를 관측 기간 동안 다양 한 시간 포인트. 전반적으로, 미니 내 시경 접근 전 임상 비 침 투 적인 모니터링 및 평가 장 GvHD의 주요 사전 제공.

서문

조 혈 악성 직접 발생 하는 조 혈 줄기 세포 격실에서와 통제, 빠르게 진행, 그리고 심각한 면역 중재 장애는 종종 여 보세요-HCT^1,2를 수행 하는 표시. 그러나, 전조 도움이 접목 대 종양 응답의 발생에 대 한 회계, 비록 기증자 세포는 자주 유도 및 홍보 여 보세요-HCT 받는 내 건강 한 조직 구성의 원치 않는 면역 중재 공격 이식-비교-호스트 질병³이라고 하는 프로세스. 발현 용기, 소위 장 GvHD는 심각한 형태의 정기적으로 높은 사망률^1,2,4와 관련 된 급성 GvHD의 가장 무시 무시 한 합병증을 나타냅니다.

여 보세요-HCT의 전반적으로, murine 모델 식별 하 고 GvHD⁵병 기본 면역 중재 메커니즘 연구 귀중 한 도구로 떠오르고 있다. 그러나, 운동 평가, 예를 들어, 라이브 마우스 오버시 소설 치료 개입의 유익한 효과 정기적으로에 따라 임상 GvHD의 결정 점수⁶. 이러한 점수 반영 하기 위해 적당 한 동안, 예를 들어, 전체 질병 부담 (즉, 조직의 GvHD), 임상 점수 부족 감도 안정적으로 거울 기관 특정 발현을 (예:, 에). 따라서, 예를 들어 이러한 시스템을 일반적으로 점수를 기반으로 하는 특정된 치료 개입의 창 자-보호 효과 대해 결론, 짧은을.

소설 전신의 발명을 통해 주요 발전에도 불구 하 고 이미징 형식 중 발광 또는 형광 유전자 마우스 모델^7,8의 사용과 함께 직접 하 고 구체적으로 방법론 평가 장 라이브 쥐에서 GvHD의 형상 부족. 따라서, 다음 섹션에 설명 된 장 GvHD 표현 형의 내 시경 평가의 프로토콜 뒤에 근거는이 장애물을 극복 하는. 또한, 동기 부여는 또한 숫자를 줄이기 위해 실험 쥐 이후, 지금까지, 셀룰러, 형태학, 분자 특성의 상세한 평가 (예:, 분자 생물학 또는 histopathology) 장 GvHD의 징후는 궁극적으로 실험 마우스의 희생을 필요 했다.

우리의 기관 이전 syngeneic colitis 모델⁹동안 저 승 발현의 미니 내 시경 평가의 방법론에 보도 했다. 여기에 제시 된 프로토콜에서 우리 세련 하 고는 colonoscopic 적응 점수 행렬 alloreactive의 이식 시 장 GvHD와 라이브 쥐에 alloresponse 기반 colitis HCT 및 기증자 세포는 MHC 클래스에서 나 완벽 하 게 일치 하지 않는 설정 . 우리는 장 GvHD 관련 저 승 병 변을 반영 하는 적당 한 4 개의 매개 변수를 확인. 또한, 우리는 쉽게 주어진된 시간에 주어진된 마우스에 장 GvHD의 심각도 대 한 독자에 게 알리는 새로운 점수 결과 어떤 단일 결정의 미세 조정 등급 수 있는 시스템을 설립. Histopathological 분석 특정 임계값 위 내 시경 점수 중간에 높은 급료 조직 염증 예측 안정적으로 확인 했다. 따라서, 미니 내 시경 평가를 일상적으로 실험 쥐의 희생을 요구 하는 표준 histopathology 작업 대신 나타내는 나타납니다. 중요 한 것은,이 프로토콜 거의 모든 주어진된 시간 지점에서 적용 될 수 있습니다 그리고 질병^10,11의 과정에서 반복적으로 사용할 수 있습니다. 또한, 생물 발광 종속 접근의 사용, 반면 유전자 intercrossing 수정 쥐 처럼 아무 노동 강렬 하 고 시간이 많이 소요 조치가 필요 하 고, 따라서, 방법론의 거의 모든 마우스 라인에 적용 될 수 있다 관심입니다.

여 보세요-HCT 환자 심한 장 GvHD의 해로운 임상 관점을 주어 함께 찍은 빠른 과학적 진보와 기본 면역 병 인 분자 메커니즘에 더 많은 통찰력은 절실히 필요 합니다. 마찬가지로 중요 한, 윤리적인 고려 사항 요구 지식의 이득 실험 쥐의 최소한의 사용으로 달성 되어야. 따라서, 모두 장 GvHD 탐험 연구 커뮤니티에 클레임 모니터링 하 고 라이브 실험 마우스에서 장 GvHD 학년 실험 작업 체인에 콜론의 직렬 미니 내 시경 평가 구현 하 여 고급 수 인정 모델, 설명 하 고 여기에 제시 된 프로토콜에서 검증.

