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Method Article
Qui, presentiamo un protocollo che descrive il trapianto di cellule staminali emopoietiche allogeniche e consente valutazioni ripetitivi mini-endoscopica del colon distale in situ per la presenza, caratteristiche e la severità di infiammazione colica all'interno dal vivo topi affetti da malattia intestinale graft - versus - host.
Malattia di acuta dell'innesto - contro - ospite (GvHD) rappresenta la complicazione più grave che i pazienti precedentemente sottoposti a faccia (allo-HCT) il trapianto di cellule staminali emopoietiche allogeniche e frequentemente è associata con un risultato clinico difficile. Mentre, per esempio, GvHD manifestazioni della pelle sono solitamente rispondenti alle terapie immune-soppressivi stabilite e sono, quindi, non prendendo un corso mortale, la presenza e l'intensità di GvHD intestinale, soprattutto delle parti metà inferiore dell'intestino, fortemente influenzare il risultato e nel complesso la sopravvivenza dei pazienti con acuta GvHD. opzioni terapeutiche sono essenzialmente limitata agli agenti immune-soppressivi classici cedendo solo moderati malattia-attenuare gli effetti. Quindi, conoscenza dettagliata circa la cascata immune residente in tessuto, cambiamenti del microbiota intestinale, e la risposta stromal prima, al momento e dopo l'inizio di GvHD intestinale sono urgentemente necessarie per comprendere gli eventi e i meccanismi sottostanti la patogenesi e a sviluppare opzioni terapeutiche innovative. Modelli murini di GvHD sono utilizzati spesso per identificare e valutare funzionalmente molecole e vie putativamente guida GvHD intestinale. Tuttavia, mezzi per monitorare e valutare l'infiammazione intestinale nel corso del tempo sono essenzialmente carenti poiché punteggi stabiliti per valutare e GvHD acuta di grado ordinariamente sono costituiti da vari parametri che riflettono piuttosto GvHD sistemica manifestazioni. La valutazione dettagliata di GvHD intestinale è stata limitata agli studi facendo uso dei topi eutanasizzati, escluse quindi essenzialmente longitudinale (cioè, cinetica) analisi del comparto Colico sotto una determinata condizione sperimentale (ad es., anticorpo-mediata blocco di una citochina proinflammatory) in topi dal vivo (cioè, in vivo). La valutazione in situ mini-endoscopica del colon distale dei topi allo-HCT-trattati qui descritto consente un) una dettagliata valutazione macroscopica dei diversi aspetti dell'infiammazione intestinale e b) la possibilità di raccogliere campioni di tessuto per analisi successive alle vari intervalli di tempo nel corso del periodo di osservazione. Nel complesso, l'approccio mini-endoscopico fornisce un avanzamento importante nel monitoraggio non invasivo preclinico e valutazione di GvHD intestinale.
Malignità ematopoietiche direttamente derivanti dal compartimento di cellule staminali ematopoietiche e incontrollata, rapida progressione e gravi disordini immune-mediati sono spesso indicazioni per eseguire allo-HCT1,2. Tuttavia, anche se la contabilità per l'avvenimento della risposta prognostica favorevole dell'innesto-contro-tumore, linfociti del donatore sono frequentemente inducendo e promuovere un attacco immune-mediata indesiderato delle componenti del tessuto sano all'interno il destinatario allo-HCT , un processo che viene chiamato malattia dell'innesto - contro - ospite3. Manifestazioni nell'intestino, il cosiddetto GvHD intestinale, rappresentano la complicazione più temuta di GvHD acuta, forme gravi di cui sono abitualmente associate con un alto tasso di mortalità1,2,4.
Nel complesso, murini modelli di allo-HCT sono emersi come preziosi strumenti per identificare e studiare il meccanismo immune-mediato la patogenesi di GvHD5. Tuttavia, valutazione cinetico di, per esempio, gli effetti benefici di nuovi interventi terapeutici nel corso del tempo nei topi dal vivo è ordinariamente basato su punteggi la determinazione di GvHD clinico6. Mentre questi punteggi sono adatti per riflettere, per esempio, il carico globale di malattia (cioè, la GvHD sistemica), clinico Spartiti mancanza la sensibilità per rispecchiare in modo affidabile le manifestazioni organo-specifici (ad esempio, nell'intestino). Quindi, conclusioni, per esempio riguardo agli effetti di gut-protettivo di un determinato intervento terapeutico, che si basano su questi sistemi di Punteggio di solito cadono a breve.
