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요약

여기, 선물이 수용자 조 혈 줄기 세포 이식에 설명 합니다 및 원심 콜론의 반복적인 미니 내 시경 평가 존재, 특성, 그리고 라이브 내 저 승 염증의 심각도 대 한 현장에서 프로토콜 쥐 장 이식-비교-호스트 질병에서 고통.

초록

급성 이식-비교-호스트 질병 (GvHD) 가장 심각한 합병증을 환자 이전 수용자 조 혈 줄기 세포 이식 (여 보세요-HCT) 얼굴 나타내고 빈약한 임상 결과와 자주 연결 됩니다. 예를 들어, GvHD 발현 피부의 설립된 면역 진압 치료에 일반적으로 반응 및, 따라서, 복용 하지 치명적인 코스, 존재와 용기, 중간-낮은 부분 중 특히 장 GvHD의 강도 강하게 승부를 하 고 전반적으로 급성 GvHD. 치료 옵션을 가진 환자의 생존은 본질적으로 고전 면역 진압 요원 양보만 적당 한 질병 완화 효과. 따라서, 조직 상주 면역 폭포에 대 한 상세한 지식을 장 microbiota에 변화와 stromal 응답, 그리고 장 GvHD 발병 후 사전 이벤트 및 기본 메커니즘을 이해 필요가 긴급의 병 인 혁신적인 치료 옵션을 개발 하 고. GvHD의 murine 모델 식별 하 고 기능적으로 평가 하는 분자와 상 장 GvHD 운전 경로 자주 고용 된다. 그러나, 구체적으로 모니터링 하 고 시간이 지남에 장 염증 평가 수단 본질적으로 부족 때문에 평가 하 고 급성 GvHD 학년 설립된 점수는 정기적으로 오히려 조직의 GvHD를 반영 하는 다양 한 매개 변수 구성 발현입니다. 장 GvHD의 상세한 평가를 연구 함으로써 본질적으로 경도 제외 안락사 마우스를 사용 하 여 제한 되었습니다 (즉, 운동) 주어진된 실험 조건 하에서 저 승 구획의 분석 (예를 들어, 항 체 중재 proinflammatory cytokine의 봉쇄) (즉, vivo)에서 살아있는 쥐에서. 여기에 설명 된 여 보세요 HCT 취급 생쥐의 원심 결 장의 미니 내 시경 현장 평가 수 장의 염증과 b)에서 다운스트림 분석에 대 한 조직 샘플을 수집 하는 옵션의 다양 한 측면의 상세한 거시적인 평가 a)를 관측 기간 동안 다양 한 시간 포인트. 전반적으로, 미니 내 시경 접근 전 임상 비 침 투 적인 모니터링 및 평가 장 GvHD의 주요 사전 제공.

서문

조 혈 악성 직접 발생 하는 조 혈 줄기 세포 격실에서와 통제, 빠르게 진행, 그리고 심각한 면역 중재 장애는 종종 여 보세요-HCT1,2를 수행 하는 표시. 그러나, 전조 도움이 접목 대 종양 응답의 발생에 대 한 회계, 비록 기증자 세포는 자주 유도 및 홍보 여 보세요-HCT 받는 내 건강 한 조직 구성의 원치 않는 면역 중재 공격 이식-비교-호스트 질병3이라고 하는 프로세스. 발현 용기, 소위 장 GvHD는 심각한 형태의 정기적으로 높은 사망률1,2,4와 관련 된 급성 GvHD의 가장 무시 무시 한 합병증을 나타냅니다.

여 보세요-HCT의 전반적으로, murine 모델 식별 하 고 GvHD5병 기본 면역 중재 메커니즘 연구 귀중 한 도구로 떠오르고 있다. 그러나, 운동 평가, 예를 들어, 라이브 마우스 오버시 소설 치료 개입의 유익한 효과 정기적으로에 따라 임상 GvHD의 결정 점수6. 이러한 점수 반영 하기 위해 적당 한 동안, 예를 들어, 전체 질병 부담 (즉, 조직의 GvHD), 임상 점수 부족 감도 안정적으로 거울 기관 특정 발현을 (예:, 에). 따라서, 예를 들어 이러한 시스템을 일반적으로 점수를 기반으로 하는 특정된 치료 개입의 창 자-보호 효과 대해 결론, 짧은을.

소설 전신의 발명을 통해 주요 발전에도 불구 하 고 이미징 형식 중 발광 또는 형광 유전자 마우스 모델7,8의 사용과 함께 직접 하 고 구체적으로 방법론 평가 장 라이브 쥐에서 GvHD의 형상 부족. 따라서, 다음 섹션에 설명 된 장 GvHD 표현 형의 내 시경 평가의 프로토콜 뒤에 근거는이 장애물을 극복 하는. 또한, 동기 부여는 또한 숫자를 줄이기 위해 실험 쥐 이후, 지금까지, 셀룰러, 형태학, 분자 특성의 상세한 평가 (예:, 분자 생물학 또는 histopathology) 장 GvHD의 징후는 궁극적으로 실험 마우스의 희생을 필요 했다.

