Induktion der intestinalen Graft - Versus - Host-Seuche und seiner Mini-endoskopische Beurteilung in Live Mäuse

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen eine Protokoll, die beschreibt allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation und ermöglicht sich wiederholenden Mini-endoskopische Auswertungen des distalen Colon an Ort und Stelle für die Präsenz, die Merkmale und die Schwere der Kolon Entzündung im live Mäuse Darm Graft - Versus - Host-Seuche leiden.

Zusammenfassung

Akute Graft - Versus - Host-Seuche (GvHD) stellt die schwersten Komplikation, dass Patienten, die zuvor allogene hämatopoetische Stammzell-Transplantation (allo-HCT) Gesicht und ist häufig mit einem schlechten klinischen Ergebnis verbunden. Weile, zum Beispiel GvHD Manifestationen der Haut sind in der Regel auf etablierten immun-unterdrückende Therapien und, daher nehmen keinen fatalen Kurs, das Vorhandensein und die Intensität der intestinalen GvHD, vor allem von der Mitte zum unteren Teile des Darms, Das Ergebnis stark beeinflussen und insgesamt Überlebenszeit von Patienten mit akuten GvHD. therapeutische Optionen sind im Wesentlichen beschränkt sich auf die klassischen immun-unterdrückende Agenten nur moderate Krankheit mildern Wirkungen nachgeben. Daher detaillierte Kenntnisse über die Gewebe-Resident immun Kaskade, Veränderungen in der intestinalen Mikrobiota, und die stromale Reaktion vor, nach und nach Darm GvHD auftreten sind dringend erforderlich, um die Ereignisse und die zugrunde liegenden Mechanismen zu verstehen sein Pathogenese und innovative Therapiemöglichkeiten zu entwickeln. Murine Modelle von GvHD werden häufig eingesetzt zur Feststellung und Beurteilung funktional Moleküle und wegen vermeintlich Darm GvHD fahren. Mittel, insbesondere Überwachung und Evaluierung der Darmentzündung im Laufe der Zeit im Wesentlichen fehlt aber da etablierten Resultate zu bewerten und benoten akuten GvHD routinemäßig verschiedener Parameter bestehen die eher systemische GvHD widerspiegeln Manifestationen. Die detaillierte Auswertung der intestinalen GvHD euthanasierten Mäusen, damit im wesentlichen ausgenommen longitudinale Studien eingeschränkt wurde (z.B. kinetische) Analysen von Kolon Fach unter einem bestimmten Versuchsbedingung (z. B. Antikörper-vermittelten Blockade von einem proinflammatorischen Zytokinen) in live Mäuse (in Vivo). Die Mini-endoskopische in-situ Beurteilung der distalen Dickdarm von allo-HCT-behandelten Mäusen, die hier beschriebenen ermöglicht (a) eine detaillierte makroskopische Auswertung der verschiedenen Aspekte der Darmentzündung und (b) die Möglichkeit, Gewebeproben für nachgelagerte Analysen zu sammeln verschiedenen Zeitpunkten im Verlauf des Beobachtungszeitraums. Insgesamt bietet der Mini-endoskopische Ansatz einen großen Fortschritt in präklinischen nichtinvasive Überwachung und Bewertung der intestinalen GvHD.

Einleitung

Hämatopoetischen Tumoren entstehen direkt aus dem Fach der hämatopoetischen Stammzellen und unkontrollierte, sind gehen zügig voran und schweren immunvermittelte Erkrankungen oft Indikationen allo-HCT^1,2durchführen. Obwohl für das Auftreten der prognostische Vorteil Graft-versus-Tumor Reaktion Buchhaltung, sind Spender-Lymphozyten jedoch häufig induzieren und fördern einen unerwünschten immunvermittelte Angriff von gesundem Gewebe Komponenten innerhalb der allo-HCT-Empfänger , ein Prozess, der Graft - Versus - Host-Seuche³aufgerufen wird. Manifestationen im Darm, der so genannte intestinale GvHD repräsentieren die am meisten gefürchtete Komplikation der akuten GvHD, schwere Formen von denen routinemäßig verbunden mit einer hohen Mortalität^1,2,4sind.

Insgesamt, murine Modelle von allo-HCT entstanden als wertvolle Werkzeuge, um zu identifizieren und immunvermittelte Mechanismen der Pathogenese von GvHD⁵zu studieren. Jedoch kinetische Bestimmung, z. B. wohltuende Wirkung der neue therapeutische Interventionen im Laufe der Zeit im Leben Mäuse routinemäßig basiert auf der Bestimmung der klinischen GvHD punktet⁶. Während diese Werte entsprechend geeignet sind, zum Beispiel die Krankheit Gesamtbelastung (d. h. die systemische GvHD), klinische punktet fehlen die Empfindlichkeit um zuverlässig Organ-spezifischen Manifestationen spiegeln (z.B., im Darm). Daher fallen Schlussfolgerungen, zum Beispiel in Bezug auf die Darm-protektive Effekte einer bestimmten therapeutischen Intervention, die auf diese scoring-Systeme in der Regel kurz.

Trotz der großen Fortschritte durch die Erfindung von neuartigen Ganzkörper-bildgebende Modalitäten in Kombination mit der Verwendung von entweder Biolumineszenz oder fluoreszierende genetische Maus Modelle^7,8, Methoden, direkt und spezifisch Bewerten der intestinalen Manifestation von GvHD in live Mäuse fehlen. Daher ist die Beweggründe für das Protokoll der endoskopischen Beurteilung des intestinalen GvHD Phänotyps im nächsten Abschnitt beschrieben, dieses Hindernis zu überwinden. Darüber hinaus ist die Motivation auch experimentellen Mäuse Zahlen seit, so weit, eine detaillierte Bewertung der zellulären, morphologischen und molekularen Eigenschaften zu reduzieren (z. B., durch Histopathologie oder Molekularbiologie) der Darm GvHD Manifestation ist letztlich das Opfer der experimentellen Maus erforderlich.

