Induzione di intestinale Graft - versus - host Disease e sua valutazione endoscopica Mini in topi dal vivo

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo che descrive il trapianto di cellule staminali emopoietiche allogeniche e consente valutazioni ripetitivi mini-endoscopica del colon distale in situ per la presenza, caratteristiche e la severità di infiammazione colica all'interno dal vivo topi affetti da malattia intestinale graft - versus - host.

Abstract

Malattia di acuta dell'innesto - contro - ospite (GvHD) rappresenta la complicazione più grave che i pazienti precedentemente sottoposti a faccia (allo-HCT) il trapianto di cellule staminali emopoietiche allogeniche e frequentemente è associata con un risultato clinico difficile. Mentre, per esempio, GvHD manifestazioni della pelle sono solitamente rispondenti alle terapie immune-soppressivi stabilite e sono, quindi, non prendendo un corso mortale, la presenza e l'intensità di GvHD intestinale, soprattutto delle parti metà inferiore dell'intestino, fortemente influenzare il risultato e nel complesso la sopravvivenza dei pazienti con acuta GvHD. opzioni terapeutiche sono essenzialmente limitata agli agenti immune-soppressivi classici cedendo solo moderati malattia-attenuare gli effetti. Quindi, conoscenza dettagliata circa la cascata immune residente in tessuto, cambiamenti del microbiota intestinale, e la risposta stromal prima, al momento e dopo l'inizio di GvHD intestinale sono urgentemente necessarie per comprendere gli eventi e i meccanismi sottostanti la patogenesi e a sviluppare opzioni terapeutiche innovative. Modelli murini di GvHD sono utilizzati spesso per identificare e valutare funzionalmente molecole e vie putativamente guida GvHD intestinale. Tuttavia, mezzi per monitorare e valutare l'infiammazione intestinale nel corso del tempo sono essenzialmente carenti poiché punteggi stabiliti per valutare e GvHD acuta di grado ordinariamente sono costituiti da vari parametri che riflettono piuttosto GvHD sistemica manifestazioni. La valutazione dettagliata di GvHD intestinale è stata limitata agli studi facendo uso dei topi eutanasizzati, escluse quindi essenzialmente longitudinale (cioè, cinetica) analisi del comparto Colico sotto una determinata condizione sperimentale (ad es., anticorpo-mediata blocco di una citochina proinflammatory) in topi dal vivo (cioè, in vivo). La valutazione in situ mini-endoscopica del colon distale dei topi allo-HCT-trattati qui descritto consente un) una dettagliata valutazione macroscopica dei diversi aspetti dell'infiammazione intestinale e b) la possibilità di raccogliere campioni di tessuto per analisi successive alle vari intervalli di tempo nel corso del periodo di osservazione. Nel complesso, l'approccio mini-endoscopico fornisce un avanzamento importante nel monitoraggio non invasivo preclinico e valutazione di GvHD intestinale.

Introduzione

Malignità ematopoietiche direttamente derivanti dal compartimento di cellule staminali ematopoietiche e incontrollata, rapida progressione e gravi disordini immune-mediati sono spesso indicazioni per eseguire allo-HCT^1,2. Tuttavia, anche se la contabilità per l'avvenimento della risposta prognostica favorevole dell'innesto-contro-tumore, linfociti del donatore sono frequentemente inducendo e promuovere un attacco immune-mediata indesiderato delle componenti del tessuto sano all'interno il destinatario allo-HCT , un processo che viene chiamato malattia dell'innesto - contro - ospite³. Manifestazioni nell'intestino, il cosiddetto GvHD intestinale, rappresentano la complicazione più temuta di GvHD acuta, forme gravi di cui sono abitualmente associate con un alto tasso di mortalità^1,2,4.