우리의 기관 이전 syngeneic colitis 모델9동안 저 승 발현의 미니 내 시경 평가의 방법론에 보도 했다. 여기에 제시 된 프로토콜에서 우리 세련 하 고는 colonoscopic 적응 점수 행렬 alloreactive의 이식 시 장 GvHD와 라이브 쥐에 alloresponse 기반 colitis HCT 및 기증자 세포는 MHC 클래스에서 나 완벽 하 게 일치 하지 않는 설정 . 우리는 장 GvHD 관련 저 승 병 변을 반영 하는 적당 한 4 개의 매개 변수를 확인. 또한, 우리는 쉽게 주어진된 시간에 주어진된 마우스에 장 GvHD의 심각도 대 한 독자에 게 알리는 새로운 점수 결과 어떤 단일 결정의 미세 조정 등급 수 있는 시스템을 설립. Histopathological 분석 특정 임계값 위 내 시경 점수 중간에 높은 급료 조직 염증 예측 안정적으로 확인 했다. 따라서, 미니 내 시경 평가를 일상적으로 실험 쥐의 희생을 요구 하는 표준 histopathology 작업 대신 나타내는 나타납니다. 중요 한 것은,이 프로토콜 거의 모든 주어진된 시간 지점에서 적용 될 수 있습니다 그리고 질병10,11의 과정에서 반복적으로 사용할 수 있습니다. 또한, 생물 발광 종속 접근의 사용, 반면 유전자 intercrossing 수정 쥐 처럼 아무 노동 강렬 하 고 시간이 많이 소요 조치가 필요 하 고, 따라서, 방법론의 거의 모든 마우스 라인에 적용 될 수 있다 관심입니다.

여 보세요-HCT 환자 심한 장 GvHD의 해로운 임상 관점을 주어 함께 찍은 빠른 과학적 진보와 기본 면역 병 인 분자 메커니즘에 더 많은 통찰력은 절실히 필요 합니다. 마찬가지로 중요 한, 윤리적인 고려 사항 요구 지식의 이득 실험 쥐의 최소한의 사용으로 달성 되어야. 따라서, 모두 장 GvHD 탐험 연구 커뮤니티에 클레임 모니터링 하 고 라이브 실험 마우스에서 장 GvHD 학년 실험 작업 체인에 콜론의 직렬 미니 내 시경 평가 구현 하 여 고급 수 인정 모델, 설명 하 고 여기에 제시 된 프로토콜에서 검증.

프로토콜

여기 설명 하는 실험 방법 Mittelfranken, 바바리아, 독일의 정부에 의해 승인 되었습니다가지고.