Unsere Institution wurde zuvor auf die Methodik einer Mini-endoskopische Beurteilung der Kolon Manifestationen im Zuge Phänomen ulcerosa Modelle⁹berichtet. In dem hier vorgestellten Protokoll haben wir weiterentwickelt und angepasst die koloskopischen scoring Matrix für Alloresponse-gesteuerte Kolitis bei live Mäusen mit Darm GvHD nach Transplantation von Alloreactive HCT und Spender-Lymphozyten in einem MHC-Klasse ich vollständig übereinstimmende Einstellung . Wir identifizierten vier Parameter für intestinale GvHD-bezogene Kolon Läsionen widerspiegeln. Darüber hinaus haben wir ein System, das ermöglicht eine fein abgestimmte Verschneidung einzige Determinante, wodurch eine neue Partitur, die leicht den Leser über die Schwere der intestinalen GvHD in einer bestimmten Maus zu einem bestimmten Zeitpunkt vorhanden informiert. Histopathologische Untersuchungen bestätigt, dass eine endoskopische Score ab einem bestimmten Schwellenwert Moderate bis hohe Grade Gewebe Entzündungen zuverlässig vorherzusagen ist. Mini-endoskopische Beurteilung scheint daher arbeiten Ersatz für den Goldstandard Histopathologie darstellen, die routinemäßig das Opfer der experimentellen Mäuse erfordert. Wichtig ist, dieses Protokoll kann an nahezu jedem gegebenen Zeitpunkt angewendet werden und kann im Verlauf der Krankheit^10,11wiederholt verwendet werden. Außerdem, im Gegensatz zu der Verwendung von Biolumineszenz-abhängige Ansätze, keine Arbeits-intensive und zeitaufwendige Maßnahmen wie kreuzende genetisch Mäuse geändert erforderlich sind und daher kann die Methodik auf praktisch jede Maus Interesse.

Zusammengenommen, in Anbetracht der nachteilige klinischen Perspektive allo-HCT-Patienten mit schweren Darm GvHD, rasanten wissenschaftlichen Fortschritt und einen besseren Einblick in die molekularen Mechanismen der Pathogenese immun sind dringend notwendig. Ebenso fordern wichtigere, ethische Überlegungen, dass der Erkenntnisgewinn bei der Nutzung der minimalen Anzahl von experimentellen Mäuse erreicht werden soll. Daher erkannt beide, Ansprüche auf die Forschungsgemeinschaft erkunden Darm GvHD vorangebracht werden können, durch die Implementierung von seriellen Mini-endoskopische Auswertungen des Dickdarms in der experimentellen Arbeit Kette zu überwachen und zu benoten Darm GvHD in live experimentelle Maus Modelle, wie beschrieben und im hier vorgestellten Protokoll validiert.

Protokoll

Die hier beschriebenen experimentellen Methoden wurden von der Regierung von Mittelfranken, Bavaria, Germany genehmigt.

