Индукция кишечного трансплантата – versus – хост заболевания и его мини эндоскопическая оценки в живых мышей

Резюме

Здесь мы представляем протокол, который описывает трансплантация аллогенных гемопоэтических стволовых клеток и позволяет повторяющихся мини эндоскопическая оценок дистальной части толстой кишки на месте для присутствия, характеристики и тяжесть воспаления кишечника в живой мышей, страдающих болезнью кишечного трансплантата – versus – хост.

Аннотация

Острый трансплантат – versus – хост болезни (GvHD) представляет самое тяжелое осложнение что пациентов, перенесших ранее аллогенной гемопоэтических стволовых клеток трансплантации (Алло HCT) лица и часто ассоциируется с плохой клинических исходов. Хотя, например, проявления GvHD кожи обычно отвечают установленным иммунной супрессивной терапии и следовательно, не принимают роковой конечно, присутствие и интенсивность кишечных GvHD, особенно из середины к нижней части кишки, сильно влияют на результаты и общей выживаемости больных с острой GvHD. терапевтические возможности ограничиваются по существу классический подавляющих иммунную агентов, уступая только умеренной болезни смягчения эффектов. Следовательно, детальное знание о ткани резидентов иммунной Каскад, изменения в кишечную микрофлору, и стромальных ответ до, после и после кишечные заболевания GvHD срочно необходимы для понимания событий и лежащих в основе механизмов ее Патогенез и разрабатывать инновационные терапевтические возможности. Мышиных моделях GvHD часто используются для выявления и функционально оценки молекул и путей, предположительно вождения кишечных GvHD. Однако по существу отсутствуют средства специально контролировать и оценивать кишечного воспаления с течением времени с установленным баллов для оценки и класс острой GvHD обычно состоят из различных параметров, которые скорее отражают системного GvHD проявления. Подробной оценки кишечных GvHD был ограничен для исследования с использованием Усыпленных мышей, тем самым по существу за исключением продольной (т.е. кинетические) анализ толстой отсека под условие данного экспериментального (например, антитела опосредованной блокада провоспалительного цитокина) в живых мышей (то есть, в естественных условиях). Мини эндоскопическая на месте оценки дистальной части толстой кишки Лечение Алло HCT мышей, описанные здесь позволяет) подробную макроскопических оценку различных аспектов кишечного воспаления и b) параметр для сбора образцов ткани для вниз по течению анализов на различные моменты времени в течение периода наблюдения. В целом мини эндоскопическая подход обеспечивает крупный шаг вперед в доклинической неинвазивного мониторинга и оценки кишечных GvHD.

Введение

Кроветворная злокачественных опухолей, непосредственно вытекающие из отсека гемопоэтических стволовых клеток и неконтролируемым, быстро прогрессирует и серьезные расстройства иммунной системы зачастую указания для выполнения Алло HCT^1,2. Однако хотя приходится появление прогностические выгодно реакции трансплантат против опухоли, лимфоцитов доноров часто вызывая и содействие нежелательные иммунной системы нападения здоровых тканей компонентов в рамках Алло HCT получателя , процесс, который называется трансплантат – versus – хост болезни³. Проявления в кишечнике, так называемой кишечной GvHD, представляют собой наиболее ужасной осложнением острого GvHD, тяжелые формы, которые обычно связаны с высокой смертности^1,2,4.

В целом, мышиных моделях Алло HCT появились как неоценимое значение для выявления и изучения иммунной опосредованного механизмов, лежащих в основе патогенеза GvHD⁵. Однако, кинетической оценки, например, благотворное влияние роман терапевтических вмешательств в живых мышей со временем обычно основывается на определение клинической GvHD счеты⁶. Хотя эти оценки подходят для отражения, например, общего бремени болезней (например, системного GvHD), клинической оценки отсутствие чувствительность к надежно зеркало органоспецифические проявления (например, в кишечнике). Следовательно выводы, например в том, что касается кишки защитные эффекты данной терапевтического вмешательства, которые основаны на этих скоринговых систем обычно не отвечают.

Несмотря на крупные достижения через изобретение Роман всего тела imaging условия в сочетании с использованием либо мыши генетических биолюминесцентных или флуоресцентные модели^7,8, методологии непосредственно и конкретно оценить кишечные проявления GvHD в живых мышей хватает. Таким образом протокол эндоскопических оценки кишечных GvHD фенотип, описанные в следующем разделе объясняется преодолеть это препятствие. Кроме того, для уменьшения числа экспериментальных мышей с, пока что, подробную оценку сотовой, морфологические и молекулярные характеристики является мотивация (например, , гистопатология или молекулярной биологии) из кишечника GvHD проявление в конечном итоге требуется жертву экспериментально мыши.