1. GvHD 유도

  1. 하루 0: 총 몸 방사선 조사 받는 사람 마우스의
    1. 여성 CD45.2+ H2kd 사용 하 여+ BALB/c 마우스 이상 10 주 받는 사람으로 오래 되는.
    2. 무게 하 고 GvHD 유도 전에 받는 사람 마우스의 무게를 기록 합니다.
      참고: 받는 사람이 최소한의 몸 무게 20 g의 있는지 확인 하십시오. 시작 몸 무게는 GvHD 유도 및 진행의 과정을 통해 개별 마우스의 체중 감소를 계산 하는 참조 값으로 될 것입니다.
    3. X 선 irradiator의 컨테이너에 최대 5 개의 마우스를 놓습니다.
    4. 총 몸 방사선 엑스레이의 8 Gy의 단일 투여 하 여 쥐를 비추는. 방사선 소스로 Cs137 을 사용 합니다.
  2. T-세포 고갈 골 수와 방사능된 쥐의 제 1 일: 재구성
    참고:개요 및 섹션 1.2, 상세한 수용자 골 수 세포의 이식 방사선 조사 후 24 시간 이내 일어나 야 한다. 수행 무 균 조직 문화에 아래 설명 된 절차 후드를 필터링 된 시 약을 사용 하 여. 수용자 CD45.1/Ly5.1 b 6를 사용 합니다. SJL-Ptprca Pepcb/ BoyCrl T-세포 고갈 골에 대 한 기증자로 쥐.
    1. CD45.1/Ly5.1 b 6 안락사 기관 지침, 받는 사람 BALB/c 마우스의 방사선 조사 후 12-24 h에 따라 수용자 골 수 세포를 기부 SJL 쥐 이 위해, CD45.1/Ly5.1 b 6 anesthetize. 5 %isoflurane 흡입에 의해 SJL 쥐입니다. 호흡 마비 후 isoflurane 노출을 1 분 이상 계속 하 고 자 궁 경부 전위에 의해 안락사를 확인.
    2. 모피와 70% 에탄올으로 깨끗이 마우스의 피부를 소독.
    3. 위치에 깨끗 한 마우스는 마우스 경향이 위치에는 실험을 직면 하 고 그것의 엉덩이 쪽으로 칼 집 작업. 13cm의 길이 Semken 집게의 끝 및 톱니 모양의 곡선된 팁 킬 '에서 모피를 들어올립니다. 피부는 집게와 스트레이트 팁 좋은 위를 강화 된 8.5 c m 힐 incise
    4. Cranially (즉, 더 낮은 다리 및 허벅지 엉덩이 지역에 발뒤꿈치)에서 절 개를 연장. 겸의 도움으로 뒷 다리에서 피부와 모피를 제거 합니다.
    5. 다른 뒷 다리에 동일한 절차를 수행 합니다.
    6. 인접 한 엉덩이 관절을 통해 절단 하 여 뒷 다리 사지를 제거 합니다.
    7. 멀리 뒷 발 잘라. 무릎 관절을 통해 잘라. 허벅지와 인산 염 버퍼 (PBS) 염 얼음에 가득 92 mm 페 트리 접시에 함께 모든 뒷 다리의 정강이 저장 합니다.
    8. 모든 허벅지와 정강이에서 가능한 많은 근육 조직을 제거 하 여 대 퇴 골과 경골 뼈를 신중 하 게 청소. 대 퇴 골과 경골 뼈와 가득 메 마른 RPMI 1640 매체 장소 단계 1.2.7에서에서 모든 경골 및 대 퇴 골 뼈 수집 될 때까지 젖은 얼음에 그것 근육 조직에서 청소는 50 mL 튜브에 전송 합니다.
    9. 골을 분리, 50 mL 튜브에서 (에서 설명한 단계 1.2.8으로 청소)는 한 번에 한 대 퇴 골 또는 경골 뼈를 전송 (92 m m의 직경)와 페 트리 접시 RPMI 1640 매체 가득 합니다. 대 퇴 골 또는 경골 골 수를 포함 하는 뼈의 구멍에 접근할 메스와의 끝을 잘라.
    10. RPMI 1640 매체의 5 mL 50 mL 수집 튜브를 준비 합니다. 뼈 구멍으로 RPMI 1640 매체의 1 mL로 가득 1 mL 주사기에 부착 된 26 G 바늘을 삽입 하 고 플런저를 밀어 컬렉션 튜브에 구멍에서 골을 플러시.
    11. 1.2.10 빛과 반짝이 뼈가 나타날 때까지 단계를 반복 (즉, 뼈 구멍은 가시 붉은 골 수 없는). 빈 뼈를 삭제 합니다.
    12. 단계 1.2.9-1.2.11, 단계의 1.2.8, 모든 대 퇴 골과 경골 뼈를 사용 하 여 반복 하 고 단계 1.2.10에서에서 모든 복구 된 골 조각 같은 50 mL 수집 튜브에 수집. 1.2.8 단계에서 모든 뼈를 따라 처리 된 때까지 젖은 얼음에 컬렉션 튜브를 유지.
    13. 부드럽게 아래로 얼굴이 빨 개, 부서 지기 쉬운 골 조각 pipetting으로 단일 세포 현 탁 액을 만듭니다. 새로운 50 mL 수집 튜브에 40 µ m 메쉬 화면 셀 여과기를 통해 골 수 단일 세포 현 탁 액을 필터링 합니다.
    14. 450 x g 4 ° c.에서 5 분에 골 단일 세포 현 탁 액을 포함 하는 50 mL 컬렉션 튜브 원심 폐기는 상쾌한.
    15. ACK lysing 버퍼 (1 m2나 m EDTA, 10 m m KHCO3, 144 m m NH4Cl, pH 7.2) 적혈구 세포의 5 mL에 펠 릿을 resuspend. 셀 서 스 펜 션 실내 온도에 3 분 동안 품 어. 그 후, 즉시 세포 현 탁 액을 PBS 솔루션의 10 mL를 추가 합니다.
    16. 450 x g 4 ° c.에서 5 분 동안에 현 탁 액을 원심 삭제는 상쾌한 고 2 ml PBS 솔루션의 셀 resuspend.
    17. hemocytometer를 사용 하 여 골 수 세포를 계산 합니다. 6 x 106 셀 흐름 cytometry 분석 셀 정화 후 셀의 순도 확인을 위해의 약 수를 보존 (단계 1.2.20 참조).
    18. 골 수 단일 세포 현 탁 액에서 T 세포의 고갈에 대 한 상용 셀 정화 키트를 사용 합니다. 자석으로 제조 업체의 프로토콜에 따라 총 골 수 세포에서 CD90.2+ 셀 (즉, 림프 톨) 고갈 합니다.
    19. 단계 1.2.18는 hemocytometer를 사용 하 여에서 설명한 대로 고립 되어 있는 T-세포 고갈 골 셀을 계산 합니다. 1.2.20 단계에 설명 된 대로 나중에, 수행 흐름 cytometry 분석에 대 한 1 x 106 셀의 약 수를 유지 합니다.
      참고: 한 기증자 마우스에서 파생 된 평균에 셀 비중은 3.4 x 107 T 세포 고갈 골 수 세포를 2 x 107 에서 보통입니다.
    20. Cytometry 여 성공적인 T 세포 소모를 확인 합니다. 1 x 106 세포 단계 1.2.17 (자기 세포 분리 전에 골 수 세포)와 1.2.19 (자석 세포 별거 후 T 세포 고갈 골 수 세포), 다음 항 체와 함께 단계에서 보존 얼룩: α-CD45.1 (A20), α-CD3 (17A2), α-CD4 ( GK1.5), 및 α-CD8α (53-6.7). 사용 하 여 단계 1.2.17에서에서 나머지 셀 흠 없는 컨트롤로 단일 얼룩 컨트롤 흐름 cytometer 설정.
      1. 각 샘플에서 V-바닥 얼룩 절차 흐름 cytometric를 수행 하기 위해 96 잘 접시의 1 x 106 셀을 전송.
      2. 4 ° c.에서 5 분에 대 한 g 450 x 96 잘 접시 (단계 1.2.20.1) 내의 셀 아래로 회전 삭제는 상쾌한 고 resuspend FACS 버퍼 (PBS 3% 보충 필터링 소 혈 청)의 100 µ L에 셀.
      3. 4 ° c.에서 5 분에 대 한 g 450 x 96 잘 접시 내의 셀을 원심 폐기는 상쾌한.
      4. FACS 버퍼의 100 µ L에서 단일 얼룩에 대 한 샘플을 선택 (단계 1.2.20와 비교)의 항 체의 적절 한 금액을 추가 합니다.