Nel complesso, murini modelli di allo-HCT sono emersi come preziosi strumenti per identificare e studiare il meccanismo immune-mediato la patogenesi di GvHD⁵. Tuttavia, valutazione cinetico di, per esempio, gli effetti benefici di nuovi interventi terapeutici nel corso del tempo nei topi dal vivo è ordinariamente basato su punteggi la determinazione di GvHD clinico⁶. Mentre questi punteggi sono adatti per riflettere, per esempio, il carico globale di malattia (cioè, la GvHD sistemica), clinico Spartiti mancanza la sensibilità per rispecchiare in modo affidabile le manifestazioni organo-specifici (ad esempio, nell'intestino). Quindi, conclusioni, per esempio riguardo agli effetti di gut-protettivo di un determinato intervento terapeutico, che si basano su questi sistemi di Punteggio di solito cadono a breve.

Nonostante importanti progressi attraverso l'invenzione del corpo intero romanzo modalità in combinazione con l'utilizzo di entrambi modelli mouse genetico bioluminescenti o fluorescente^7,8, metodologie per direttamente e specificamente di formazione immagine valutare l'intestinale manifestazione di GvHD in topi dal vivo sono carenti. Quindi, la spiegazione razionale dietro il protocollo della valutazione endoscopica del fenotipo intestinale GvHD descritto nella sezione successiva è di superare questo ostacolo. Inoltre, la motivazione è anche per ridurre il numero di topi sperimentali dal momento che, finora, una valutazione dettagliata delle caratteristiche cellulari, morfologiche e molecolari (ad es., di istopatologia o biologia molecolare) di GvHD intestinale manifestazione ha infine ha richiesto il sacrificio del mouse sperimentale.

Nostra istituzione ha precedentemente segnalata sulla metodologia di valutazione endoscopica mini di manifestazioni coliche nel corso di colite syngeneic modelli⁹. Nel protocollo presentato qui, abbiamo perfezionato e adattato il colonoscopic scoring matrix per alloresponse-driven colite in topi dal vivo con GvHD intestinale dopo trapianto di alloreactive linfociti HCT e donatore in un MHC di classe completamente malassortiti impostazione . Abbiamo identificato quattro parametri adatti per riflettere lesioni coliche correlate a GvHD intestinale. Inoltre, abbiamo istituito un sistema che permette una classificazione messa a punto di qualsiasi singolo determinante, risultante in un nuovo punteggio che prontamente informa il lettore circa la gravità della GvHD intestinale presente in una specificata del mouse in un punto determinato momento. Analisi istopatologiche hanno confermato che un punteggio endoscopico sopra una certa soglia è attendibilmente la previsione infiammazione tissutale moderato--alto grado. Quindi, la valutazione endoscopica mini sembra rappresentare un sostituto di lavoro per l'istopatologia di parità aurea che ordinariamente richiede il sacrificio di topi sperimentali. D'importanza, questo protocollo può essere applicato a praticamente qualsiasi punto determinato momento e può essere usato ripetutamente nel corso della malattia^10,11. Inoltre, in contrasto con l'utilizzo di approcci di bioluminescenza-dipendente, non richiede molto tempo e lavoro intenso come topi incrociando geneticamente modificati sono necessarie misure e, quindi, la metodologia può essere applicata su qualsiasi linea di mouse di interesse.

Presi insieme, dato il punto di vista clinico dannoso dei pazienti allo-HCT con GvHD intestinale severo, rapidi progressi scientifici e approfondire i meccanismi molecolari alla base della patogenesi immune sono urgentemente necessari. Allo stesso modo, considerazioni importanti, etici richiedono che il guadagno della conoscenza dovrebbe essere realizzato con l'utilizzo di un numero minimo di topi sperimentali. Quindi, entrambi riconosciuti crediti verso la comunità di ricerca esplorando GvHD intestinale può essere avanzata implementando valutazioni serie mini-endoscopica del colon nella catena di lavoro sperimentale per monitorare e grado GvHD intestinale in vivo sperimentale del topo modelli, come descritto e convalidato nel protocollo presentato qui.

Protocollo

I metodi sperimentali descritti qui sono stati approvati dal governo di Baviera, Baviera, Germania.