Наше учреждение ранее сообщал о методологии мини эндоскопическая оценки кишечных проявлений в ходе сингенных колит модели⁹. В протоколе, представленные здесь, мы уточнить и скорректировать Колоноскопическая скоринга матрицы для ориентированных на alloresponse колит в живых мышей с кишечной GvHD после трансплантации аллореактивных HCT и доноров лимфоцитов в MHC класса я полностью несоответствующие установка . Мы определили четыре параметры, подходящие для отражения кишечника связанных с GvHD толстой поражений. Кроме того мы создали систему, которая позволяет доработать классификации любой один детерминант, что приводит к новым оценка, которая легко информирует читателя о тяжести кишечных GvHD присутствует в данной мыши на данный момент. Гистопатологические анализ подтвердил, что эндоскопическая оценка выше определенного порога надежно предсказывает умеренно высокий класс воспаление тканей. Следовательно мини эндоскопическая оценки, по-видимому, представляют рабочие заменой гистопатология золотой стандарт, который постоянно требует жертву экспериментальной мышей. Важно отметить, что этот протокол могут быть применены практически в любой точке данного времени и может использоваться многократно в течение болезни^10,11. Кроме того, в отличие от использования биолюминесценции-зависит от подходов, требуются без труда интенсивных и длительных меры как основанные генетически изменены мышей и, следовательно, методология может применяться на практически любой мыши линии интерес.

Вместе взятые, учитывая пагубные клинические перспективы Алло HCT больных с тяжелой кишечных GvHD, быстрого научно-технического прогресса и более понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе патогенеза иммунной срочно. Аналогичным образом важно, этические соображения требуют, что получение знаний должно быть достигнуто с использованием минимального числа экспериментальных мышей. Следовательно оба признали претензии на научно-исследовательское сообщество знакомства GvHD кишечника может быть достигнуто путем осуществления последовательных мини эндоскопическая оценок толстой кишки в цепочке экспериментальная работа для мониторинга и класс кишечных GvHD в живой экспериментального mouse модели, как описано и проверены в протоколе, представленные здесь.

протокол

Экспериментальные методы, описанные здесь были одобрены правительством Mittelfranken, Бавария, Германия.