      5. 적절 한 금액을 별도로 사전에서 보존 하는 골 수 세포 aliquots를 얼룩에 충분 한 모든 항 체 (마스터 믹스)의 혼합물을 준비 (단계 1.2.17 참조) 후 (단계 1.2.19 참조) 자기 T 세포 소모. 두 aliquots를 마스터 믹스 100 µ L를 추가 합니다.
      6. 흠 없는 샘플에 FACS 버퍼의만 100 µ L를 추가 합니다.
      7. 어둠 속에서 4 ° C에서 20 분 동안 96 잘 접시 내의 셀을 품 어.
      8. FACS 버퍼의 100 µ L을 추가 하 고 4 ° c.에서 5 분에 대 한 g 450 x 96 잘 접시 내의 셀을 원심 삭제는 상쾌한 고 resuspend FACS 버퍼의 100 µ L에 셀.
      9. 450 x g 4 ° c.에서 5 분 동안에 세포를 원심 삭제는 상쾌한 고 resuspend FACS 버퍼의 250 µ L에 셀.
      10. 5 mL 폴리스 티 렌 라운드 하단 튜브에 샘플을 전송 하 고 (단계 1.2.20 참조) 셀 샘플을 특성화 하기 위해 고용 하는 항 체를 분류 하는 데 사용 된 형광 성 분자를 감지할 수 있다 교류 cytometer 악기와 함께 그들을 분석.
      11. 셀 구성에서 전에 그리고 자석 세포 별거 후 비교 합니다.
        참고: 약 95%의 순도 CD45.1+CD3- (즉, T-세포 고갈 골) 라이브 게이트 내의 셀 일반적으로 이루어집니다.
    21. T 세포 고갈 골 세포 현 탁 액 2 세척 x PBS 솔루션 (450 x g 4 ° C에서 5 분 동안) 및, 마지막으로, 5 x 107 셀/mL로 세포 농도 조정 하는 PBS 솔루션에서 셀 resuspend. 주사까지 젖은 얼음에 셀을 계속.
    22. 했다 (참조 섹션 1.1) 전날 조사 받는 쥐로 T-세포 고갈 골 수 세포를 주사.
      1. 누출 방지 챔버에 실험 마우스를 놓고 최대 4%의 흡입으로 마 취 유도 isoflurane, 마우스 의식 될 때까지. Righting 반사의 손실을 테스트 하 여 진통 및 의식의 상실을 확인 하 고 페달의 후속 손실 철수 반사.
      2. 5 x 106 T 세포 고갈 골 셀 (즉, 100 µ L의 5 x 107 셀/mL)을 주사 PBS 솔루션 30g 바늘을 갖춘 1 mL 주사기를 사용 하 여 포함 된 정 맥 정 맥 공동을 포함 retrobulbar 공간으로.
  3. T 세포의 제 2 일: 전송
    참고: 메 마른 조직 문화 후드에서 아래 설명 된 절차를 수행 하 고 필터링 된 시 약을 사용 하 여. CD45.2 C57Bl/6 (야생-타입;를 사용 하 여 Alloreactive T 세포에 대 한 기증자로 WT) 마우스. Congenic 마커 시스템의 사용 허용 받는 사이 distinguishability (CD45.2+ H2kd+ Balb/c 마우스) 형식과 기증자 조 혈 모 세포 (골 수 세포: CD45.1+ H2kb+ B6. SJL 쥐; 수용자의 T 세포: CD45.2+ H2kb+ C57/Bl6 마우스).
    1. 적용에 따라 C57Bl/6 마우스를 안락사 기관 지침 및 기관. 따라서, 5 %isoflurane 농도와 흡입 하 여 쥐를 anesthetize. 호흡 마비 후 1 분까지 isoflurane 노출 계속 고 안락사 자 궁 경관 탈 구 합니다. 모피와 70% 에탄올으로 깨끗이 마우스의 피부를 소독.
    2. 50 mL 수집 튜브에 40 µ m 메쉬 스크린 여과기를 놓습니다. 비장을 제거 하 고 스 트 레에 넣습니다.
    3. 주사기 플런저와 comminute는 여과기에 비장. 여과기 및 모든 splenocytes를 수집 하는 PBS와 주사기 플런저를 씻어.
    4. 450 x g 4 ° c.에서 5 분에 50 mL 수집 관 내의 세포를 원심 폐기는 상쾌한.
    5. 붉은 혈액 세포를 lyse ACK lysing 버퍼의 3 mL에는 splenocytes를 resuspend. 3 분 후, PBS의 10 mL을 추가 하 고 450 x g 4 ° c.에서 5 분 동안에 세포를 원심 세포 현 탁 액을 품 어 삭제는 상쾌한 고 PBS에는 splenocytes를 resuspend.
    6. hemocytometer를 사용 하 여 비장 세포를 계산 합니다. 6 x 106 셀 흐름 cytometry 분석 단계 1.3.9에서에서 정화의 크기를 평가 하는 약 수 전환
    7. 총 c d 3에 대 한+ T-셀 상용 셀 정화 키트를 사용 하는 총 splenocytes에서 격리. 제조 업체의 프로토콜에 따라 비장 T 세포를 분리.
    8. 비장 CD3 계산+ T 세포 분리에 설명 된 대로 단계를 hemocytometer를 사용 하 여 1.3.7. 교류 cytometry 분석에 대 한 1 x 106 T 세포의 약 수를 유지 합니다.
      참고: 비장 T의에 평균 수익률 세포 기증자 마우스에 의해 자기 세포 분리 1.3 x 10에서 격리 당 2 × 107 셀에7 .
    9. Cytometry 여 T-세포 격리의 성공을 확인 합니다. 얼룩 프로토콜에 대 한 자세한 설명, 부여 및 단계 1.2.20.1-1.2.20.10.
      1. 다음 항 체와 (자석 세포 별거) 후 1 x 106 splenocytes 단계 (자기 세포 분리) 전에 1.3.6 1.3.8의 얼룩: α-CD45.2 (104), α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5), 및 α-CD8α (53-6.7).
      2. 교류 cytometer 설정 단계 1.3.6에서에서 나머지 셀 흠 없는 컨트롤로 및 각각 항 체와 단일 얼룩 사용 합니다.
      3. 셀 구성 자석 세포 별거 전후를 비교 합니다.
        참고: 한 순도 ≥95 %CD45.2+CD3의+ T 림프 구 라이브 게이트 내의 셀을 달성 한다.
    10. 워시는 T 세포를 PBS로 2 배 (450 x g 4 ° C에서 5 분 동안) 및, 마지막으로, 7 x 106 셀/mL로 세포 농도 조정 하는 PBS 솔루션에서 셀 resuspend. 주사까지 얼음에 셀을 계속.
    11. Alloreactive, 비장 T 세포 (단계 1.3.10 참조) CD45.1+ T-세포 고갈 골 수 세포 (단계 1.2.22 참조) 이전 받은 비친된 BALB/c 마우스에 주사.
      1. 최대 4 %isoflurane의 식을 잃는 때까지 노출 되는 누출 방지 챔버에 실험 마우스를 배치 하 여 마 취를 유도. Righting 반사의 손실을 테스트 하 여 진통 및 의식의 상실을 확인 하 고 페달의 후속 손실 철수 반사.
      2. 0.7 x 106 alloreactive CD3+ T 주사 30g 바늘을 갖춘 1 mL 주사기를 사용 하 여 셀   (, 7 x 106 셀/mL의 100 µ L) PBS 솔루션을 포함 하 (단계 1.3.10 참조)는 retrobulbar에 정 맥 유도 GvHD. 생쥐의 공간 실험 그룹으로이 마우스를 명명.
      3. 쥐의 다른 그룹, PBS의 100 µ L retrobulbar 공간으로 정 맥 주입 그리고 이후 라는 컨트롤 그룹으로이 그룹을 명명 "아니오-T-세포-이식 마우스 (안)".