(1) GvHD Induktion

1. Tag 0: Ganzkörper-Bestrahlung der Empfänger Mäuse
   1. Verwenden Sie weiblichen CD45.2⁺ H2kd⁺ BALB/c Mäuse, die mindestens 10 Wochen alt als Empfänger sind.
   2. Weigh und nimmt das Gewicht der Empfänger Mäuse vor GvHD Induktion.
      Hinweis: Stellen Sie sicher, dass der Empfänger eine minimale Gewicht von 20 g. Die Einwaage Körper dient als Referenzwert, den Gewichtsverlust der einzelnen Maus im Laufe der GvHD Induktion und das Fortschreiten zu berechnen.
   3. Legen Sie bis zu fünf Mäuse in den Behälter von der Röntgen-Brutapparat.
   4. Die Mäuse durch Ganzkörper-Bestrahlung mit einer Einzeldosis von 8 Gy Röntgenstrahlung zu bestrahlen. Verwenden Sie Cs-¹³⁷ als einer Strahlungsquelle.
2. Tag 1: Rekonstitution der bestrahlten Mäuse mit T-Zelle-abgereicherte Knochenmark
   HINWEIS:Die Transplantation von allogenen Knochenmarkzellen als umrissen und detailliert unter Abschnitt 1.2, sollte innerhalb von 24 h nach der Bestrahlung erfolgen. Führen Sie die nachfolgend beschriebenen unter einer sterilen Gewebekultur Haube und gefilterten Reagenzien zu verwenden. Allogene CD45.1/Ly5.1 B6 zu verwenden. SJL-Ptprca Pepcb/ BoyCrl Mäuse als Spender für T-Zelle-abgereicherte Knochenmark.
   1. CD45.1/Ly5.1 B6 einschläfern. SJL Mäuse, die allogene Knochenmarkzellen nach den institutionellen Richtlinien, 12-24 h nach der Bestrahlung der Empfänger BALB/c Mäuse zu spenden. Hierzu die CD45.1/Ly5.1 B6 zu betäuben. SJL Mäuse durch das Einatmen von 5 % Isofluran. Fahren Sie mit Isofluran-Exposition über 1 min nach Festnahme zu atmen und bestätigen Sie Euthanasie durch zervikale Dislokation.
   2. Desinfizieren Sie das Fell und die Haut der Maus gründlich mit 70 % Ethanol.
   3. Position der Maus auf eine saubere Arbeit Mantel, so dass die Maus in Bauchlage, mit seiner Hinterhand mit Blick auf den Experimentator ist. Heben Sie das Fell an die Achillesferse mit der Spitze einer Pinzette Semken mit einer Länge von 13 cm und gezackten gebogenen Spitzen. Die Haut zwischen den Zangen und die Ferse mit gehärteten 8,5 cm feine Schere mit geraden Spitzen einzuschneiden.
   4. Verlängern Sie die Inzision cranially (d. h. von der Ferse über den Unterschenkel und Oberschenkel, die Hüftregion). Entfernen Sie Haut und Fell aus der hinteren Gliedmaßen mit Hilfe der Zange.
   5. Führen Sie das gleiche Verfahren auf der anderen hinteren Extremität.
   6. Entfernen Sie den hinteren Gliedmaßen durch Durchtrennung der angrenzenden Hüftgelenke.
   7. Schneiden Sie die hinteren Pfoten. Schnitt durch das Kniegelenk. Speichern Sie die Oberschenkel und Schaft von allen Hind gliedern zusammen in ein 92 mm Petrischale gefüllt mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) Lösung auf Eis.
   8. Reinigen Sie Femur und Tibia Knochen sorgfältig, indem Sie möglichst viel Muskelgewebe wie möglich aus jedem Oberschenkel und Schaft. Übertragen Sie die Femur und Tibia Knochen auf eine 50 mL-Tube gefüllt mit sterilen RPMI 1640 Medium und Stelle es auf nassem Eis bis alle Tibia und Femur Bones im Schritt 1.2.7 gesammelt werden gereinigt von Muskelgewebe.
   9. Um das Knochenmark zu isolieren, einen Oberschenkelknochen oder Schienbein Knochen zu einem Zeitpunkt (die beschriebene in Schritt 1.2.8 gesäubert worden ist) aus der 50 mL-Tube zum Übertragen einer Petrischale (mit einem Durchmesser von 92 mm) mit RPMI 1640 Medium gefüllt Schneiden Sie die Enden des Femur und Tibia mit einem Skalpell um Zugang zu den Hohlraum des Knochens mit Knochenmark.
   10. Bereiten Sie ein Sammelrohr 50 mL mit 5 mL RPMI 1640 Medium. Ein 26 G-Nadel befestigt eine 1 mL Spritze mit 1 mL RPMI 1640 Medium in den Knochenhohlraum gefüllt und das Knochenmark aus dem Hohlraum in dem Sammelrohr spülen, indem man den Kolben.
   11. Wiederholen Sie Schritt 1.2.10 bis der Knochen leicht und glatt erscheint (d. h. der Knochenhohlraum ist sichtbar frei von rötlichen Knochenmark). Entsorgen Sie die leere Knochen.
   12. Wiederholen Sie die Schritte 1.2.9 - 1.2.11, mit allen Femur und Tibia Knochen aus Schritt 1.2.8, und sammeln Sie alle wiederhergestellten Knochenmark Stücke in dem gleichen 50 mL Sammelrohr aus Schritt 1.2.10. Halten Sie das Sammelröhrchen auf nassem Eis, bis alle Knochen aus Schritt 1.2.8 entsprechend verarbeitet wurden.
   13. Erstellen Sie eine einzellige Suspension durch Pipettieren sanft gespült, krümelige Knochenmark Stücke rauf und runter. Filtern Sie Knochenmark einzellige Aufhebung durch ein 40 µm Bildschirm Zelle Sieb auf eine neue 50 mL Sammelröhrchen gelegt.
   14. Zentrifugieren Sie das 50 mL Sammelröhrchen mit Knochenmark einzellige Aufhebung 450 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.
   15. Das Pellet in 5 mL ACK Lysiereinrichtung Puffer (1 mM Na₂EDTA; 10 mM KHCO₃; 144 mM NH₄Cl; pH 7,2) für die roten Blutkörperchen Lyse aufzuwirbeln. Inkubieren Sie die Zellsuspension für 3 min bei Raumtemperatur. Danach sofort fügen Sie 10 mL PBS-Lösung der Zellsuspension hinzu.
   16. Zentrifugieren Sie die Federung bei 450 X g für 5 min bei 4 ° C. Den Überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zellen in 2 mL PBS-Lösung.
   17. Zählen Sie die Knochenmarkzellen, mit einem Hemocytometer. Erhalten eine Aliquote von 6 x 10⁶ Zellen für Flow Cytometry Analyse, die Reinheit der Zellen nach der Reinigung der Zelle zu überprüfen (siehe Schritt 1.2.20).
   18. Verwenden Sie für den Abbau der T-Zellen aus dem Knochenmark einzellige Suspension eine handelsübliches Handy Reinigung Kit. Magnetisch zum Abbau CD90.2⁺ Zellen (z.B. Lymphozyten) aus der gesamten Knochenmarkzellen nach Protokoll des Herstellers.
   19. Zählen Sie die T-Zelle-abgereicherte Knochenmarkzellen, die isoliert, wie in Schritt 1.2.18, mit einer Hemocytometer beschrieben wurden. Bewahren Sie eine Aliquote von 1 x 10⁶ Zellen für Flow-Zytometrie Analyse später durchgeführt werden, wie in Schritt 1.2.20 beschrieben.
       Hinweis: Die im Durchschnitt Zellausbeute abgeleitet von einem Spender Maus ist in der Regel aus 2 x 10⁷ auf 3,4 x 10⁷ T-Zelle-abgereicherte Knochenmarkzellen.
   20. Eine erfolgreiche T-Zell-Depletion von Durchflusszytometrie zu bestätigen. Fleck 1 x 10⁶ Zellen, vor Schritte 1.2.17 (Knochenmarkzellen vor magnetischen Zellseparation) und 1.2.19 (T-Zelle-abgereicherte Knochenmarkzellen nach magnetischen Zellseparation), mit den folgenden Antikörpern bewahrt: α-CD45.1 (A20), α-CD3 (17A2), α-CD4 ( GK1.5) und α-CD8α (53-6,7). Verwenden Sie die verbleibenden Zellen aus Schritt 1.2.17 als ungefärbten Kontrolle und für Single-Färbung Steuerelemente, um das Durchflusszytometer einzurichten.
       1. Übertragen Sie 1 x 10⁶ Zellen von jeder Probe zu einem Brunnen einer 96-Well-Platte mit einem V-Boden, der Fluss durchflusszytometrischen Färbeverfahren durchzuführen.
       2. Spin-down der Zellen innerhalb der 96-Well-Platte (Schritt 1.2.20.1) 450 X g für 5 min bei 4 ° C. Den Überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zellen in 100 µL der FACS-Puffer (PBS ergänzt mit 3 % gefiltert Rinderserum).
       3. Zentrifugieren Sie Zellen innerhalb der 96-Well-Platte 450 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.