프로토콜

여기 설명 하는 실험 방법 Mittelfranken, 바바리아, 독일의 정부에 의해 승인 되었습니다가지고.

1. GvHD 유도

1. 하루 0: 총 몸 방사선 조사 받는 사람 마우스의
   1. 여성 CD45.2⁺ H2kd 사용 하 여⁺ BALB/c 마우스 이상 10 주 받는 사람으로 오래 되는.
   2. 무게 하 고 GvHD 유도 전에 받는 사람 마우스의 무게를 기록 합니다.
      참고: 받는 사람이 최소한의 몸 무게 20 g의 있는지 확인 하십시오. 시작 몸 무게는 GvHD 유도 및 진행의 과정을 통해 개별 마우스의 체중 감소를 계산 하는 참조 값으로 될 것입니다.
   3. X 선 irradiator의 컨테이너에 최대 5 개의 마우스를 놓습니다.
   4. 총 몸 방사선 엑스레이의 8 Gy의 단일 투여 하 여 쥐를 비추는. 방사선 소스로 Cs¹³⁷ 을 사용 합니다.
2. T-세포 고갈 골 수와 방사능된 쥐의 제 1 일: 재구성
   참고:개요 및 섹션 1.2, 상세한 수용자 골 수 세포의 이식 방사선 조사 후 24 시간 이내 일어나 야 한다. 수행 무 균 조직 문화에 아래 설명 된 절차 후드를 필터링 된 시 약을 사용 하 여. 수용자 CD45.1/Ly5.1 b 6를 사용 합니다. SJL-Ptprca Pepcb/ BoyCrl T-세포 고갈 골에 대 한 기증자로 쥐.
   1. CD45.1/Ly5.1 b 6 안락사 기관 지침, 받는 사람 BALB/c 마우스의 방사선 조사 후 12-24 h에 따라 수용자 골 수 세포를 기부 SJL 쥐 이 위해, CD45.1/Ly5.1 b 6 anesthetize. 5 %isoflurane 흡입에 의해 SJL 쥐입니다. 호흡 마비 후 isoflurane 노출을 1 분 이상 계속 하 고 자 궁 경부 전위에 의해 안락사를 확인.
   2. 모피와 70% 에탄올으로 깨끗이 마우스의 피부를 소독.
   3. 위치에 깨끗 한 마우스는 마우스 경향이 위치에는 실험을 직면 하 고 그것의 엉덩이 쪽으로 칼 집 작업. 13cm의 길이 Semken 집게의 끝 및 톱니 모양의 곡선된 팁 킬 '에서 모피를 들어올립니다. 피부는 집게와 스트레이트 팁 좋은 위를 강화 된 8.5 c m 힐 incise
   4. Cranially (즉, 더 낮은 다리 및 허벅지 엉덩이 지역에 발뒤꿈치)에서 절 개를 연장. 겸의 도움으로 뒷 다리에서 피부와 모피를 제거 합니다.
   5. 다른 뒷 다리에 동일한 절차를 수행 합니다.
   6. 인접 한 엉덩이 관절을 통해 절단 하 여 뒷 다리 사지를 제거 합니다.
   7. 멀리 뒷 발 잘라. 무릎 관절을 통해 잘라. 허벅지와 인산 염 버퍼 (PBS) 염 얼음에 가득 92 mm 페 트리 접시에 함께 모든 뒷 다리의 정강이 저장 합니다.
   8. 모든 허벅지와 정강이에서 가능한 많은 근육 조직을 제거 하 여 대 퇴 골과 경골 뼈를 신중 하 게 청소. 대 퇴 골과 경골 뼈와 가득 메 마른 RPMI 1640 매체 장소 단계 1.2.7에서에서 모든 경골 및 대 퇴 골 뼈 수집 될 때까지 젖은 얼음에 그것 근육 조직에서 청소는 50 mL 튜브에 전송 합니다.
   9. 골을 분리, 50 mL 튜브에서 (에서 설명한 단계 1.2.8으로 청소)는 한 번에 한 대 퇴 골 또는 경골 뼈를 전송 (92 m m의 직경)와 페 트리 접시 RPMI 1640 매체 가득 합니다. 대 퇴 골 또는 경골 골 수를 포함 하는 뼈의 구멍에 접근할 메스와의 끝을 잘라.
   10. RPMI 1640 매체의 5 mL 50 mL 수집 튜브를 준비 합니다. 뼈 구멍으로 RPMI 1640 매체의 1 mL로 가득 1 mL 주사기에 부착 된 26 G 바늘을 삽입 하 고 플런저를 밀어 컬렉션 튜브에 구멍에서 골을 플러시.
   11. 1.2.10 빛과 반짝이 뼈가 나타날 때까지 단계를 반복 (즉, 뼈 구멍은 가시 붉은 골 수 없는). 빈 뼈를 삭제 합니다.
   12. 단계 1.2.9-1.2.11, 단계의 1.2.8, 모든 대 퇴 골과 경골 뼈를 사용 하 여 반복 하 고 단계 1.2.10에서에서 모든 복구 된 골 조각 같은 50 mL 수집 튜브에 수집. 1.2.8 단계에서 모든 뼈를 따라 처리 된 때까지 젖은 얼음에 컬렉션 튜브를 유지.
   13. 부드럽게 아래로 얼굴이 빨 개, 부서 지기 쉬운 골 조각 pipetting으로 단일 세포 현 탁 액을 만듭니다. 새로운 50 mL 수집 튜브에 40 µ m 메쉬 화면 셀 여과기를 통해 골 수 단일 세포 현 탁 액을 필터링 합니다.
   14. 450 x g 4 ° c.에서 5 분에 골 단일 세포 현 탁 액을 포함 하는 50 mL 컬렉션 튜브 원심 폐기는 상쾌한.
   15. ACK lysing 버퍼 (1 m₂나 m EDTA, 10 m m KHCO₃, 144 m m NH₄Cl, pH 7.2) 적혈구 세포의 5 mL에 펠 릿을 resuspend. 셀 서 스 펜 션 실내 온도에 3 분 동안 품 어. 그 후, 즉시 세포 현 탁 액을 PBS 솔루션의 10 mL를 추가 합니다.