1. GvHD индукции

1. День 0: Тотальное облучение тела получателя мышей
   1. Использование женского CD45.2⁺ H2kd⁺ BALB/c мышей, которые по крайней мере 10 недель как получателей.
   2. Весят и запишите вес получателя мышей до GvHD индукции.
      Примечание: Убедитесь, что получатель имеет минимальный вес 20 g. Начальный вес тела будет служить в качестве ссылки значение для расчета потери веса отдельных мыши в течение GvHD индукции и прогрессии.
   3. Место до пяти мышей в контейнере рентгеновский облучатель.
   4. Облучить мышей, облучение всего тела с однократной дозы 8 гр рентгеновского. Использование¹³⁷ Cs в качестве источника излучения.
2. День 1: Растворение облученного мышей с истощены T-клеток костного мозга
   ПРИМЕЧАНИЕ:Трансплантация аллогенных костного клеток, как говорится и подробная по разделу 1.2, должна быть проведена в течение 24 часов после облучения. Выполните процедуры, описанные ниже в стерильных культуры ткани капот и использование отфильтрованных реагентов. Использование аллогенных CD45.1/Ly5.1 B6. SJL-Ptprca Pepcb/ Мыши BoyCrl как доноров для истощенных T-клеток костного мозга.
   1. Усыпить CD45.1/Ly5.1 B6. SJL мышей, которые будут сдавать аллогенной костных клеток костного мозга в соответствии с институциональной, 12-24 ч после облучения получателя мышей BALB/c. Для этого анестезировать CD45.1/Ly5.1 B6. SJL мышей при вдыхании изофлюрановая 5%. Продолжить с изофлюрановая воздействием свыше 1 мин после ареста с дыханием и подтвердите эвтаназии, шейки матки дислокации.
   2. Продезинфицируйте мех и кожу мыши тщательно с 70% этиловом спирте.
   3. Положение мыши на чистой работы оболочка так, что указатель мыши находится в положении лежа, с ее конечности, стоящих перед экспериментатор. Поднимите мех на ахиллесова пята с наконечником щипцы Semken с длиной 13 см и зубчатый изогнутый советы. Надрезать кожу между щипцы и пятка с закаленной 8,5 см тонкой Ножницы прямые советы.
   4. Удлиненное разрез краниально (т.е., от пятки над голени и бедра в область бедра). Удалите кожу и мех из задних конечностей с помощью щипцов.
   5. Выполните ту же процедуру на другой задние конечности.
   6. Удалите задних конечностей, проходящем через прилегающие тазобедренных суставов.
   7. Отрежьте задние лапы. Прорваться через коленный сустав. Храните бедро и голень каждый задних конечностей вместе в чашке Петри 92 мм, наполненный фосфат амортизированное физиологическим раствором (PBS) на льду.
   8. Тщательно очистите костей бедра и голени, удалив столько мышечной ткани как можно из каждого бедра и голени. Трансфер костей бедра и голени в 50 мл трубки заполнены с стерильных RPMI 1640 среднего и место его на мокрый лед до тех пор, пока все соединения большой берцовой и бедренной кости, собранных в шаге 1.2.7 очищаются от мышечной ткани.
   9. Чтобы изолировать костного мозга, передать один бедра или голени кости одновременно (который был очищен как описано в шаге 1.2.8) из 50 мл трубки Петри (с диаметром 92 мм) заполнены с RPMI 1640 среднего. Отрежьте концы бедра или голени с помощью скальпеля, чтобы получить доступ в полость кости, содержащие костного мозга.
   10. Подготовьте коллекцию 50 мл трубки с 5 мл среды RPMI 1640. Вставьте иглу 26 G, прилагается к 1 мл шприц, заполнены с 1 мл RPMI 1640 среды в полость кости и промойте костного из полости в коллекции трубку, нажимая на поршень.
   11. Повторите шаг 1.2.10 пока кости появляется легкий и блестящей (то есть, полость кости лишена заметно красноватые костного мозга). Отказаться от пустой кости.
   12. Повторите шаги 1.2.9 - 1.2.11, с использованием всех костей бедра и голени от шага 1.2.8 и собрать все восстановленные костного штук в же коллекция 50 мл трубки от шага 1.2.10. Держите трубку коллекции на мокрый лед, до тех пор, пока все кости от шага 1.2.8 были обработаны соответственно.
   13. Создайте одну ячейку подвеска, мягко закупорить покраснел, рассыпчатым костного штук вверх и вниз. Фильтр подвеска сингл клеток костного мозга через 40 мкм экран ячейки сетчатый фильтр на новой коллекции Тюбик 50 мл.
   14. Центрифуга для коллекции Тюбик 50 мл, содержащие костного одноклеточных подвеска на 450 x g 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