2입니다. 조직의 GvHD의 평가

참고: 라이센스 및 동물 시설 내 라이브 마우스를 처리 하기 위한 장비는 실험 룸에 준 무 균 주변에서이 절차를 수행 합니다.

  1. 개별 쥐; GvHD의 임상 과정을 따라 특히, 평가 하 고 점수를 아래 설명과 쿡 외.6이전 설립 득점 시스템에서 적응 점수 시스템에 따라 임상 GvHD 증상의 존재에 대 한 주 x 실험 쥐 3.
    1. 개별적으로 각 마우스 무게, 무게를 기록 하 고 계산 하는 날 0 (1.1.2 단계) (100% 해당) 실험의 시작 이전에 결정 했다 몸 무게에 관하여 thespecific 몸 체중 감소. 점수 등급 0, 10%와 25%, 1 학년 사이 체중 감소와 3 학년 이상 25%의 체중 감소는 시작 체중의 10%의 체중 감소.
    2. 각 마우스, 정상적인 활동 수준으로 차별 쥐의 활동 수준을 점수 (점수 = 0) 쥐 활동을 알맞게 감소 수준에서 (점수 = 1) 및 마우스 고정 동작 하지 않는 한 그들은 외부 자극 (점수 = 2).
    3. 그로 인하여 차별 일반, 빛나는, 그리고 현대적인 모피 모피 텍스처 점수 (점수 = 0) 적당히 뻗 치고 모피에서 (점수 = 1)와 대머리 반점의 존재 (점수 = 2).
    4. 피부 질감, 정상적인 피부를 차별 점수 (점수 = 0) (예를 들어, 꼬리와 발)에서 피부 스케일링의 산발적 인 관광 명소에서 (점수 = 1) 분명 한 스케일링 고 아픈 피부 영역 (점수 = 2).
    5. 분 비의 자 분수의 일관성 분석. 학년 0와 일반 (, 하드 일관성)와 자, 1, 학년으로 변형 하 고 부드러운 대변으로의 자 및 어떤 일관성 없이 그리고, 따라서, 급료 2와 심한 설사와 대변 점수.
    6. 모든 별도로 득점된 매개 변수 마우스 당 12의 최대 임상 점수를 정리해.
  2. 고려 하 고는 현재 질병의 심각도 수준 적용 기관 지침에 따라 개별 마우스 때문에 실험을 중단의 기준을 평가 하 고 동물 프로토콜 승인.