   16. 450 x g 4 ° c.에서 5 분 동안에 현 탁 액을 원심 삭제는 상쾌한 고 2 ml PBS 솔루션의 셀 resuspend.
   17. hemocytometer를 사용 하 여 골 수 세포를 계산 합니다. 6 x 10⁶ 셀 흐름 cytometry 분석 셀 정화 후 셀의 순도 확인을 위해의 약 수를 보존 (단계 1.2.20 참조).
   18. 골 수 단일 세포 현 탁 액에서 T 세포의 고갈에 대 한 상용 셀 정화 키트를 사용 합니다. 자석으로 제조 업체의 프로토콜에 따라 총 골 수 세포에서 CD90.2⁺ 셀 (즉, 림프 톨) 고갈 합니다.
   19. 단계 1.2.18는 hemocytometer를 사용 하 여에서 설명한 대로 고립 되어 있는 T-세포 고갈 골 셀을 계산 합니다. 1.2.20 단계에 설명 된 대로 나중에, 수행 흐름 cytometry 분석에 대 한 1 x 10⁶ 셀의 약 수를 유지 합니다.
       참고: 한 기증자 마우스에서 파생 된 평균에 셀 비중은 3.4 x 10⁷ T 세포 고갈 골 수 세포를 2 x 10⁷ 에서 보통입니다.
   20. Cytometry 여 성공적인 T 세포 소모를 확인 합니다. 1 x 10⁶ 세포 단계 1.2.17 (자기 세포 분리 전에 골 수 세포)와 1.2.19 (자석 세포 별거 후 T 세포 고갈 골 수 세포), 다음 항 체와 함께 단계에서 보존 얼룩: α-CD45.1 (A20), α-CD3 (17A2), α-CD4 ( GK1.5), 및 α-CD8α (53-6.7). 사용 하 여 단계 1.2.17에서에서 나머지 셀 흠 없는 컨트롤로 단일 얼룩 컨트롤 흐름 cytometer 설정.
       1. 각 샘플에서 V-바닥 얼룩 절차 흐름 cytometric를 수행 하기 위해 96 잘 접시의 1 x 10⁶ 셀을 전송.
       2. 4 ° c.에서 5 분에 대 한 g 450 x 96 잘 접시 (단계 1.2.20.1) 내의 셀 아래로 회전 삭제는 상쾌한 고 resuspend FACS 버퍼 (PBS 3% 보충 필터링 소 혈 청)의 100 µ L에 셀.
       3. 4 ° c.에서 5 분에 대 한 g 450 x 96 잘 접시 내의 셀을 원심 폐기는 상쾌한.
       4. FACS 버퍼의 100 µ L에서 단일 얼룩에 대 한 샘플을 선택 (단계 1.2.20와 비교)의 항 체의 적절 한 금액을 추가 합니다.
       5. 적절 한 금액을 별도로 사전에서 보존 하는 골 수 세포 aliquots를 얼룩에 충분 한 모든 항 체 (마스터 믹스)의 혼합물을 준비 (단계 1.2.17 참조) 후 (단계 1.2.19 참조) 자기 T 세포 소모. 두 aliquots를 마스터 믹스 100 µ L를 추가 합니다.
       6. 흠 없는 샘플에 FACS 버퍼의만 100 µ L를 추가 합니다.
       7. 어둠 속에서 4 ° C에서 20 분 동안 96 잘 접시 내의 셀을 품 어.
       8. FACS 버퍼의 100 µ L을 추가 하 고 4 ° c.에서 5 분에 대 한 g 450 x 96 잘 접시 내의 셀을 원심 삭제는 상쾌한 고 resuspend FACS 버퍼의 100 µ L에 셀.
       9. 450 x g 4 ° c.에서 5 분 동안에 세포를 원심 삭제는 상쾌한 고 resuspend FACS 버퍼의 250 µ L에 셀.
       10. 5 mL 폴리스 티 렌 라운드 하단 튜브에 샘플을 전송 하 고 (단계 1.2.20 참조) 셀 샘플을 특성화 하기 위해 고용 하는 항 체를 분류 하는 데 사용 된 형광 성 분자를 감지할 수 있다 교류 cytometer 악기와 함께 그들을 분석.
       11. 셀 구성에서 전에 그리고 자석 세포 별거 후 비교 합니다.
           참고: 약 95%의 순도 CD45.1⁺CD3^- (즉, T-세포 고갈 골) 라이브 게이트 내의 셀 일반적으로 이루어집니다.
   21. T 세포 고갈 골 세포 현 탁 액 2 세척 x PBS 솔루션 (450 x g 4 ° C에서 5 분 동안) 및, 마지막으로, 5 x 10⁷ 셀/mL로 세포 농도 조정 하는 PBS 솔루션에서 셀 resuspend. 주사까지 젖은 얼음에 셀을 계속.
   22. 했다 (참조 섹션 1.1) 전날 조사 받는 쥐로 T-세포 고갈 골 수 세포를 주사.
       1. 누출 방지 챔버에 실험 마우스를 놓고 최대 4%의 흡입으로 마 취 유도 isoflurane, 마우스 의식 될 때까지. Righting 반사의 손실을 테스트 하 여 진통 및 의식의 상실을 확인 하 고 페달의 후속 손실 철수 반사.
       2. 5 x 10⁶ T 세포 고갈 골 셀 (즉, 100 µ L의 5 x 10⁷ 셀/mL)을 주사 PBS 솔루션 30g 바늘을 갖춘 1 mL 주사기를 사용 하 여 포함 된 정 맥 정 맥 공동을 포함 retrobulbar 공간으로.