   15. Ресуспензируйте гранулы в 5 мл ACK лизировать буфер (1 мм Na₂ЭДТА; 10 мм KHCO₃; 144 мм NH₄Cl рН 7,2) для Лизис эритроцитов. Инкубируйте суспензию клеток на 3 мин при комнатной температуре. Позже сразу же добавьте 10 мл раствора PBS суспензию клеток.
   16. Центрифуга для подвески на 450 x g 5 мин при 4 ° C. Отменить супернатант и Ресуспензируйте клетки в 2 мл раствора PBS.
   17. Подсчет клеток костного мозга, используя Горяева. Сохранить Алиготе 6 х 10⁶ клеток для анализа потока цитометрии проверить чистоту клеток после очистки ячейки (см. шаг 1.2.20).
   18. Для истощения Т-клеток из костного одноклеточных подвеска используйте набор для очистки коммерчески доступных ячеек. Магнитно разрушающим клетки (то есть, лимфоциты) CD90.2⁺ от всего костного клеток, после производителя протокол.
   19. Подсчет ячеек истощены T-клетки костного мозга, которые были изолированы, как описано в шаге 1.2.18, используя Горяева. Сохраните Алиготе 1 х 10⁶ клеток для cytometry анализ потоков выполняться позднее, как описано в шаге 1.2.20.
       Примечание: Клетки в среднем урожайность, производный от одного из доноров мыши обычно составляет от 2 x 10-⁷ до 3,4 x 10⁷ клетки истощены T-клетки костного мозга.
   20. Подтвердите успешный истощения Т-клеточный проточной цитометрии. Пятно 1 х 10⁶ клеток, сохранившиеся от шагов 1.2.17 (клеток костного мозга до разделения магнитных клеток) и 1.2.19 (клетки истощены T-клетки костного мозга после разделения магнитных клеток), с следующих антител: α-CD45.1 (A20), α-CD3 (17A2), (α-CD4 GK1.5) и α-CD8α (53-6.7). Используйте остальные ячейки от шага 1.2.17 неокрашенных управления, а также для элементов управления, сингл окрашивание, чтобы настроить проточный цитометр.
       1. Передачи 1 x 10⁶ клеток от каждого образца к хорошо 96-луночных плиты с V-дно для выполнения потока гранулярных пятная процедуру.
       2. Спин вниз клетки в течение 96-луночных пластины (шаг 1.2.20.1) на 450 x g 5 мин при 4 ° C. Отменить супернатант и Ресуспензируйте клетки в 100 мкл буфера СУИМ (PBS, дополненный 3% фильтруют бычьим сывороточным).
       3. Центрифуга для клеток в 96-луночных пластины на 450 x g 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
       4. Добавьте соответствующее количество антител выбора (Сравните с шагом 1.2.20) образцы для одного окрашивания в 100 мкл буфера СУИМ.
       5. Подготовьте смесь всех антител (главный микс), содержащая соответствующие суммы, достаточной для отдельно пятно аликвоты клеток костного мозга, сохранившиеся от предварительного (см. шаг 1.2.17) и после (см. шаг 1.2.19) магнитные истощения Т-клеток. Добавьте 100 мкл мастер смеси обоих аликвоты.
       6. Добавьте только 100 мкл буфера СУИМ в безупречный пример.
       7. Инкубации клеток в 96-луночных пластина для 20 минут при температуре 4 ° C в темноте.
       8. Добавить 100 мкл буфера СУИМ и центрифуги клетки в течение 96-луночных пластины на 450 x g 5 мин при 4 ° C. Отменить супернатант и Ресуспензируйте клетки в 100 мкл буфера СУИМ.
       9. Центрифуга клетки на 450 x g 5 мин при 4 ° C. Отменить супернатант и Ресуспензируйте клетки в 250 мкл буфера СУИМ.
       10. Передача образцов в 5 мл полистирола раунд снизу трубку и анализировать их с потока цитометр инструмент, который способен обнаружить флуоресцентных молекул, которые были использованы для обозначения антител, используемых для характеристики образцов клеток (см. шаг 1.2.20).
       11. Сравните состав ячейки до и после разделения магнитных клеток.
           Примечание: Чистоты приблизительно 95% CD45.1⁺CD3^– (то есть, обедненный T-клеток костного мозга) клетки внутри живой ворота обычно достигается.
   21. Вымойте истощены T-клетки костного мозга клеточных суспензий 2 x с PBS решения (450 x g 5 минут при температуре 4 ° C) и, наконец, Ресуспензируйте клетки в растворе PBS, регулировка концентрации клеток до 5 x 10⁷ кл/мл. Держите на мокрый лед ячейки до инъекции.
   22. Inject клетки истощены T-клеток костного мозга в получателя мышей, которые были облучены за день до (см. раздел 1.1).
       1. Поместите экспериментально мыши в герметичной камере и побудить анестезии при вдыхании до 4% изофлюрановая, до тех пор, пока указатель мыши находится в бессознательном состоянии. Подтвердить анальгезию и потеря сознания, тестирование потери восстанавливающих рефлекс и последующая утрата педаль снять рефлекс.