1. GvHD induzione

1. Giorno 0: Irradiazione dal corpo intero dei topi destinatari
   1. Utilizzare femmina CD45.2⁺ H2kd⁺ BALB/c topi che sono almeno 10 settimane di vita come destinatari.
   2. Pesare e registrare il peso dei topi destinatari prima di induzione di GvHD.
      Nota: Assicurarsi che il destinatario abbia un peso corporeo minimo di 20 g. Il peso corporeo iniziale servirà come valore di riferimento per calcolare la perdita di peso del mouse individuo nel corso della GvHD induzione e progressione.
   3. Inserire fino a cinque topi nel contenitore dell'irradiatore di raggi x.
   4. Irradiare i topi da irradiazione corporea totale con una singola dose di 8 Gy di raggi x. Utilizzare Cs¹³⁷ come una sorgente di radiazione.
2. Giorno 1: Ricostituzione dei topi irradiati con T-cellula-esaurito del midollo osseo
   NOTA:Il trapianto delle cellule del midollo osseo allogenico, come delineato e dettagliate nella sezione 1.2, dovrebbe avvenire entro 24 ore dopo l'irradiazione. Eseguire le procedure descritte di seguito in una coltura di tessuto sterile del cappuccio e usare reagenti filtrati. Uso allogenico CD45.1/Ly5.1 B6. SJL-Ptprca Pepcb/ BoyCrl topi come donatori di midollo osseo di T-cellula-esaurito.
   1. Eutanasia CD45.1/Ly5.1 B6. Topi SJL che doneranno allogeneic del midollo osseo cellule secondo le linee guida istituzionali, 12-24 h dopo l'irradiazione dei topi BALB/c destinatari. Per questo, anestetizzare la B6 CD45.1/Ly5.1. Topi SJL da inalazione di 5% isoflurane. Continuare con l'esposizione di isoflurane oltre 1 min dopo arresto di respirazione e confermare l'eutanasia di dislocazione cervicale.
   2. Disinfettare il pelo e la pelle del mouse accuratamente con etanolo al 70%.
   3. Posizione il mouse su un pulito lavorando guaina affinché il mouse si trova in una posizione prona, con suo quarti posteriori lo sperimentatore di fronte. Sollevare il tallone di Achille con la punta di un forcipe Semken con una lunghezza di 13 cm e punte zigrinate curvi la pelliccia. Incidere la pelle tra le pinze e il tallone con le forbici bene indurito 8,5 cm con punte diritte.
   4. Allungare l'incisione cranialmente (cioè, dal tallone sopra la gamba e coscia nella regione dell'anca). Rimuovere la pelle e la pelliccia dall'arto con l'aiuto delle pinze.
   5. Eseguire la stessa procedura su altro arto hind.
   6. Rimuovere le zampe da taglio attraverso le articolazioni dell'anca adiacente.
   7. Tagliare via le zampe posteriori. Tagliare attraverso l'articolazione del ginocchio. Memorizzare la coscia e il gambo di ogni insieme in una capsula Petri 92 mm riempito con soluzione tampone fosfato salino (PBS) sul ghiaccio dell'arto.
   8. Pulire accuratamente le ossa di femore e tibia rimuovendo tanto tessuto muscolare possibile da ogni coscia e tibia. Trasferire le ossa di femore e tibia per un tubo da 50 mL riempito con mezzo RPMI 1640 sterile e posto sul ghiaccio bagnato fino a quando tutte le ossa tibia e femore raccolti nel passaggio 1.2.7 vengono puliti dal tessuto muscolare.
   9. Per isolare il midollo osseo, trasferire un osso del femore o della tibia alla volta (che è stato pulito come descritto nel passo 1.2.8) dal tubo 50 mL per una piastra Petri (con un diametro di 92 mm) riempito con medium RPMI 1640. Tagliare le estremità del femore o tibia con un bisturi per ottenere l'accesso alla cavità dell'osso contenente il midollo osseo.
   10. Preparare una provetta di raccolta di 50 mL con 5 mL di terreno RPMI 1640. Inserire un ago 26 G attaccato ad una siringa da 1 mL riempita con 1 mL di terreno RPMI 1640 nella cavità dell'osso e lavare il midollo osseo fuori della cavità nel tubo di raccolta premendo lo stantuffo.