       4. Die Proben für einheitliche Färbung in 100 µL FACS Puffer einen angemessenen Betrag des Antikörpers Wahl (vgl. Schritt 1.2.20) hinzugefügt werden.
       5. Bereiten Sie eine Mischung von allen Antikörpern (master-Mix), die entsprechende Mengen ausreichen, um separat das Knochenmark Zelle Aliquote bewahrt vor Flecken (siehe Schritt 1.2.17) und nach (siehe Schritt 1.2.19) magnetische T-Zell-Depletion. Beide Aliquote 100 µL der master-Mix hinzufügen.
       6. Die ungefärbten Probe nur 100 µL Puffer FACS hinzufügen.
       7. Inkubieren Sie die Zellen innerhalb der 96-Well-Platte für 20 min bei 4 ° C im Dunkeln.
       8. Fügen Sie 100 µL Puffer FACS und Zentrifugieren Sie Zellen innerhalb der 96-Well-Platte 450 X g für 5 min bei 4 ° C. Den Überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zellen in 100 µL der FACS-Puffer.
       9. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 450 X g für 5 min bei 4 ° C. Den Überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zellen in 250 µL FACS-Puffer.
       10. Übertragen Sie die Proben in einer 5 mL Polystyrol Rundboden Röhrchen zu und analysieren sie mit ein Fluß Cytometer Instrument, das ist in der Lage, die fluoreszierende Moleküle zu erkennen, die verwendet wurden, um die Antikörper eingesetzt, um die Zellproben charakterisieren (siehe Schritt 1.2.20) zu beschriften.
       11. Vergleichen Sie die Zusammensetzung der Zelle aus der Zeit vor und nach der magnetischen Zellseparation.
           Hinweis: Eine Reinheit von etwa 95 % CD45.1⁺CD3^– (d. h. T-Zelle-abgereicherte Knochenmark) Zellen innerhalb der live Tor wird in der Regel erreicht.
   21. Waschen Sie die T-Zelle-abgereicherte Knochenmark Zellsuspensionen 2 X mit PBS-Lösung (450 X g für 5 min bei 4 ° C) und zu guter Letzt Aufschwemmen der Zellen im PBS-Lösung, Anpassung der Zellkonzentration bis 5 x 10⁷ Zellen/mL. Halten Sie die Zellen auf nassem Eis, bis die Injektion.
   22. Injizieren Sie T-Zelle-abgereicherte Knochenmarkzellen in die Empfänger Mäuse, die am Vortag (siehe Abschnitt 1.1) bestrahlt wurden.
       1. Platzieren Sie die experimentelle Maus in einer auslaufsicheren Kammer und induzieren Anästhesie durch Einatmen von bis zu 4 % Isofluran, bis die Maus bewusstlos ist. Analgesie und Verlust des Bewusstseins durch den Verlust der aufrichtenden Reflex-Tests zu bestätigen und der anschließenden Verlust des Pedals zurückziehen Reflex.
       2. 5 x 10⁶ T-Zelle-abgereicherte Knochenmarkzellen (d. h. 100 µL von 5 x 10⁷ Zellen/mL) zu injizieren mit PBS-Lösung mit einer 1 mL Spritze, ausgestattet mit einer 30 G-Nadel intravenös in den retrobulbären Raum mit den venösen Sinus.
3. 2. Tag: Transfer von T-Zellen
   Hinweis: Durchführen der beschriebenen Verfahren unten in eine sterile Gewebekultur Kapuze und gefilterten Reagenzien zu verwenden. Verwenden Sie CD45.2 C57Bl/6 (Wildtyp; WT) Mäuse als Spender für Alloreactive T-Zellen. Die Verwendung von Congenic-Marker-Systeme erlaubt die Unterscheidbarkeit zwischen Empfänger (CD45.2⁺ H2kd⁺ Balb/c Mäuse) und Spender hämatopoetischen Zelltypen (Knochenmarkzellen: CD45.1⁺ H2kb⁺ B6. SJL Mäuse; allogenen T-Zellen: CD45.2⁺ H2kb⁺ C57/Bl6 Mäuse).
   1. Einschläfern C57Bl/6 Mäusen nach der Anwendung von institutionellen Vorgaben und Behörden. Daher betäuben Sie Mäuse durch Inhalation mit einer Konzentration von 5 % Isofluran. Isofluran Exposition bis 1 min nach Einatmen Verhaftung und bestätigen Sie Euthanasie durch zervikale Dislokation. Desinfizieren Sie das Fell und die Haut der Maus gründlich mit 70 % Ethanol.
   2. Stellen Sie ein Sieb mit einem 40 µm-Sieb auf eine 50 mL-Sammelröhrchen. Entfernen Sie die Milz zu und legen Sie es auf das Sieb.
   3. Mit einer Spritze Stößel zerkleinern Sie die Milz im Sieb. Waschen Sie das Sieb und Spritzenkolben mit PBS, alle Splenocyten zu sammeln.
   4. Zentrifugieren Sie die Zellen in dem Sammelrohr 50 mL 450 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.
   5. Aufzuwirbeln Sie die Splenocyten in 3 mL ACK Lysiereinrichtung Puffer, in den Erythrozyten zu lysieren. Inkubieren Sie die Zellsuspension, für 3 min. danach 10 mL PBS zugeben und Zentrifugieren der Zellen bei 450 X g für 5 min bei 4 ° C. Den Überstand verwerfen und Aufschwemmen der Splenocyten mit PBS-Puffer.
   6. Zählen der Milzzellen, mit einem Hemocytometer. Abzulenken Sie ein Aliquot von 6 x 10⁶ Zellen für Flow-Zytometrie-Analyse mit der Überprüfung des Umfangs der Reinigung im Schritt 1.3.9.
   7. Für eine totale CD3⁺ T-Zell losgelöst vom gesamten Splenocyten, verwenden Sie eine handelsübliches Handy Reinigung Kit. Isolieren Sie die Milz T-Zellen, nach der Hersteller-Protokolls.
   8. Zählen die Milz CD3⁺ T Zellen isoliert wie unter Schritt 1.3.7, mit einem Hemocytometer. Bewahren Sie eine Aliquote von 1 x 10⁶ T Zellen für Flow-Zytometrie-Analyse.
      Hinweis: Die im Durchschnitt Ausbeute an Milz T Zellen pro Spender Maus isoliert durch magnetische Trennung Zellbereiche von 1,3 x 10⁷ , 2 x 10⁷ Zellen.
   9. Bestätigen Sie den Erfolg der T-Zell-Isolation durch Durchflusszytometrie. Verleihen Sie für eine detaillierte Beschreibung des Protokolls Färbung, und führen Sie die Schritte 1.2.20.1 - 1.2.20.10.
      1. 1 x 10⁶ Splenocyten Schritte 1.3.6 (vor der magnetischen Zellseparation) und 1.3.8 (nach der magnetischen Zellseparation) mit den folgenden Antikörpern zu beflecken: α-CD45.2 (104), α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) und α-CD8α (53-6,7).
      2. Verwenden Sie die verbleibenden Zellen aus Schritt 1.3.6 als ungefärbten Kontrolle und für einheitliche Färbung mit der entsprechenden Antikörper, um das Durchflusszytometer einzurichten.
      3. Vergleichen Sie die Zelle Zusammensetzung vor und nach der magnetischen Zellseparation.
         Hinweis: Eine Reinheit von ≥95 % der CD45.2⁺CD3⁺ T Zellen innerhalb der Lymphozyten live Tor erreicht werden sollte.
   10. Waschen der T Zellen 2 X mit PBS (450 X g für 5 min bei 4 ° C) und zu guter Letzt Aufschwemmen der Zellen im PBS-Lösung, Anpassung der Zellkonzentration, 7 x 10⁶ Zellen/mL. Bewahren Sie die Zellen auf Eis bis die Injektion.
   11. Alloreactive, Milz T-Zellen (siehe Schritt 1.3.10) in bestrahlten BALB/c Mäuse, die zuvor CD45.1⁺ T-Zelle-abgereicherte Knochenmarkzellen erhalten haben (siehe Schritt 1.2.22) zu injizieren.
       1. Anästhesie zu induzieren, indem man die experimentelle Maus in einer auslaufsicheren Kammer, in der es ausgesetzt ist, bis zu 4 % Isofluran, bis er sein Bewusstsein verliert. Analgesie und Verlust des Bewusstseins durch den Verlust der aufrichtenden Reflex-Tests zu bestätigen und der anschließenden Verlust des Pedals zurückziehen Reflex.
       2. Injizieren von 0,7 x 10⁶ Alloreactive CD3⁺ T Zellen mit einer 1 mL Spritze mit einer 30 G-Nadel ausgestattet   (d.h. 100 µL 7 x 10⁶ Zellen/mL) mit PBS-Lösung (siehe Schritt 1.3.10), intravenös in die Retrobulbärneuritis Raum der Mäuse, induzieren GvHD. bezeichnen diese Mäuse als die experimentelle Gruppe.
       3. Eine andere Gruppe von Mäusen mit 100 µL PBS allein intravenös in den retrobulbären Raum zu injizieren, und bezeichnen diese Gruppe als die Kontrollgruppe, später genannt "keine-T-Zelle-transplantiert (nicht) Mäuse".