       2. Придать 5 x 10⁶ клеток T-клетки истощены костного (т.е., 100 мкл 5 x 10⁷ кл/мл) содержит решение PBS с помощью 1 мл шприца с иглой 30 G внутривенно в пространство ретробульбарная, содержащие венозного синуса.
3. День 2: Передача Т-клеток
   Примечание: Выполните описанные ниже процедуры в стерильных культуры ткани капюшоном и отфильтрованных реагентов. Использование CD45.2 C57Bl/6 (одичал типа; WT) мышах как доноров для аллореактивных Т-клеток. Использование congenic маркер систем позволяет различимость между получателя (CD45.2⁺ H2kd⁺ Balb/c мышей) и типы доноров гемопоэтических клеток (клеток костного мозга: CD45.1⁺ H2kb⁺ B6. SJL мышей; аллогенных клеток T: CD45.2⁺ H2kb⁺ C57/Bl6 мышей).
   1. Усыпить мышей C57Bl/6 в соответствии с применением институциональных руководящих принципов и власти. Таким образом анестезировать мышей при вдыхании с концентрацией изофлюрановая 5%. Продолжить выдержка изофлюрановая до 1 мин после ареста с дыханием и подтвердите эвтаназии, шейки матки дислокации. Продезинфицируйте мех и кожу мыши тщательно с 70% этиловом спирте.
   2. Место ситечко с экрана сетки 40 мкм на 50 мл трубки коллекции. Удаление селезенки и поместить его на сито.
   3. С поршень шприца раздробления селезенки в сетчатый фильтр. Промойте ситечко и поршень шприца с PBS для сбора всех splenocytes.
   4. Центрифуга для ячеек в коллекции Тюбик 50 мл на 450 x g 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
   5. Ресуспензируйте splenocytes в 3 мл ACK лизировать буфер для лизируют красных кровяных клеток. Инкубировать суспензию клеток на 3 минуты позже, добавляют 10 мл PBS и центрифуги клетки на 450 x g 5 мин при 4 ° C. Отменить супернатант и Ресуспензируйте splenocytes в PBS.
   6. Подсчет клеток селезенки, используя Горяева. Отвлечь Алиготе 6 х 10⁶ клеток для анализа потока цитометрии, чтобы оценить масштабы очистки на шаге 1.3.9.
   7. Для всего CD3⁺ Т-клеток изоляции от всего splenocytes, используйте набор для очистки коммерчески доступных ячеек. Изолируйте селезеночной Т-клеток, после производителя протокол.
   8. Граф селезеночной CD3⁺ T клетки изолированы, как описано в разделе Шаг 1.3.7, используя Горяева. Сохраните Алиготе 1 х 10⁶ Т клеток для анализа потока цитометрии.
      Примечание: Урожайность в среднем селезеночной T клетки на доноров мышь изолированных магнитных клетки разделения колеблется от 1.3 x 10⁷ до 2 x 10⁷ клеток.
   9. Подтвердите успех изоляции Т-клеточный проточной цитометрии. Подробное описание протокола окрашивание возлагают и выполните шаги 1.2.20.1 - 1.2.20.10.
      1. Пятно 1 х 10⁶ splenocytes шагов 1.3.6 (до разделения магнитных клеток) и 1.3.8 (после разделения магнитных клеток) с следующих антител: α-CD45.2 (104), α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) и α-CD8α (53-6.7).
      2. Используйте остальные ячейки от шага 1.3.6 как безупречный управления и для одного окрашивания с соответствующими антителами, настроить проточный цитометр.
      3. Сравните состав ячейки до и после разделения магнитных клеток.
         Примечание: Чистота ≥95% CD45.2⁺CD3⁺ T клетки в пределах лимфоцитов живой ворота должны быть выполнены.
   10. Мыть T клетки 2 x с PBS (450 x g 5 минут при температуре 4 ° C) и, наконец, Ресуспензируйте клетки в растворе PBS, регулировка концентрации клеток до 7 х 10⁶ клеток/мл. Держите клетки на льду до инъекции.
   11. Придать аллореактивных, селезеночной Т-клеток (см. шаг 1.3.10) в облученных мышей BALB/c, которые ранее получили CD45.1⁺ клетки истощены T-клетки костного мозга (см. шаг 1.2.22).
       1. Побудить анестезии, поместив экспериментально мыши в герметичной камере, в которой он подвергается до 4% изофлюрановая до тех пор, пока она теряет сознание. Подтвердить анальгезию и потеря сознания, тестирование потери восстанавливающих рефлекс и последующая утрата педаль снять рефлекс.
       2. Придать 0,7 х 10⁶ аллореактивных CD3⁺ T клеток с помощью 1 мл шприца с иглой 30 G   (то есть, 100 мкл 7 х 10⁶ клеток/мл) содержит PBS решение (см. шаг 1.3.10), внутривенно в ретробульбарная космических мышей, чтобы побудить GvHD. деноминацию эти мыши как экспериментальной группы.
       3. Придать различные группы мышей с 100 мкл PBS только внутривенно в ретробульбарная пространство, и называть эту группу как в контрольной группе, впоследствии под названием «без Т-клеток пересаженные (не) мышах».