3입니다. 장 GvHD의 평가

  1. 원심 장 지역의 미니 내 시경에 의해 GvHD 관련 장애의 점수
    참고:라이센스 및 동물 시설 내 라이브 마우스를 처리 하기 위한 장비는 실험 룸에 semisterile 주변에 이것을 수행 합니다. 작은 동물의 사용을 위해 승인 되는 미니 내 시경 워크스테이션을 사용 합니다.
    1. 내 시경 검사 칼 집과 (1.9 m m의 직경)와 10 cm의 길이 망원경을 취재 하 여 내 시경 장치를 준비 합니다. 깨끗 하 고 물과 에탄올으로 내 시경 소독.
    2. 컴퓨터, 조정 가능한 크 세 논 광원 및 카메라 모듈에 전환 하 고 렌즈에 가까이 있는 객체 깨끗 한 이미지를 주는 방식으로 포커스를 설정 합니다.
    3. 내 시경 칼 집에 공기 펌프를 연결 합니다. 공기 흐름을 시각화 하는 내 시경의 끝 물으로 채워진 비 커 유리에 찍어. 공기 펌프와 내 시경 칼 집 사이의 밸브를 조정 하 여 공기 흐름을 조절 합니다. 몇 가지 지속적으로 오름차순으로 반영, 지속적인 공기 흐름을 조정 거품.
    4. 누출 방지 챔버에 마우스를 놓습니다. 최대 4%의 흡입으로 마 취 유도 isoflurane 마우스 의식 될 때까지. Righting 반사의 손실을 테스트 하 여 진통 및 반사의 부재 상태를 확인 하 고 페달의 후속 손실 철수 반사.
    5. 사용 하는 동물 프로토콜에 따라 적절 한 수의학 마 취 기계를 사용 합니다. 상공에서 시경 작업 영역 마우스를 전송. 여기 위치는 nosecone (이 마 취 악기에 연결 되어), 깨끗 한에 있는 그것의 코를 가진 마 취 마우스는 마우스 경향이 위치에 그것의 엉덩이 쪽으로 실험을 직면 하 고 칼 집 작업.
    6. 시경 절차 동안 마 취를 유지 하려면 isoflurane 농도를 약 2%를 줄입니다. 마우스의 호흡과는 시경 중 자극에 응답을 모니터링 하 고 필요한 경우는 기화 기에서 isoflurane 농도 조정. 마우스의 건조에서 그들을 방지 하기 위해 연 고와 함께 눈을 커버.
    7. 마우스의 발가락 사이 곤란 하 게 하 여 마 취의 효능을 제어 합니다. 반응성에 결 석의 경우, 3.1.8 단계를 진행 합니다.
    8. 한 손으로 꼬리 루트 바로 위에 꼬리를 들어올리고 조심 스럽게 항문에는 항문을 통해, 다른 한편에서 내 시경을 삽입 합니다.
    9. 동안 공기 흐름 웃 대 장 루멘, 천천히 그리고 주의깊게 이동 앞으로 내 시경 aboral 방향에서.
    10. 저 승 루멘 가운데 내 시경을 배치 하 고 저 승 벽과의 접촉을 최소화 고 흠집, 깊은 벽 관련 부상 만드는 방지 하려면이 위치를 유지 (예를 들어, 결과 출혈), 또는 심지어 벽에 구멍 뚫 기 (단계 3.1.17 참조) . 영구적으로 비디오 스트림 (즉, 아래 저 승 구획의 지속적인 시각화)를 보고 하 여이 단계를 제어 합니다.
    11. 대변 보기 수축, 내 시경을 제거 하 고 rectally 부드러운 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 염 분의 최대 2 mL와 함께 홍 조 하 여 관장을 수행. 최대한 작은 액체도 배설물 및 기타 보조 효과 점 막 표면 및, 궁극적으로, 채 점 결과의 특성 저하의 의도 하지 않은 희석을 사용 합니다.
    12. 정기적으로 내 시경에는 정의 된 위치를 보십시오 (예:, 별개) 원심 결 장 염증의 점수를 표준화 하 고 쥐과 실험을 통해 결과 득점의 comparability를 최적화 하기 위해 내 해부학 사이트.
      참고: 일반적으로, 경직 된 내 시경으로 4 cm의 최대 깊이 직장 경로 통해 도달할 수 있습니다. 2, 4 cm 사이 aborally, 콜론 정기적으로 버린다 엄밀한 colonoscope로 전달 될 수 없는 굴곡. 사용 하 여 콜론 지역 distally 자리 기본 득점으로 굴곡에 인접 한.
    13. 비디오 스트림을 기록 하 고 염증의 점수와 함께 시작을 시작 합니다.
    14. 콜론의 GvHD 관련 염증 매개 변수 설명 및 표 1그림 3에 표시 된 채 점 하 여 평가 합니다.
      1. 부드럽게 자리 점수 및 약간 다시-내 시경 이동 하 고 다른 매개 변수를 평가 하기 위해 앞으로.
      2. 저 승 벽에 관하여 더 넓은 거리에는 내 시경을 배치 하 여 "대변 일관성" 뿐 아니라 "반투명" 매개 변수를 평가 합니다.
      3. 매개 변수 "단위"와 "vascularity" 저 승 벽에 가까운 근접에서 내 시경을 배치 하 여 평가 합니다. 이 작업에 대 한 내 시경의 끝에와 함께 저 승 벽에 약을 잘 복용 긴장 신중 하 게 적용 됩니다.
    15. 완료 되 면 채 점 과정, 녹음을 중지 합니다.
      참고: 그 후, 기록 된 비디오 클립 총에서 사용 수 또는 장 염증에 기여 하는 전반적인 미니 라고 평가 기준의 대표 이미지 (즉, 스크린샷)를 생성 하는 데 사용.