3. T 세포의 제 2 일: 전송
   참고: 메 마른 조직 문화 후드에서 아래 설명 된 절차를 수행 하 고 필터링 된 시 약을 사용 하 여. CD45.2 C57Bl/6 (야생-타입;를 사용 하 여 Alloreactive T 세포에 대 한 기증자로 WT) 마우스. Congenic 마커 시스템의 사용 허용 받는 사이 distinguishability (CD45.2⁺ H2kd⁺ Balb/c 마우스) 형식과 기증자 조 혈 모 세포 (골 수 세포: CD45.1⁺ H2kb⁺ B6. SJL 쥐; 수용자의 T 세포: CD45.2⁺ H2kb⁺ C57/Bl6 마우스).
   1. 적용에 따라 C57Bl/6 마우스를 안락사 기관 지침 및 기관. 따라서, 5 %isoflurane 농도와 흡입 하 여 쥐를 anesthetize. 호흡 마비 후 1 분까지 isoflurane 노출 계속 고 안락사 자 궁 경관 탈 구 합니다. 모피와 70% 에탄올으로 깨끗이 마우스의 피부를 소독.
   2. 50 mL 수집 튜브에 40 µ m 메쉬 스크린 여과기를 놓습니다. 비장을 제거 하 고 스 트 레에 넣습니다.
   3. 주사기 플런저와 comminute는 여과기에 비장. 여과기 및 모든 splenocytes를 수집 하는 PBS와 주사기 플런저를 씻어.
   4. 450 x g 4 ° c.에서 5 분에 50 mL 수집 관 내의 세포를 원심 폐기는 상쾌한.
   5. 붉은 혈액 세포를 lyse ACK lysing 버퍼의 3 mL에는 splenocytes를 resuspend. 3 분 후, PBS의 10 mL을 추가 하 고 450 x g 4 ° c.에서 5 분 동안에 세포를 원심 세포 현 탁 액을 품 어 삭제는 상쾌한 고 PBS에는 splenocytes를 resuspend.
   6. hemocytometer를 사용 하 여 비장 세포를 계산 합니다. 6 x 10⁶ 셀 흐름 cytometry 분석 단계 1.3.9에서에서 정화의 크기를 평가 하는 약 수 전환
   7. 총 c d 3에 대 한⁺ T-셀 상용 셀 정화 키트를 사용 하는 총 splenocytes에서 격리. 제조 업체의 프로토콜에 따라 비장 T 세포를 분리.
   8. 비장 CD3 계산⁺ T 세포 분리에 설명 된 대로 단계를 hemocytometer를 사용 하 여 1.3.7. 교류 cytometry 분석에 대 한 1 x 10⁶ T 세포의 약 수를 유지 합니다.
      참고: 비장 T의에 평균 수익률 세포 기증자 마우스에 의해 자기 세포 분리 1.3 x 10에서 격리 당 2 × 10⁷ 셀에⁷ .
   9. Cytometry 여 T-세포 격리의 성공을 확인 합니다. 얼룩 프로토콜에 대 한 자세한 설명, 부여 및 단계 1.2.20.1-1.2.20.10.
      1. 다음 항 체와 (자석 세포 별거) 후 1 x 10⁶ splenocytes 단계 (자기 세포 분리) 전에 1.3.6 1.3.8의 얼룩: α-CD45.2 (104), α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5), 및 α-CD8α (53-6.7).
      2. 교류 cytometer 설정 단계 1.3.6에서에서 나머지 셀 흠 없는 컨트롤로 및 각각 항 체와 단일 얼룩 사용 합니다.
      3. 셀 구성 자석 세포 별거 전후를 비교 합니다.
         참고: 한 순도 ≥95 %CD45.2⁺CD3의⁺ T 림프 구 라이브 게이트 내의 셀을 달성 한다.
   10. 워시는 T 세포를 PBS로 2 배 (450 x g 4 ° C에서 5 분 동안) 및, 마지막으로, 7 x 10⁶ 셀/mL로 세포 농도 조정 하는 PBS 솔루션에서 셀 resuspend. 주사까지 얼음에 셀을 계속.
   11. Alloreactive, 비장 T 세포 (단계 1.3.10 참조) CD45.1⁺ T-세포 고갈 골 수 세포 (단계 1.2.22 참조) 이전 받은 비친된 BALB/c 마우스에 주사.
       1. 최대 4 %isoflurane의 식을 잃는 때까지 노출 되는 누출 방지 챔버에 실험 마우스를 배치 하 여 마 취를 유도. Righting 반사의 손실을 테스트 하 여 진통 및 의식의 상실을 확인 하 고 페달의 후속 손실 철수 반사.
       2. 0.7 x 10⁶ alloreactive CD3⁺ T 주사 30g 바늘을 갖춘 1 mL 주사기를 사용 하 여 셀   (즉, 7 x 10⁶ 셀/mL의 100 µ L) PBS 솔루션을 포함 하 (단계 1.3.10 참조)는 retrobulbar에 정 맥 유도 GvHD. 생쥐의 공간 실험 그룹으로이 마우스를 명명.
       3. 쥐의 다른 그룹, PBS의 100 µ L retrobulbar 공간으로 정 맥 주입 그리고 이후 라는 컨트롤 그룹으로이 그룹을 명명 "아니오-T-세포-이식 마우스 (안)".