2. Оценка системного GvHD

Примечание: Выполните эту процедуру в полу стерильные окружающих в экспериментальный номер лицензии и оборудованных для обработки живой мышей в объекте животных.

1. Следуйте клиническое GvHD отдельных мышей; в частности оценить и оценка экспериментальных мышей 3 x в неделю для присутствия клинических симптомов GvHD, на основе балльной системе описано ниже и адаптировано из системы скоринга, ранее установленных Кука et al.⁶.
   1. Вес каждой мыши индивидуально, запишите вес и рассчитать потери веса тела thespecific со ссылкой на вес тела, которое было установлено до начала эксперимента (соответствует 100%), в день 0 (шаг 1.1.2). Оценка потеря веса менее 10% начальный вес с класса 0, потеря веса между 10% и 25% с 1-го класса и потеря веса более чем на 25% с 3-го класса.
   2. Оценка уровня активности каждой мыши, взыскательные мышей с уровнем нормальной деятельности (оценка = 0) от мышей с уровнем умеренно снижение активности (Оценка = 1) и мышей с стационарных поведение если внешне они стимулируются (Оценка = 2).
   3. Оценка текстура меха, тем самым дискриминацию нормально, блестящие и прожил мех (оценка = 0) от умеренно Раффлед меха (Оценка = 1) и наличие проплешины (Оценка = 2).
   4. Оценка текстуру кожи, нормальной кожи дискриминацию (оценка = 0) от спорадических пятен масштабирования кожи (например, на хвост и лапы) (Оценка = 1) и очевидным масштабирования и больной кожи области (Оценка = 2).
   5. Проанализируйте последовательность секретируемые табурет фракций. Оценка стул с нормальным (т.е., жесткий последовательности) с класса 0, стул с деформируемого твердого и мягкого табурета с 1-го класса и стул без каких-либо последовательности и, следовательно, с тяжелой диареи с 2-го класса.
   6. Суммировать все отдельно забил параметры для максимальной клинической Оценка 12 на мыши.
2. Рассмотреть и оценить критерии прекращения эксперимент за текущий уровень серьезности болезни отдельных мыши, в соответствии с руководящими принципами применения институциональных и санкционировал животных протокол.