2. Bewertung der systemischen GvHD

Hinweis: Führen Sie diesen Vorgang in einer semi-sterile Umgebung in einen experimentellen Raum lizenziert und für den Umgang mit live Mäuse innerhalb der Tierstation ausgestattet.

1. Folgen Sie den klinischen Verlauf von GvHD in einzelnen Mäusen; insbesondere zu beurteilen und die experimentellen Mäuse 3 x pro Woche auf das Vorhandensein von klinischen Symptomen der GvHD, basierend auf einem Punktesystem beschrieben und adaptiert von ein scoring-System Cook Et Al.⁶vorher festgelegten Punkten.
   1. Wiegen Sie jede Maus einzeln, nehmen Sie das Gewicht und berechnen Sie Thespecific Körper-Gewicht-Verlust in Bezug auf das Körpergewicht, das vor Beginn des Experiments (entspricht 100 %) am Tag 0 (Schritt 1.1.2) bestimmt wurde. Punkten Sie einen Gewichtsverlust von weniger als 10 % von der Einwaage mit Grad 0, ein Gewichtsverlust zwischen 10 % und 25 % mit Grad 1 und ein Gewichtsverlust von mehr als 25 % mit Grad 3.
   2. Die Aktivitätsstufe jede Maus, unterscheidendes Mäuse mit einer normalen Aktivität der Gäste (Score = 0) von Mäusen mit einem mäßig verminderte Aktivität (Punktzahl = 1) und Mäuse mit stationären Verhalten, wenn sie extern stimuliert werden (Punktzahl = 2).
   3. Punkten die Fell Textur, damit Diskriminierung einer normalen, glänzenden und kempt Fell (Score = 0) aus einer mäßig gekräuselte Fell (Punktzahl = 1) und das Vorhandensein von kahle Stellen (Partitur = 2).
   4. Punkten die Struktur der Haut, normalen Haut diskriminieren (Score = 0) von sporadischen Flecken der Haut (z. B. an der Rute und den Pfoten) Skalierung (Punktzahl = 1) und offensichtlich Skalierung und Wunde Hautstellen (Partitur = 2).
   5. Analysieren Sie die Konsistenz der sekretierten Hocker Brüche. Score Hocker mit einem normalen (d.h., harte Konsistenz) mit Grad 0, Hocker mit verformbaren und weichen Stuhl mit Klasse 1 und Hocker ohne jede Konsequenz und infolgedessen mit schwerem Durchfall mit Klasse 2.
   6. Fassen Sie alle gesondert ausgewerteten Parameter auf einen maximalen klinische Score von 12 per Mausklick.
2. Prüfen und bewerten die Kriterien der Einstellung des Experiments aufgrund der aktuellen Schweregrad der Erkrankung der einzelnen Maus, gemäß der geltenden Richtlinien und tierischen Protokoll berechtigt.