2입니다. 조직의 GvHD의 평가

참고: 라이센스 및 동물 시설 내 라이브 마우스를 처리 하기 위한 장비는 실험 룸에 준 무 균 주변에서이 절차를 수행 합니다.

1. 개별 쥐; GvHD의 임상 과정을 따라 특히, 평가 하 고 점수를 아래 설명과 쿡 외.⁶이전 설립 득점 시스템에서 적응 점수 시스템에 따라 임상 GvHD 증상의 존재에 대 한 주 x 실험 쥐 3.
   1. 개별적으로 각 마우스 무게, 무게를 기록 하 고 계산 하는 날 0 (1.1.2 단계) (100% 해당) 실험의 시작 이전에 결정 했다 몸 무게에 관하여 thespecific 몸 체중 감소. 점수 등급 0, 10%와 25%, 1 학년 사이 체중 감소와 3 학년 이상 25%의 체중 감소는 시작 체중의 10%의 체중 감소.
   2. 각 마우스, 정상적인 활동 수준으로 차별 쥐의 활동 수준을 점수 (점수 = 0) 쥐 활동을 알맞게 감소 수준에서 (점수 = 1) 및 마우스 고정 동작 하지 않는 한 그들은 외부 자극 (점수 = 2).
   3. 그로 인하여 차별 일반, 빛나는, 그리고 현대적인 모피 모피 텍스처 점수 (점수 = 0) 적당히 뻗 치고 모피에서 (점수 = 1)와 대머리 반점의 존재 (점수 = 2).
   4. 피부 질감, 정상적인 피부를 차별 점수 (점수 = 0) (예를 들어, 꼬리와 발)에서 피부 스케일링의 산발적 인 관광 명소에서 (점수 = 1) 분명 한 스케일링 고 아픈 피부 영역 (점수 = 2).
   5. 분 비의 자 분수의 일관성 분석. 학년 0와 일반 (즉, 하드 일관성)와 자, 1, 학년으로 변형 하 고 부드러운 대변으로의 자 및 어떤 일관성 없이 그리고, 따라서, 급료 2와 심한 설사와 대변 점수.
   6. 모든 별도로 득점된 매개 변수 마우스 당 12의 최대 임상 점수를 정리해.
2. 고려 하 고는 현재 질병의 심각도 수준 적용 기관 지침에 따라 개별 마우스 때문에 실험을 중단의 기준을 평가 하 고 동물 프로토콜 승인.