3. Оценка кишечных GvHD

1. Озвучивание связанных с GvHD поражений, Мини эндоскопии дистальной колоректального региона
   ПРИМЕЧАНИЕ:Выполните это в semisterile обстановке в помещении экспериментальный лицензию и оборудованных для обработки живой мышей в объекте животных. Используйте мини эндоскопическая рабочей станции одобрен для использования мелких животных.
   1. Подготовьте эндоскопической устройство, покрывая телескоп (диаметром 1,9 мм) и длиной 10 см с оболочкой эндоскопического обследования. Чистить и стерилизовать эндоскоп с воды и этанола.
   2. Включите компьютер, источник света регулируемые Ксенон и модуль камеры и установить фокус, таким образом, что объекты недалеко от объектива дают четкое изображение.
   3. Подсоедините воздушный насос к эндоскопической оболочкой. Чтобы визуализировать поток воздуха, погрузите кончик эндоскоп в стеклянный стакан наполнен водой. Регулировать поток воздуха, регулируя клапан между воздушный насос и эндоскопической оболочкой. Настроить его на медленное, постоянное воздушный поток, отражены по несколько постоянно возрастающей пузыри.
   4. Поместите мышь в герметичной камере. Побудить анестезии при вдыхании до 4% изофлюрановая до тех пор, пока указатель мыши находится в бессознательном состоянии. Подтвердить анальгезию и отсутствует состояние рефлексов, тестирование потери восстанавливающих рефлекс и последующая утрата педаль снять рефлекс.
   5. Используйте соответствующие ветеринарные анестезия машины в соответствии с животных протокол, используемый. Передача мыши из камеры в рабочую область колоноскопии. Здесь позиция наркотизированных мыши, с его носом в ураном (который подключен к анестезии инструмент), на чистой работы оболочка так, что указатель мыши находится в положении лежа, стоящих перед экспериментатор с ее конечности.
   6. Для поддержания анестезии во время процедуры колоноскопии, снижают концентрацию изофлюрановая до примерно 2%. Контролировать дыхание и ответ на стимуляции во время колоноскопии мыши и регулировка концентрации изофлюрановая в испаритель при необходимости. Покрытие мыши глаза с Сальве, чтобы предотвратить их от получать сухой.
   7. Контролировать эффективность анестезии, щипать между пальцами по мыши. В случае отсутствия реактивности перейдите к шаг 3.1.8.
   8. Поднять хвост чуть выше корня хвоста с одной стороны и осторожно вставьте эндоскоп, дислоцированные в другой стороны, через анус в прямую кишку.
   9. В то время как поток воздуха раздувает просвета кишки, медленно и осторожно двигаться вперед эндоскоп в aboral направлении.
   10. Поместите эндоскоп в середине просвета кишечника и сохранить эту позицию для того, чтобы свести к минимуму контакт с толстой стеной и избежать царапин, глубже стены травм (например, в результате кровотечения), или даже стены перфорации (см. шаг 3.1.17) . Контролировать этот шаг, постоянно наблюдая видео поток (то есть, под постоянным визуализации ободочной кишки отсека).
   11. Если фекалии сжимают мнение, удалите эндоскоп и выполнить клизмы, перемещая ректально с до 2 мл физраствора, используя мягкую пипетка Пастера. Использовать как мало жидкости как можно скорее, чтобы предотвратить непреднамеренное разбавления фекалии и другие вторичные последствия, негативно влияющих на характеристики поверхности слизистой оболочки и, в конечном счете, забил результаты.
   12. Попробуйте регулярно в определенное положение эндоскоп (т.е., собственный) Анатомические сайт в дистальной части толстой кишки стандартизировать скоринга воспаление кишечника и оптимизировать сопоставимость озвучивания результатов между мышей и экспериментов.
       Примечание: Как правило с жестких эндоскопов, максимальная глубина 4 см можно добраться ректальной маршрут. Между 2 и 4 см aborally, двоеточие регулярно превращается в изгиб, который не может быть передан с жесткой колоноскопа. Используйте двоеточие региона дистально рядом с гнутьем как забил по умолчанию месте.
   13. Начните запись видео поток и начать с скоринга воспаления.
   14. Оцените связанные с GvHD воспаление толстой кишки, забив параметры объяснил и изображены в таблице 1 и на рисунке 3.
       1. Переместить эндоскоп в скоринга пятно мягко и слегка бэк - и вперед для оценки различных параметров.
       2. Оцените параметр «прозрачность», а также «согласованность стул», позиционируя эндоскоп в более широкое расстояние по отношению к стенке кишечника.
       3. Оценки параметров «детализации» и «могут», поместив эндоскоп в непосредственной близости к стенке кишечника. Для выполнения этой задачи тщательно применять хорошо дозированное натяжение к стенке кишечника с кончике эндоскопа.
   15. По завершении процесса скоринга остановите запись.
       Примечание: Потом записанный видеоклип можно использовать в общей сложности или используется для создания изображения (то есть, скриншоты) представитель мини эндоскопически начисленных критериев, общий вклад воспаление толстой кишки.
   16. Осторожно удалите эндоскоп.
   17. Прекратите изофлюрановая экспозиция путем передачи мыши отдельной клетке, в котором он подвержен окружающего воздуха. Теплый мышь с лампой красный свет и наблюдать мыши до тех пор, пока он оправится от анестезии и восстанавливает полное сознание.
       Примечание: Из-за инфляции воздуха толстой кишки при эндоскопии брюшной области мыши может появиться запыхаться вверх непосредственно после этого. Хотя это нормально и преходящий характер, длительное признаки массовых и даже прогрессивного инфляции живота и неудачи восстановления мыши может указывать непреднамеренные перфорация толстой кишки (в данном случае, мыши необходимо быть euthanized сразу же).
   18. После завершения восстановления поместите курсор мыши обратно в соответствующей клетке.
   19. Факультативный подход: это также можно взять вид руководствуясь ткань биопсии. Выполните следующие шаги.
       Примечание: Колоноскопия будет выполняться таким же образом, как описано в шагах 3.1.1 - 3.1.18, со следующими изменениями.
       1. В шаге 3.1.1 Используйте оболочка эндоскопическое обследование с встроенным рабочим каналом, вместо простой экзамен оболочка без рабочих каналов, для покрытия телескоп. Ввести пинцет биопсии в рабочий канал до тех пор, пока его кончик просто видна перед эндоскоп на экране видео, потому, что это во многом предотвращает непреднамеренные травмы в кишечник.
       2. Приступайте шаги 3.1.2 - 3.1.11. Вставьте эндоскоп в толстой кишки и толкать ее тщательно вперед на место интерес.
       3. Использовать помощь второй экспериментатор для задачи принятия биопсия тканей толстой кишки. Попросите второго экспериментатора ориентироваться кончик биопсии щипцами в толстой регион выбора нажатием щипцами в рабочий канал медленно вперед до тех пор, пока челюсти щипцы может быть открыт. Постоянно смотрите видео поток во время этой процедуры для сведения к минимуму риска ранения кишечника стены.
       4. Восстановите образец ткани толстой стены, тщательно открытия и закрытия челюстей биопсии щипцы.
          Примечание: Делаете это с осторожностью, чтобы предотвратить перфорация кишечника стены. В редких случаях толстой кишки Перфорация сразу Пожертвуйте пострадавших мыши, применяя измерений в соответствии с руководящими принципами институциональных и непрерывного управления анестетиков.
       5. Тянуть обратно и удаление закрытых пинцет из рабочий канал. Удалите образец из пасти биопсии щипцы, погружения и тщательно пожимая открыл щипцами в стерильный раствор PBS. Потом выбор надлежащих условий хранения для образца ткани, в соответствии с запланированной течению анализы. После дезинфекции с 70% этиловом спирте щипцы могут повторно принять дальнейшие биопсии.
       6. После взятия биопсии, удалите эндоскоп и закончить колоноскопия, как описано в шагах 3.1.16 - 3.1.18.
2. Гистопатологические анализ
   1. Между 26 и 30 дней после рентгеновского облучения усыпить Алло HCT получателей мышей в соответствии с применения институциональных руководящих принципов и власти. Для этого анестезировать мышей при вдыхании изофлюрановая 5%. Продолжить с изофлюрановая воздействием на 1 мин после ареста с дыханием и подтвердите эвтаназии, шейки матки дислокации. Тщательно дезинфицировать мех и кожу мыши с 70% этиловом спирте.
   2. Откройте брюшной полости и удалите двоеточие. Передача его в чашку Петри (с диаметром 92 мм) с PBS.
   3. Заполните наконечник распылителя 5 мл с PBS. С помощью Semken щипцы с длиной 13 см и зубчатый изогнутый советы, скольжения дистальной части толстой кишки (около 5 мм) через наконечник наконечник распылителя. Тщательно исправить толстой кишки с щипцами в наконечник распылителя и очистить Колон с PBS, нажимая поршень наконечник распылителя для удаления фекалий из кишечника.
   4. Вырежьте из толстой сегмент расположен примерно в 5 мм от ануса, с помощью скальпеля.
   5. Исправьте резекции кишки образца в 4,5% формальдегида на ночь. Прежде чем внедрить его в парафин, место ткани в вертикальном положении.
   6. Вырезать 3 мкм сечения парафин врезанных толстой ткани и линяют с гематоксилином и эозином (он), используя стандартные протоколы, окрашивание.
   7. Подготовьте он окрашенных сечений образцов тканей толстой кишки.
   8. Адаптировано из скоринга матрицы, сообщил¹²Каплан et al., histopathologically Оценка активности воспалительного процесса полуколичественным, с количеством баллов от 0-3: нет воспаления (оценка = 0), мягкий воспаление (Оценка = 1), умеренная воспаление (Оценка = 2), и тяжелые воспаления (Оценка = 3).
      Примечание: В идеале нанимать для выполнения этой задачи экспертизы патологоанатом, который имеет опыт в оценке мышиных кишечных GvHD и ослепил характер экспериментальной и контрольными группами.