3. Bewertung der intestinalen GvHD

1. Scoring von GvHD-bezogene Läsionen von Mini-Endoskopie der distalen kolorektalen region
   HINWEIS:Führen Sie dies in einer semisterile Umgebung in einem Versuchsraum lizenziert und für den Umgang mit live Mäuse innerhalb der Tierstation ausgestattet. Verwenden Sie eine Mini-endoskopische Workstation, die zugelassen ist für den Einsatz von kleinen Tieren.
   1. Bereiten Sie die endoskopische Gerät durch abdecken des Teleskops (1,9 mm Durchmesser) mit einer Länge von 10 cm mit der endoskopischen Untersuchung Scheide. Reinigen Sie und sterilisieren Sie das Endoskop mit Wasser und Ethanol.
   2. Schalten Sie den Computer, die einstellbare Xenon-Lichtquelle und das Kameramodul, und setzen Sie den Fokus in einer Weise, dass Objekte in der Nähe der Linse ein klares Bild geben.
   3. Verbinden Sie die Luftpumpe mit der endoskopischen Mantel. Um den Luftstrom zu visualisieren, Tauchen Sie die Spitze des Endoskops in ein Becherglas mit Wasser gefülltes Glas. Regulieren Sie den Luftstrom durch die Einstellung des Ventils zwischen der Luftpumpe und der endoskopischen Mantel. Anpassen, um eine langsame, konstante Luftstrom, reflektiert durch ein paar ständig aufsteigende Luftblasen.
   4. Legen Sie eine Maus in einer auslaufsicheren Kammer. Induzieren Anästhesie durch Einatmen von bis zu 4 % Isofluran bis die Maus bewusstlos ist. Analgesie und einem abwesenden Zustand der Reflexe durch den Verlust der aufrichtenden Reflex-Tests zu bestätigen und der anschließenden Verlust des Pedals zurückziehen Reflex.
   5. Verwenden Sie eine entsprechende tierärztliche Anästhesiegerät gemäß dem tierischen Protokoll verwendet. Übertragen Sie die Maus aus der Kammer in der Koloskopie-Arbeitsbereich. Position der narkotisierten Maus, mit der Nase in das Nosecone (die an das Anästhesie-Gerät angeschlossen ist), auf eine saubere arbeiten hier, Scheide, dass die Maus in Bauchlage, ist mit Blick auf den Experimentator mit seiner Hinterhand.
   6. Um Anästhesie während der Koloskopie-Verfahrens beibehalten, reduzieren Sie die Isofluran-Konzentration um ca. 2 %. Überwachen Sie der Maus Atmung und Reaktion auf die Stimulation während der Koloskopie und passen Sie Isofluran-Konzentration in den Verdampfer bei Bedarf an. Decken Sie die Maus Augen mit Salbe zu verhindern, dass sie immer trocken.
   7. Steuern Sie die Wirksamkeit der Narkose durch Einklemmen zwischen den Zehen der Maus. Fahren Sie im Fall des abwesenden Reaktivität mit Schritt 3.1.8.
   8. Heben Sie die Rute knapp über die Wurzel der Rute mit einer Hand und legen Sie das Endoskop, positioniert in der anderen Hand über den After in den Enddarm.
   9. Während der Luftstrom die Darm-Lumen bläst, bewegen Sie langsam und vorsichtig das Endoskop nach vorn in aboraler Richtung.
   10. Setzen Sie das Endoskop in der Mitte das Kolon Lumen und halten Sie diese Stellung, um Kontakt mit der Kolon Wand zu minimieren und zu verhindern, dass Kratzer, tiefer Wand-in Verbindung stehenden Verletzungen (z.B., was zu Blutungen), oder auch Wand-Perforation (siehe Schritt 3.1.17) . Steuern Sie diesen Schritt, indem Sie dauerhaft beobachten den video-Stream (d. h. unter ständiger Visualisierung des Kolon-Fachs).
   11. Wenn Kot die Ansicht verengen, entfernen Sie das Endoskop und führen Sie einen Einlauf durch rektal Spülen mit bis zu 2 mL Kochsalzlösung, mit einer weichen Pasteurpipette. Verwenden Sie als wenig Flüssigkeit wie möglich, um eine unbeabsichtigte Verdünnung von Kot und andere sekundäre Effekte negativ auf die Eigenschaften der Schleimhautoberfläche und letztendlich die Bewertungsergebnisse zu verhindern.
   12. Versuchen Sie, regelmäßig das Endoskop an einer definierten position (d.h., unterschiedliche) anatomischen Ort im distalen Dickdarm, das Punktesystem von Kolon Entzündung zu standardisieren und die Vergleichbarkeit der scoring-Ergebnisse zwischen Mäusen und über Experimente zu optimieren.
       Hinweis: Normalerweise mit dem starren Endoskop, eine maximale Tiefe von 4 cm über den rektalen Weg erreichbar. Zwischen 2 und 4 cm verwandelt sich aborally, der Darm regelmäßig eine Biegung, die nicht mit der starren Koloskop übertragen werden. Verwenden Sie die Doppelpunkt Region distal angrenzend an die Biegung als die Standardwertung vor Ort.
   13. Starten Sie den Videostream aufnehmen und beginnen mit der Wertung der Entzündung.
   14. Bewerten Sie die GvHD-bezogene Entzündung des Dickdarms erzielte die Parameter erklärt und in Tabelle 1 und Abbildung 3dargestellt.
       1. Bewegen Sie das Endoskop in das scoring Stelle sanft und leicht zurück - und nach vorne, um die verschiedenen Parameter zu bewerten.
       2. Bewerten Sie den Parameter "Durchsichtigkeit" sowie die "Stuhlkonsistenz", durch die Positionierung des Endoskops in einer größeren Entfernung in Bezug auf das Kolon Wand.
       3. Der Parameter "Granularität" und "Vaskularität" durch die Positionierung des Endoskops in unmittelbarer Nähe der Kolon Wand zu beurteilen. Anzuwenden Sie für diese Aufgabe sorgfältig wohldosierte Spannung an das Kolon Wand mit der Spitze des Endoskops.
   15. Nach Abschluss der scoring-Verfahren stoppen der Aufnahme.