    16. 조심 스럽게 내 시경 제거.
    17. 주변 공기에 노출 되는 별도 케이지를 마우스를 옮겨서 isoflurane 박람회를 중단 합니다. 레드-라이트 램프와 마우스를 따뜻하게 하 고 마 취에서 회복 하 고 완전 한 의식 회복 될 때까지 마우스를 관찰.
      참고: 때문에 공기는 내 시경 중 콜론의 인플레이션, 마우스의 복 부 지역 직접 나중까지 부풀어 나타날 수 있습니다. 이 정상 및 과도 자연의, 복 부의 대규모 고도 진보적인 인플레이션 및 마우스의 복구의 실패의 장기간된 표시 (이 경우, 안락사 될 필요가 있는 마우스에에서 콜론의 의도 하지 않은 천공을 나타낼 수 있습니다. 즉시).
    18. 완전 한 복구 시 각각의 케이지에 다시 마우스를 놓습니다.
    19. 선택적 접근: 그것은 또한 보기 기반 조직 생 검 가능. 다음 단계를 수행.
      참고: 시경 단계 3.1.1-3.1.18 다음 수정에서 설명한 대로 동일한 방식으로 수행 됩니다.
      1. 3.1.1 단계에서 작업 채널 없이 간단한 검사 칼 집 대신 내장 작업 채널 내 시경 검사 칼을 사용 하 여 망원경을 취재. 팁 비디오 화면에 내 시경에 앞에서 그냥 볼 수 때까지이 크게 소장에 의도 하지 않은 부상 방지 때문에 생 겸 작업 채널에 소개.
      2. 3.1.11 3.1.2-단계를 진행 합니다. 콜론과 밀어 신중 하 게 앞으로 관심의 자리에 내 시경을 삽입 합니다.
      3. 저 승 조직 biopsies의 작업에 대 한 두 번째 실험의 도움을 사용 합니다. 게 집게 작업 채널 내 밀어 천천히 앞으로 집게의 턱을 열 수 있습니다 때까지 선택의 저 승 지역에 생 겸의 팁을 탐색 하는 두 번째 실험. 끊임없이 저 승 벽을 상처의 위험을 최소화 하기 위해이 절차 동안 비디오 스트림 시계.
      4. 신중 하 게 열고 닫는 생 겸의 문 턱에서 저 승 벽 조직 샘플을 복구 합니다.
        참고: 이렇게 저 승 벽의 구멍 뚫 기를 방지 하기 위해 주의. 저 승 구멍 뚫 기의 드문 경우에, 즉시 측정 기관 지침에 따라 마 취약의 지속적인 관리를 적용 하 여 영향을 받는 마우스를 희생.
      5. 철수 하 고 작업 채널에서 닫힌된 집게를 제거 합니다. 찍기 신중 하 게 살 균 PBS 솔루션에서 열린된 집게를 흔들어 하 여 표본 생 겸의 문 턱에서 제거 합니다. 그 후, 계획 된 다운스트림 분석에 따라 조직 샘플에 대 한 적절 한 보관 조건을 선택 합니다. 70% 에탄올으로 소독, 후는 집게 추가 biopsies을 다시 사용할 수 있습니다.
      6. 생 검 후, 내 시경을 제거 하 고 시경 3.1.18 3.1.16-단계에서 설명한 대로 완료 합니다.
  2. Histopathological 분석
    1. 일 26 x 선 방사선 조사 후 30 일 사이 기관 지침 및 기관 적용에 따라 여 보세요-HCT 받는 사람 마우스를 안락사. 이 위해 5 %isoflurane 흡입에 의해 쥐를 anesthetize. 호흡 마비 후 1 분 동안 isoflurane 노출 계속 하 고 자 궁 경부 전위에 의해 안락사를 확인. 모피와 70% 에탄올과 마우스의 피부 소독 철저 하 게.
    2. 복 부 구멍 열고 콜론을 제거 합니다. PBS 가진 (92 m m의 직경)와 페 트리 접시에 그것을 전송.
    3. 5 mL 디스펜서 팁을 PBS 채우십시오. 와 길이가 13 cm와 톱니 모양의 곡선된 팁, 슬립 디스펜서 팁의 끝에 콜론 (약 5 m m)의 원심 부분 Semken 집게의 도움. 조심 스럽게 디스펜서 끝에 집게와 콜론을 해결 하 고 소장에서 배설물을 제거 하는 디스펜서 팁의 플런저를 눌러 PBS와 콜론을 플러시.
    4. 메스의 도움으로 항문에서 약 5 m m 위치한 저 승 세그먼트를 잘라.
    5. 밤새 4.5% 포름알데히드에 절제 직감 견본 수정. 파라핀에 그것을 포함 하기 전에 조직 수직 위치에 놓습니다.
    6. 컷 3 µ m 콜론 파라핀 끼워 넣어진 조직 단면도 교차 하 고 표준 얼룩 프로토콜을 사용 하 여 hematoxylin와 오신 (그는), 그들을 얼룩.
    7. 그 스테인드 콜론 조직 샘플의 크로스 섹션을 준비 합니다.
    8. 0-3에서 점수와 염증 활동을 semiquantitatively, 점수 histopathologically 점수 행렬 카 플 란 외.12에 의해 보고에서 적응: 없음 염증 (점수 = 0), 가벼운 염증 (점수 = 1), 중간 염증 (점수 = 2), 그리고 심한 염증 (점수 = 3).
      참고: 이상적으로,이 작업에 대 한 누가 murine 장 GvHD의 평가 경험과 실험의 특성 및 제어 그룹에 눈 멀게 하는 병리학의 전문 지식을 사용 합니다.