Результаты

Текущий протокол, описывая мини эндоскопическая оценки поражения кишечника связанных GvHD дистальной части толстой кишки, установлены и проверены в ранее подвергался системных индукции тяжелой острой GvHD модели мышей. В этом исследовании, мы использовали MHC класса, я по...

Обсуждение

Протокол описывает методику индукции и мини эндоскопическая оценки толстой фенотипа, наблюдается в ходе кишечных GvHD. Он служит более широкое включение ученых для изучения кишечных GvHD продольно и неинвазивно (то есть, с самого начала толстой проявления и прогрессирования до максимальн...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator	Gamma-Service Meical GmbH
Phosphate-buffered saline (PBS )	Sigma-Aldrich Co. LLC.	D8662-6x500ML
Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips)	Fine Science Tools	11009-13
Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm)	Fine Science Tools	14090-09
RPMI-1640 Medium	Sigma-Aldrich Co. LLC.	R8758-500ML
Hypodermic needle (26 G)	B. Braun Melsungen AG	4657683
1 mL syring	B. Braun Melsungen AG	9166017V
50 mL tube	Sarstedt Ag & Co.KG	62,547,254
Cell strainer with a 40 µm mesh screen	BD Falcon	352340
Ammonium chloride (NH4Cl)	Sigma-Aldrich Co. LLC.	11209	ingredient of ACK lysing buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA)	Carl Roth GmbH & Co.KG	8043.2	ingredient of ACK lysing buffer
Potassium bicarbonate (KHCO3)	Merck KGaA	1,048,540,500	ingredient of ACK lysing buffer
CD90.2 MicroBeads, mouse	Miltenyi Biotec GmbH	130-049-101	magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells
Pan T Cell Isolation Kit II, mouse	Miltenyi Biotec GmbH	130-095-130	magnet cell separation to isolate splenic T cells
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731)	Biolegend	109822
Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645)	Biolegend	100214
FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691)	Biolegend	100406
PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168)	Biolegend	110730
APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753)	Biolegend	100714
Filtrated bovine serum	Pan Biotec	P40-47500	ingredient of FACS buffer
96-well polystyrene V-bottom plates	Greiner Bio-One	651201
Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL)	Falcon	352052
BD LSRFortessa II flow cytometer	BD Bioscience Co.
Insulin syringe with sterile interior (30 G)	BD	324826
Oxy Vet Oxymat 3	Eickemeyer		oxygen concentrator  for anesthesia
NarkoVet	Eickemeyer	213062
Plexiglass chamber	Eickemeyer	214620
Straight Forward Telescope	KARL STORZ SE &Co KG	64301 AA	part of the experimental setup for colonoscopy
Protection and Examination Sheath	KARL STORZ SE &Co KG	61029 C	part of the experimental setup for colonoscopy
Examination Sheath with working channel	KARL STORZ SE &Co KG	61029 D	part of the experimental setup for colonoscopy
Biopsy Forceps	KARL STORZ SE &Co KG	61071 ZJ	part of the experimental setup for colonoscopy
175 Watt SCB XenonLight Source	KARL STORZ SE &Co KG	20132120	part of the experimental setup for colonoscopy
Fiber Optic Light Cable	KARL STORZ SE &Co KG	495 NL	part of the experimental setup for colonoscopy
Image 1 S3 Camera Head	KARL STORZ SE &Co KG	22220030	part of the experimental setup for colonoscopy
Image 1 SCB Camera Control Unit	KARL STORZ SE &Co KG	22200020	part of the experimental setup for colonoscopy
LCD monitor	Olympus	OEV181H	part of the experimental setup for colonoscopy
Forane / Isofluran	AbbVie Inc.	B506
Formaldehyde solution 37 %	Carl Roth GmbH & Co.KG	7398.1
5.0 mL Dispenser tip	Eppendorf AG	30089456