Nonostante importanti progressi attraverso l'invenzione del corpo intero romanzo modalità in combinazione con l'utilizzo di entrambi modelli mouse genetico bioluminescenti o fluorescente7,8, metodologie per direttamente e specificamente di formazione immagine valutare l'intestinale manifestazione di GvHD in topi dal vivo sono carenti. Quindi, la spiegazione razionale dietro il protocollo della valutazione endoscopica del fenotipo intestinale GvHD descritto nella sezione successiva è di superare questo ostacolo. Inoltre, la motivazione è anche per ridurre il numero di topi sperimentali dal momento che, finora, una valutazione dettagliata delle caratteristiche cellulari, morfologiche e molecolari (ad es., di istopatologia o biologia molecolare) di GvHD intestinale manifestazione ha infine ha richiesto il sacrificio del mouse sperimentale.
Nostra istituzione ha precedentemente segnalata sulla metodologia di valutazione endoscopica mini di manifestazioni coliche nel corso di colite syngeneic modelli9. Nel protocollo presentato qui, abbiamo perfezionato e adattato il colonoscopic scoring matrix per alloresponse-driven colite in topi dal vivo con GvHD intestinale dopo trapianto di alloreactive linfociti HCT e donatore in un MHC di classe completamente malassortiti impostazione . Abbiamo identificato quattro parametri adatti per riflettere lesioni coliche correlate a GvHD intestinale. Inoltre, abbiamo istituito un sistema che permette una classificazione messa a punto di qualsiasi singolo determinante, risultante in un nuovo punteggio che prontamente informa il lettore circa la gravità della GvHD intestinale presente in una specificata del mouse in un punto determinato momento. Analisi istopatologiche hanno confermato che un punteggio endoscopico sopra una certa soglia è attendibilmente la previsione infiammazione tissutale moderato--alto grado. Quindi, la valutazione endoscopica mini sembra rappresentare un sostituto di lavoro per l'istopatologia di parità aurea che ordinariamente richiede il sacrificio di topi sperimentali. D'importanza, questo protocollo può essere applicato a praticamente qualsiasi punto determinato momento e può essere usato ripetutamente nel corso della malattia10,11. Inoltre, in contrasto con l'utilizzo di approcci di bioluminescenza-dipendente, non richiede molto tempo e lavoro intenso come topi incrociando geneticamente modificati sono necessarie misure e, quindi, la metodologia può essere applicata su qualsiasi linea di mouse di interesse.
Presi insieme, dato il punto di vista clinico dannoso dei pazienti allo-HCT con GvHD intestinale severo, rapidi progressi scientifici e approfondire i meccanismi molecolari alla base della patogenesi immune sono urgentemente necessari. Allo stesso modo, considerazioni importanti, etici richiedono che il guadagno della conoscenza dovrebbe essere realizzato con l'utilizzo di un numero minimo di topi sperimentali. Quindi, entrambi riconosciuti crediti verso la comunità di ricerca esplorando GvHD intestinale può essere avanzata implementando valutazioni serie mini-endoscopica del colon nella catena di lavoro sperimentale per monitorare e grado GvHD intestinale in vivo sperimentale del topo modelli, come descritto e convalidato nel protocollo presentato qui.
I metodi sperimentali descritti qui sono stati approvati dal governo di Baviera, Baviera, Germania.
1. GvHD induzione
2. valutazione di GvHD sistemica
Nota: Eseguire questa procedura in un ambiente semi-sterile in una camera sperimentale, concesso in licenza e attrezzata per movimentazione topi dal vivo all'interno della struttura animale.
3. valutazione di GvHD intestinale
Il protocollo attuale, che descrive la valutazione mini-endoscopica delle lesioni associate a GvHD intestinale del colon distale, è stato stabilito e convalidato in topi precedentemente sottoposti ad induzione sistemica di un modello di GvHD acuto severo. In questo studio, abbiamo usato un MHC di classe mal adattato completamente sistema di modello in cui BALB/c topi sono stati irradiati letalmente, seguita da trapianto di T-cellula-esaurito allogeneic del midollo osseo e dall'amministra...