3입니다. 장 GvHD의 평가

1. 원심 장 지역의 미니 내 시경에 의해 GvHD 관련 장애의 점수
   참고:라이센스 및 동물 시설 내 라이브 마우스를 처리 하기 위한 장비는 실험 룸에 semisterile 주변에 이것을 수행 합니다. 작은 동물의 사용을 위해 승인 되는 미니 내 시경 워크스테이션을 사용 합니다.
   1. 내 시경 검사 칼 집과 (1.9 m m의 직경)와 10 cm의 길이 망원경을 취재 하 여 내 시경 장치를 준비 합니다. 깨끗 하 고 물과 에탄올으로 내 시경 소독.
   2. 컴퓨터, 조정 가능한 크 세 논 광원 및 카메라 모듈에 전환 하 고 렌즈에 가까이 있는 객체 깨끗 한 이미지를 주는 방식으로 포커스를 설정 합니다.
   3. 내 시경 칼 집에 공기 펌프를 연결 합니다. 공기 흐름을 시각화 하는 내 시경의 끝 물으로 채워진 비 커 유리에 찍어. 공기 펌프와 내 시경 칼 집 사이의 밸브를 조정 하 여 공기 흐름을 조절 합니다. 몇 가지 지속적으로 오름차순으로 반영, 지속적인 공기 흐름을 조정 거품.
   4. 누출 방지 챔버에 마우스를 놓습니다. 최대 4%의 흡입으로 마 취 유도 isoflurane 마우스 의식 될 때까지. Righting 반사의 손실을 테스트 하 여 진통 및 반사의 부재 상태를 확인 하 고 페달의 후속 손실 철수 반사.
   5. 사용 하는 동물 프로토콜에 따라 적절 한 수의학 마 취 기계를 사용 합니다. 상공에서 시경 작업 영역 마우스를 전송. 여기 위치는 nosecone (이 마 취 악기에 연결 되어), 깨끗 한에 있는 그것의 코를 가진 마 취 마우스는 마우스 경향이 위치에 그것의 엉덩이 쪽으로 실험을 직면 하 고 칼 집 작업.
   6. 시경 절차 동안 마 취를 유지 하려면 isoflurane 농도를 약 2%를 줄입니다. 마우스의 호흡과는 시경 중 자극에 응답을 모니터링 하 고 필요한 경우는 기화 기에서 isoflurane 농도 조정. 마우스의 건조에서 그들을 방지 하기 위해 연 고와 함께 눈을 커버.
   7. 마우스의 발가락 사이 곤란 하 게 하 여 마 취의 효능을 제어 합니다. 반응성에 결 석의 경우, 3.1.8 단계를 진행 합니다.
   8. 한 손으로 꼬리 루트 바로 위에 꼬리를 들어올리고 조심 스럽게 항문에는 항문을 통해, 다른 한편에서 내 시경을 삽입 합니다.
   9. 동안 공기 흐름 웃 대 장 루멘, 천천히 그리고 주의깊게 이동 앞으로 내 시경 aboral 방향에서.
   10. 저 승 루멘 가운데 내 시경을 배치 하 고 저 승 벽과의 접촉을 최소화 고 흠집, 깊은 벽 관련 부상 만드는 방지 하려면이 위치를 유지 (예를 들어, 결과 출혈), 또는 심지어 벽에 구멍 뚫 기 (단계 3.1.17 참조) . 영구적으로 비디오 스트림 (즉, 아래 저 승 구획의 지속적인 시각화)를 보고 하 여이 단계를 제어 합니다.
   11. 대변 보기 수축, 내 시경을 제거 하 고 rectally 부드러운 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 염 분의 최대 2 mL와 함께 홍 조 하 여 관장을 수행. 최대한 작은 액체도 배설물 및 기타 보조 효과 점 막 표면 및, 궁극적으로, 채 점 결과의 특성 저하의 의도 하지 않은 희석을 사용 합니다.
   12. 정기적으로 내 시경에는 정의 된 위치를 보십시오 (예:, 별개) 원심 결 장 염증의 점수를 표준화 하 고 쥐과 실험을 통해 결과 득점의 comparability를 최적화 하기 위해 내 해부학 사이트.
       참고: 일반적으로, 경직 된 내 시경으로 4 cm의 최대 깊이 직장 경로 통해 도달할 수 있습니다. 2, 4 cm 사이 aborally, 콜론 정기적으로 버린다 엄밀한 colonoscope로 전달 될 수 없는 굴곡. 사용 하 여 콜론 지역 distally 자리 기본 득점으로 굴곡에 인접 한.
   13. 비디오 스트림을 기록 하 고 염증의 점수와 함께 시작을 시작 합니다.
   14. 콜론의 GvHD 관련 염증 매개 변수 설명 및 표 1 및 그림 3에 표시 된 채 점 하 여 평가 합니다.
       1. 부드럽게 자리 점수 및 약간 다시-내 시경 이동 하 고 다른 매개 변수를 평가 하기 위해 앞으로.
       2. 저 승 벽에 관하여 더 넓은 거리에는 내 시경을 배치 하 여 "대변 일관성" 뿐 아니라 "반투명" 매개 변수를 평가 합니다.
       3. 매개 변수 "단위"와 "vascularity" 저 승 벽에 가까운 근접에서 내 시경을 배치 하 여 평가 합니다. 이 작업에 대 한 내 시경의 끝에와 함께 저 승 벽에 약을 잘 복용 긴장 신중 하 게 적용 됩니다.
   15. 완료 되 면 채 점 과정, 녹음을 중지 합니다.
       참고: 그 후, 기록 된 비디오 클립 총에서 사용 수 또는 장 염증에 기여 하는 전반적인 미니 라고 평가 기준의 대표 이미지 (즉, 스크린샷)를 생성 하는 데 사용.