       Hinweis: Danach kann die aufgezeichneten video-Clip verwendet insgesamt oder repräsentative Bilder (z.B. Screenshots) der Mini-endoskopisch bewerteten Kriterien insgesamt einen Beitrag zur Darmspülung Entzündung generieren verwendet werden.
   16. Entfernen Sie vorsichtig das Endoskop.
   17. Beenden Sie Isofluran Ausstellung durch die Übertragung der Maus auf einem separaten Käfig in dem Umgebungsluft ausgesetzt ist. Die Maus mit einer Rotlicht-Lampe warm und die Maus zu beobachten, bis es aus der Narkose erholt und vollem Bewusstsein wiedergewinnt.
       Hinweis: Durch die Luft Inflation des Dickdarms während der Endoskopie möglicherweise der Bauchregion der Maus direkt danach aufgeblasen angezeigt. Während dies normal ist und der Vergänglichkeit, möglicherweise längere Zeichen der massiven und sogar progressive Inflation des Bauches und Scheitern der Wiederherstellung der Maus eine unbeabsichtigte Perforation des Dickdarms (in diesem Fall muss die Maus eingeschläfert werden (sofort).
   18. Platzieren Sie nach der vollständigen Wiederherstellung den Mauszeiger wieder in seinem jeweiligen Käfig.
   19. Optionale Ansatz: Es ist auch möglich, Ansicht-geführte Gewebebiopsien zu nehmen. Führen Sie die folgenden Schritte.
       Hinweis: Die Darmspiegelung erfolgt auf die gleiche Weise wie in 3.1.1 - 3.1.18., mit den folgenden Änderungen beschrieben.
       1. Verwenden Sie im Schritt 3.1.1 eine endoskopische Untersuchung Mantel mit einem integrierten Arbeitskanal, statt einer einfachen Untersuchung Hülle ohne Arbeitskanäle, für die Deckung des Teleskops. Führen Sie eine Biopsiezange in den Arbeitskanal ein, bis seine Spitze nur vor das Endoskop auf dem Bildschirm sichtbar ist, weil dies weitgehend unbeabsichtigten Verletzungen in den Darm verhindert.
       2. Fahren Sie mit den Schritten 3.1.2 - 3.1.11. Legen Sie das Endoskop in den Dickdarm und drücken Sie es vorsichtig nach vorn an die Stelle von Interesse.
       3. Beschäftigen Sie Hilfe von einer zweiten Experimentator für die Aufgabe, Kolon Gewebebiopsien. Fragen Sie den zweiten Experimentator navigieren die Spitze der Biopsiezange Kolon dieses Wahl durch Drücken der Zange in den Arbeitskanal langsam nach vorne, bis die Backen der Zange geöffnet werden können. Ständig sehen Sie den video-Stream während dieses Verfahrens zur Minimierung des Risikos die Kolon Wand zu verletzen.
       4. Wiederherstellen Sie, indem Sie vorsichtig öffnen und Schließen der Kiefer von der Biopsiezange eine Gewebeprobe Kolon Wand.
          Hinweis: Tun Sie dies mit Vorsicht um die Perforation der Kolon Wand zu verhindern. Im seltenen Fall einer Kolon Perforation sofort zu Opfern der betroffenen Maus anhand von Messungen gemäß den Richtlinien und unter die kontinuierliche Verabreichung von Anästhetika.
       5. Ziehen Sie zurück und entfernen Sie die geschlossene Zange aus dem Arbeitskanal. Entfernen Sie die Probe aus dem Rachen der Biopsiezange durch Eintauchen und vorsichtig schütteln die geöffnete Zange in sterilen PBS-Lösung. Danach wählen Sie ordnungsgemäße Lagerung für die Gewebeprobe im Einklang mit den geplanten nachgeschalteten Analysen. Nach der Desinfektion mit 70 % Ethanol könnte die Zange wiederverwendet werden, um weitere Biopsien zu ergreifen.
       6. Entfernen Sie nach der Einnahme von Biopsien das Endoskop und beenden Sie die Koloskopie wie 3.1.16 - 3.1.18. beschrieben.
2. Histopathologische Analyse
   1. Zwischen 26 und 30 nach der Röntgenbestrahlung Tag einschläfern Sie allo-HCT Empfänger Mäuse nach Anwendung von institutionellen Vorgaben und Behörden. Hierzu die Mäuse durch das Einatmen von 5 % Isofluran zu betäuben. Fahren Sie mit der Isofluran-Belichtung für 1 min nach Verhaftung zu atmen und bestätigen Sie Euthanasie durch zervikale Dislokation. Desinfizieren Sie gründlich das Fell und die Haut der Maus mit 70 % Ethanol.
   2. Die Bauchhöhle zu öffnen und den Darm entfernen. Auf einer Petrischale (mit einem Durchmesser von 92 mm) mit PBS übertragen.
   3. Füllen Sie einen 5 mL Flaschenspitze mit PBS. Mit Hilfe einer Pinzette Semken mit einer Länge von 13 cm und gezackten gebogenen Spitzen Slip der distale Teil des Dickdarms (ca. 5 mm) über die Spitze des die Flaschenspitze. Sorgfältig den Doppelpunkt mit der Zange auf die Flaschenspitze zu beheben und bündig Dickdarms mit PBS durch herunterdrücken des Kolbens die Flaschenspitze um Kot aus dem Darm zu entfernen.
   4. Ein Kolon Segment befindet sich ca. 5 mm aus dem Anus, mit einem Skalpell ausgeschnitten.
   5. Fixieren der resezierten Darm Probe in 4,5 % Formaldehyd über Nacht. Legen Sie vor der Einbettung in Paraffin das Gewebe in einer aufrechten Position.
   6. Schnitt 3 µm Querschnitte von Paraffin-eingebetteten Doppelpunkt Gewebe und mit Hämatoxylin und Eosin (HE), färben, Färbung Standardprotokolle verwenden.
   7. HE-gefärbten Querschnitte von Doppelpunkt Gewebeproben vorzubereiten.
   8. Adaptiert von scoring Matrix von Kaplan Et Al.¹²berichtet, histopathologisch Punkten der entzündliche Aktivität semiquantitatively, mit Noten von 0-3: keine Entzündung (Score = 0), leichte Entzündung (Score = 1), mäßige Entzündung (Punktzahl = 2), und schwere Entzündungen (Score = 3).
      Hinweis: Im Idealfall für diese Aufgabe beschäftigen Sie die Expertise von einem Pathologen, die bei der Bewertung der murinen Darm GvHD erlebt und auf die Art des experimentellen und Kontrollgruppen geblendet ist.