결과

변의 장 GvHD 관련 원심 콜론의 미니 내 시경 평가 설명 하는 현재 프로토콜 설립 이었고 심한 급성 GvHD 모델의 조직 유도 이전 대상이 쥐에. 이 연구에서는 사용 하는 완전히 모델 시스템 어떤 BALB/c에서 마우스 했다 치명적 반구, T-세포 고갈 수용자 골 수 이식에 의해와GvHD 유도 alloreactive C57BL/6 c d 3의 행정에 의해 일치 하지 않는 MHC 클래스 + T 림프 톨. T-세포 고갈 골...

토론

프로토콜 유도의 방법론과 장 GvHD 동안 관찰 장 형의 미니 내 시경 평가 설명 합니다. 그것은 전체 질병 과정 (즉, 저 승 표현과 최대한 질병 활동까지 진행의 발병)에서 경도 noninvasively 장 GvHD을 공부 하는 과학자의 광범위 한 용도로 사용 됩니다.

그러나, 있다 몇 가지 중요 한 단계와 중요 한 한계는 실험 각각 과학적인 문맥에 기술을 적용 하기 전에 알고 있어야 필요가 제시 ?...

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

이 연구는 공동 연구 센터 (CRC) 221 (CRC/TR221-DFG, #324392634; 프로젝트 B03) (정) 하 고 (정)을 CRC 1181 (CRC-DFG, 프로젝트 B05)에 의해 지원 되었다, 모두 도이치 가운데 (DFG, 독일 연구 재단)에 의해 자금.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
BIOBEAM 2000 Gamma IrradiatorGamma-Service Meical GmbH
Phosphate-buffered saline (PBS )Sigma-Aldrich Co. LLC.D8662-6x500ML
Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips)Fine Science Tools11009-13
Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm)Fine Science Tools14090-09
RPMI-1640 MediumSigma-Aldrich Co. LLC.R8758-500ML 
Hypodermic needle (26 G)B. Braun Melsungen AG4657683
1 mL syringB. Braun Melsungen AG9166017V
50 mL tubeSarstedt Ag & Co.KG62,547,254
Cell strainer with a 40 µm mesh screenBD Falcon352340
Ammonium chloride (NH4Cl)Sigma-Aldrich Co. LLC.11209ingredient of ACK lysing buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA)Carl Roth GmbH & Co.KG8043.2ingredient of ACK lysing buffer
Potassium bicarbonate (KHCO3)Merck KGaA1,048,540,500ingredient of ACK lysing buffer
CD90.2 MicroBeads, mouseMiltenyi Biotec GmbH130-049-101magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells
Pan T Cell Isolation Kit II, mouseMiltenyi Biotec GmbH130-095-130magnet cell separation to isolate splenic T cells
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731)Biolegend109822
Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645)Biolegend100214
FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691)Biolegend100406
PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168)Biolegend110730
APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753)Biolegend100714
Filtrated bovine serum Pan BiotecP40-47500ingredient of FACS buffer 
96-well polystyrene V-bottom platesGreiner Bio-One651201
Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL)Falcon352052
BD LSRFortessa II flow cytometerBD Bioscience Co.
Insulin syringe with sterile interior (30 G)BD324826
Oxy Vet Oxymat 3Eickemeyeroxygen concentrator  for anesthesia
NarkoVet Eickemeyer213062
Plexiglass chamber Eickemeyer214620
Straight Forward TelescopeKARL STORZ SE &Co KG64301 AApart of the experimental setup for colonoscopy
Protection and Examination SheathKARL STORZ SE &Co KG61029 Cpart of the experimental setup for colonoscopy
Examination Sheath with working channelKARL STORZ SE &Co KG61029 Dpart of the experimental setup for colonoscopy
Biopsy ForcepsKARL STORZ SE &Co KG61071 ZJ part of the experimental setup for colonoscopy
 175 Watt SCB XenonLight SourceKARL STORZ SE &Co KG20132120part of the experimental setup for colonoscopy
Fiber Optic Light CableKARL STORZ SE &Co KG495 NLpart of the experimental setup for colonoscopy
Image 1 S3 Camera HeadKARL STORZ SE &Co KG22220030part of the experimental setup for colonoscopy
Image 1 SCB Camera Control UnitKARL STORZ SE &Co KG22200020part of the experimental setup for colonoscopy
LCD monitorOlympusOEV181Hpart of the experimental setup for colonoscopy
Forane / IsofluranAbbVie Inc. B506
Formaldehyde solution 37 %Carl Roth GmbH & Co.KG7398.1
5.0 mL Dispenser tip Eppendorf AG30089456

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