   16. 조심 스럽게 내 시경 제거.
   17. 주변 공기에 노출 되는 별도 케이지를 마우스를 옮겨서 isoflurane 박람회를 중단 합니다. 레드-라이트 램프와 마우스를 따뜻하게 하 고 마 취에서 회복 하 고 완전 한 의식 회복 될 때까지 마우스를 관찰.
       참고: 때문에 공기는 내 시경 중 콜론의 인플레이션, 마우스의 복 부 지역 직접 나중까지 부풀어 나타날 수 있습니다. 이 정상 및 과도 자연의, 복 부의 대규모 고도 진보적인 인플레이션 및 마우스의 복구의 실패의 장기간된 표시 (이 경우, 안락사 될 필요가 있는 마우스에에서 콜론의 의도 하지 않은 천공을 나타낼 수 있습니다. 즉시).
   18. 완전 한 복구 시 각각의 케이지에 다시 마우스를 놓습니다.
   19. 선택적 접근: 그것은 또한 보기 기반 조직 생 검 가능. 다음 단계를 수행.
       참고: 시경 단계 3.1.1-3.1.18 다음 수정에서 설명한 대로 동일한 방식으로 수행 됩니다.
       1. 3.1.1 단계에서 작업 채널 없이 간단한 검사 칼 집 대신 내장 작업 채널 내 시경 검사 칼을 사용 하 여 망원경을 취재. 팁 비디오 화면에 내 시경에 앞에서 그냥 볼 수 때까지이 크게 소장에 의도 하지 않은 부상 방지 때문에 생 겸 작업 채널에 소개.
       2. 3.1.11 3.1.2-단계를 진행 합니다. 콜론과 밀어 신중 하 게 앞으로 관심의 자리에 내 시경을 삽입 합니다.
       3. 저 승 조직 biopsies의 작업에 대 한 두 번째 실험의 도움을 사용 합니다. 게 집게 작업 채널 내 밀어 천천히 앞으로 집게의 턱을 열 수 있습니다 때까지 선택의 저 승 지역에 생 겸의 팁을 탐색 하는 두 번째 실험. 끊임없이 저 승 벽을 상처의 위험을 최소화 하기 위해이 절차 동안 비디오 스트림 시계.
       4. 신중 하 게 열고 닫는 생 겸의 문 턱에서 저 승 벽 조직 샘플을 복구 합니다.
          참고: 이렇게 저 승 벽의 구멍 뚫 기를 방지 하기 위해 주의. 저 승 구멍 뚫 기의 드문 경우에, 즉시 측정 기관 지침에 따라 마 취약의 지속적인 관리를 적용 하 여 영향을 받는 마우스를 희생.
       5. 철수 하 고 작업 채널에서 닫힌된 집게를 제거 합니다. 찍기 신중 하 게 살 균 PBS 솔루션에서 열린된 집게를 흔들어 하 여 표본 생 겸의 문 턱에서 제거 합니다. 그 후, 계획 된 다운스트림 분석에 따라 조직 샘플에 대 한 적절 한 보관 조건을 선택 합니다. 70% 에탄올으로 소독, 후는 집게 추가 biopsies을 다시 사용할 수 있습니다.
       6. 생 검 후, 내 시경을 제거 하 고 시경 3.1.18 3.1.16-단계에서 설명한 대로 완료 합니다.
2. Histopathological 분석
   1. 일 26 x 선 방사선 조사 후 30 일 사이 기관 지침 및 기관 적용에 따라 여 보세요-HCT 받는 사람 마우스를 안락사. 이 위해 5 %isoflurane 흡입에 의해 쥐를 anesthetize. 호흡 마비 후 1 분 동안 isoflurane 노출 계속 하 고 자 궁 경부 전위에 의해 안락사를 확인. 모피와 70% 에탄올과 마우스의 피부 소독 철저 하 게.
   2. 복 부 구멍 열고 콜론을 제거 합니다. PBS 가진 (92 m m의 직경)와 페 트리 접시에 그것을 전송.
   3. 5 mL 디스펜서 팁을 PBS 채우십시오. 와 길이가 13 cm와 톱니 모양의 곡선된 팁, 슬립 디스펜서 팁의 끝에 콜론 (약 5 m m)의 원심 부분 Semken 집게의 도움. 조심 스럽게 디스펜서 끝에 집게와 콜론을 해결 하 고 소장에서 배설물을 제거 하는 디스펜서 팁의 플런저를 눌러 PBS와 콜론을 플러시.
   4. 메스의 도움으로 항문에서 약 5 m m 위치한 저 승 세그먼트를 잘라.
   5. 밤새 4.5% 포름알데히드에 절제 직감 견본 수정. 파라핀에 그것을 포함 하기 전에 조직 수직 위치에 놓습니다.
   6. 컷 3 µ m 콜론 파라핀 끼워 넣어진 조직 단면도 교차 하 고 표준 얼룩 프로토콜을 사용 하 여 hematoxylin와 오신 (그는), 그들을 얼룩.
   7. 그 스테인드 콜론 조직 샘플의 크로스 섹션을 준비 합니다.
   8. 0-3에서 점수와 염증 활동을 semiquantitatively, 점수 histopathologically 점수 행렬 카 플 란 외.¹²에 의해 보고에서 적응: 없음 염증 (점수 = 0), 가벼운 염증 (점수 = 1), 중간 염증 (점수 = 2), 그리고 심한 염증 (점수 = 3).
      참고: 이상적으로,이 작업에 대 한 누가 murine 장 GvHD의 평가 경험과 실험의 특성 및 제어 그룹에 눈 멀게 하는 병리학의 전문 지식을 사용 합니다.