Ergebnisse

Das aktuelle Protokoll beschreibt die Mini-endoskopische Bewertung der intestinalen GvHD-assoziierten Läsionen des distalen Colon wurde etabliert und validiert bei Mäusen, die vorher zur systemischen Induktion eines schweren akuten GvHD-Modells unterzogen. In dieser Studie verwendeten wir eine MHC-Klasse, die ich vollständig Modellsystem in welche BALB/c Mäuse letal bestrahlten übereinstimmende wurden, gefolgt von T-Zelle-abgereicherte Allogene Knochenmark-Transplantation und die Ver...

Diskussion

Das Protokoll beschreibt die Methode der Induktion und Mini-endoskopische Beurteilung des Kolon Phänotyps im Zuge der intestinalen GvHD beobachtet. Es dient breiter ermöglichen Wissenschaftlern, Darm GvHD längs und nicht-invasiv über den gesamten Krankheitsverlauf (z.B. durch das Auftreten von Kolon Manifestation und Verlauf bis maximale Krankheitsaktivität) zu studieren.

Allerdings gibt es einige wichtige Schritte und wichtige Einschränkungen, die die vorgestellten Methoden muss der Exp...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator	Gamma-Service Meical GmbH
Phosphate-buffered saline (PBS )	Sigma-Aldrich Co. LLC.	D8662-6x500ML
Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips)	Fine Science Tools	11009-13
Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm)	Fine Science Tools	14090-09
RPMI-1640 Medium	Sigma-Aldrich Co. LLC.	R8758-500ML
Hypodermic needle (26 G)	B. Braun Melsungen AG	4657683
1 mL syring	B. Braun Melsungen AG	9166017V
50 mL tube	Sarstedt Ag & Co.KG	62,547,254
Cell strainer with a 40 µm mesh screen	BD Falcon	352340
Ammonium chloride (NH4Cl)	Sigma-Aldrich Co. LLC.	11209	ingredient of ACK lysing buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA)	Carl Roth GmbH & Co.KG	8043.2	ingredient of ACK lysing buffer
Potassium bicarbonate (KHCO3)	Merck KGaA	1,048,540,500	ingredient of ACK lysing buffer
CD90.2 MicroBeads, mouse	Miltenyi Biotec GmbH	130-049-101	magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells
Pan T Cell Isolation Kit II, mouse	Miltenyi Biotec GmbH	130-095-130	magnet cell separation to isolate splenic T cells
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731)	Biolegend	109822
Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645)	Biolegend	100214
FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691)	Biolegend	100406
PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168)	Biolegend	110730
APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753)	Biolegend	100714
Filtrated bovine serum	Pan Biotec	P40-47500	ingredient of FACS buffer
96-well polystyrene V-bottom plates	Greiner Bio-One	651201
Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL)	Falcon	352052
BD LSRFortessa II flow cytometer	BD Bioscience Co.
Insulin syringe with sterile interior (30 G)	BD	324826
Oxy Vet Oxymat 3	Eickemeyer		oxygen concentrator  for anesthesia
NarkoVet	Eickemeyer	213062
Plexiglass chamber	Eickemeyer	214620
Straight Forward Telescope	KARL STORZ SE &Co KG	64301 AA	part of the experimental setup for colonoscopy
Protection and Examination Sheath	KARL STORZ SE &Co KG	61029 C	part of the experimental setup for colonoscopy
Examination Sheath with working channel	KARL STORZ SE &Co KG	61029 D	part of the experimental setup for colonoscopy
Biopsy Forceps	KARL STORZ SE &Co KG	61071 ZJ	part of the experimental setup for colonoscopy
175 Watt SCB XenonLight Source	KARL STORZ SE &Co KG	20132120	part of the experimental setup for colonoscopy
Fiber Optic Light Cable	KARL STORZ SE &Co KG	495 NL	part of the experimental setup for colonoscopy
Image 1 S3 Camera Head	KARL STORZ SE &Co KG	22220030	part of the experimental setup for colonoscopy
Image 1 SCB Camera Control Unit	KARL STORZ SE &Co KG	22200020	part of the experimental setup for colonoscopy
LCD monitor	Olympus	OEV181H	part of the experimental setup for colonoscopy
Forane / Isofluran	AbbVie Inc.	B506
Formaldehyde solution 37 %	Carl Roth GmbH & Co.KG	7398.1
5.0 mL Dispenser tip	Eppendorf AG	30089456