Il protocollo descrive la metodologia di induzione e mini-endoscopica valutazione del fenotipo Colico osservato nel corso della GvHD intestinale. Serve lo scopo più ampio di consentendo agli scienziati di studiare la GvHD intestinale longitudinalmente e non invadente nel corso intero della malattia (cioè, fin dall'inizio della manifestazione colica e progressione fino alle attività di malattia massima).
Tuttavia, ci sono alcuni passaggi critici e importanti limitazioni inerenti alle metodol...
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Questo studio è stato sostenuto dal Collaborative Research Center (CRC) 221 (CRC/TR221-DFG, #324392634; progetto B03) (a K.H.) e CRC 1181 (CRC-DFG, progetto B05) (a K.H.), entrambi finanziati dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator | Gamma-Service Meical GmbH | ||
Phosphate-buffered saline (PBS ) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | D8662-6x500ML | |
Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips) | Fine Science Tools | 11009-13 | |
Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm) | Fine Science Tools | 14090-09 | |
RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich Co. LLC. | R8758-500ML | |
Hypodermic needle (26 G) | B. Braun Melsungen AG | 4657683 | |
1 mL syring | B. Braun Melsungen AG | 9166017V | |
50 mL tube | Sarstedt Ag & Co.KG | 62,547,254 | |
Cell strainer with a 40 µm mesh screen | BD Falcon | 352340 | |
Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 11209 | ingredient of ACK lysing buffer |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA) | Carl Roth GmbH & Co.KG | 8043.2 | ingredient of ACK lysing buffer |
Potassium bicarbonate (KHCO3) | Merck KGaA | 1,048,540,500 | ingredient of ACK lysing buffer |
CD90.2 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-049-101 | magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells |
Pan T Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-095-130 | magnet cell separation to isolate splenic T cells |
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731) | Biolegend | 109822 | |
Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645) | Biolegend | 100214 | |
FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691) | Biolegend | 100406 | |
PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168) | Biolegend | 110730 | |
APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753) | Biolegend | 100714 | |
Filtrated bovine serum | Pan Biotec | P40-47500 | ingredient of FACS buffer |
96-well polystyrene V-bottom plates | Greiner Bio-One | 651201 | |
Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL) | Falcon | 352052 | |
BD LSRFortessa II flow cytometer | BD Bioscience Co. | ||
Insulin syringe with sterile interior (30 G) | BD | 324826 | |
Oxy Vet Oxymat 3 | Eickemeyer | oxygen concentrator for anesthesia | |
NarkoVet | Eickemeyer | 213062 | |
Plexiglass chamber | Eickemeyer | 214620 | |
Straight Forward Telescope | KARL STORZ SE &Co KG | 64301 AA | part of the experimental setup for colonoscopy |
Protection and Examination Sheath | KARL STORZ SE &Co KG | 61029 C | part of the experimental setup for colonoscopy |
Examination Sheath with working channel | KARL STORZ SE &Co KG | 61029 D | part of the experimental setup for colonoscopy |
Biopsy Forceps | KARL STORZ SE &Co KG | 61071 ZJ | part of the experimental setup for colonoscopy |
175 Watt SCB XenonLight Source | KARL STORZ SE &Co KG | 20132120 | part of the experimental setup for colonoscopy |
Fiber Optic Light Cable | KARL STORZ SE &Co KG | 495 NL | part of the experimental setup for colonoscopy |
Image 1 S3 Camera Head | KARL STORZ SE &Co KG | 22220030 | part of the experimental setup for colonoscopy |
Image 1 SCB Camera Control Unit | KARL STORZ SE &Co KG | 22200020 | part of the experimental setup for colonoscopy |
LCD monitor | Olympus | OEV181H | part of the experimental setup for colonoscopy |
Forane / Isofluran | AbbVie Inc. | B506 | |
Formaldehyde solution 37 % | Carl Roth GmbH & Co.KG | 7398.1 | |
5.0 mL Dispenser tip | Eppendorf AG | 30089456 |
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