결과

변의 장 GvHD 관련 원심 콜론의 미니 내 시경 평가 설명 하는 현재 프로토콜 설립 이었고 심한 급성 GvHD 모델의 조직 유도 이전 대상이 쥐에. 이 연구에서는 사용 하는 완전히 모델 시스템 어떤 BALB/c에서 마우스 했다 치명적 반구, T-세포 고갈 수용자 골 수 이식에 의해와^{GvHD 유도 alloreactive C57BL/6 c d 3의 행정에 의해 일치 하지 않는 MHC 클래스 +} T 림프 톨. T-세포 고갈 골...

토론

프로토콜 유도의 방법론과 장 GvHD 동안 관찰 장 형의 미니 내 시경 평가 설명 합니다. 그것은 전체 질병 과정 (즉, 저 승 표현과 최대한 질병 활동까지 진행의 발병)에서 경도 noninvasively 장 GvHD을 공부 하는 과학자의 광범위 한 용도로 사용 됩니다.

그러나, 있다 몇 가지 중요 한 단계와 중요 한 한계는 실험 각각 과학적인 문맥에 기술을 적용 하기 전에 알고 있어야 필요가 제시 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator	Gamma-Service Meical GmbH
Phosphate-buffered saline (PBS )	Sigma-Aldrich Co. LLC.	D8662-6x500ML
Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips)	Fine Science Tools	11009-13
Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm)	Fine Science Tools	14090-09
RPMI-1640 Medium	Sigma-Aldrich Co. LLC.	R8758-500ML
Hypodermic needle (26 G)	B. Braun Melsungen AG	4657683
1 mL syring	B. Braun Melsungen AG	9166017V
50 mL tube	Sarstedt Ag & Co.KG	62,547,254
Cell strainer with a 40 µm mesh screen	BD Falcon	352340
Ammonium chloride (NH4Cl)	Sigma-Aldrich Co. LLC.	11209	ingredient of ACK lysing buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA)	Carl Roth GmbH & Co.KG	8043.2	ingredient of ACK lysing buffer
Potassium bicarbonate (KHCO3)	Merck KGaA	1,048,540,500	ingredient of ACK lysing buffer
CD90.2 MicroBeads, mouse	Miltenyi Biotec GmbH	130-049-101	magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells
Pan T Cell Isolation Kit II, mouse	Miltenyi Biotec GmbH	130-095-130	magnet cell separation to isolate splenic T cells
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731)	Biolegend	109822
Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645)	Biolegend	100214
FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691)	Biolegend	100406
PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168)	Biolegend	110730
APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753)	Biolegend	100714
Filtrated bovine serum	Pan Biotec	P40-47500	ingredient of FACS buffer
96-well polystyrene V-bottom plates	Greiner Bio-One	651201
Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL)	Falcon	352052
BD LSRFortessa II flow cytometer	BD Bioscience Co.
Insulin syringe with sterile interior (30 G)	BD	324826
Oxy Vet Oxymat 3	Eickemeyer		oxygen concentrator  for anesthesia
NarkoVet	Eickemeyer	213062
Plexiglass chamber	Eickemeyer	214620
Straight Forward Telescope	KARL STORZ SE &Co KG	64301 AA	part of the experimental setup for colonoscopy
Protection and Examination Sheath	KARL STORZ SE &Co KG	61029 C	part of the experimental setup for colonoscopy
Examination Sheath with working channel	KARL STORZ SE &Co KG	61029 D	part of the experimental setup for colonoscopy
Biopsy Forceps	KARL STORZ SE &Co KG	61071 ZJ	part of the experimental setup for colonoscopy
175 Watt SCB XenonLight Source	KARL STORZ SE &Co KG	20132120	part of the experimental setup for colonoscopy
Fiber Optic Light Cable	KARL STORZ SE &Co KG	495 NL	part of the experimental setup for colonoscopy
Image 1 S3 Camera Head	KARL STORZ SE &Co KG	22220030	part of the experimental setup for colonoscopy
Image 1 SCB Camera Control Unit	KARL STORZ SE &Co KG	22200020	part of the experimental setup for colonoscopy
LCD monitor	Olympus	OEV181H	part of the experimental setup for colonoscopy
Forane / Isofluran	AbbVie Inc.	B506
Formaldehyde solution 37 %	Carl Roth GmbH & Co.KG	7398.1
5.0 mL Dispenser tip	Eppendorf AG	30089456