   11. Ripetere il passaggio 1.2.10 fino a quando l'osso appare luminosa e splendente (cioè, la cavità dell'osso è visibilmente privo di rossastro del midollo osseo). Scartare l'osso vuoto.
   12. Ripetere i passaggi 1.2.9 - 1.2.11, utilizzando tutte le ossa del femore e la tibia dal punto 1.2.8 e raccogliere tutti i pezzi recuperati del midollo osseo nello stesso tubo 50 mL collezione dal passaggio 1.2.10. Tenere il tubo di raccolta su ghiaccio bagnato fino a quando tutte le ossa dal punto 1.2.8 sono state elaborate di conseguenza.
   13. Creare una sospensione unicellulare pipettando delicatamente su e giù i pezzi del midollo osseo arrossato, friabile. Filtrare la sospensione di singole cellule di midollo osseo attraverso un colino di cella 40 µm maglia schermo posizionato su un nuovo tubo di raccolta di 50 mL.
   14. Centrifugare la provetta di raccolta da 50 mL contenente la sospensione di singole cellule del midollo osseo a 450 x g per 5 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.
   15. Risospendere il pellet in 5 mL di tampone lisante ACK (1 mM Na₂EDTA; 10 mM KHCO₃; 144 mM NH₄Cl; pH 7.2) per lisi di globuli rossi. Incubare la sospensione cellulare per 3 min a temperatura ambiente. In seguito, immediatamente aggiungere 10 mL di soluzione PBS alla sospensione di cellule.
   16. Centrifugare la sospensione a 450 x g per 5 min a 4 ° C. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in 2 mL di soluzione di PBS.
   17. Contare le cellule del midollo osseo, utilizzando un emocitometro. Conservare un'aliquota di 6 x 10⁶ cellule per l'analisi di citometria a flusso verificare la purezza delle cellule dopo la purificazione delle cellule (Vedi punto 1.2.20).
   18. Per lo svuotamento delle cellule di T dalla sospensione di singole cellule di midollo osseo, utilizzare un kit di purificazione cellulare disponibile in commercio. Magneticamente vuotare le cellule CD90.2⁺ (cioè, linfociti) dalle cellule del midollo osseo totale, seguendo il protocollo del produttore.
   19. Contare le celle di T-cellula-esaurito del midollo osseo che sono state isolate come descritto nel passaggio 1.2.18, utilizzando un emocitometro. Conservare un'aliquota di 1 x 10⁶ cellule per l'analisi di citometria a flusso da eseguire in seguito come descritto nel passaggio 1.2.20.
       Nota: Il rendimento delle celle in media derivato dal mouse di un donatore è di solito da 2 x 10⁷ a 3,4 x 10⁷ cellule di T-cellula-esaurito del midollo osseo.
   20. Confermare un successo svuotamento del T-cell di citometria a flusso. Macchia di 1 x 10⁶ cellule, conservate da passaggi 1.2.17 (cellule del midollo osseo prima separazione magnetica delle cellule) e 1.2.19 (cellule di T-cellula-esaurito del midollo osseo dopo separazione magnetica delle cellule), con i seguenti anticorpi: α-CD45.1 (A20), α-CD3 (17A2), α-CD4 ( GK1.5) e α-CD8α (53-6,7). Utilizzare le celle rimanenti dal punto 1.2.17 come controllo non macchia e per singolo-macchiatura controlli, impostare il citometro a flusso.
       1. Transfer 1 x 10⁶ celle da ciascun campione in un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con una carena a V per eseguire il flusso cytometric procedura di colorazione.
       2. Rotazione verso il basso le cellule all'interno della piastra a 96 pozzetti (fase 1.2.20.1) a 450 x g per 5 min a 4 ° C. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in 100 µ l di tampone di FACS (PBS supplementato con 3% filtrato siero bovino).
       3. Centrifugare le cellule all'interno della piastra a 96 pozzetti a 450 x g per 5 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.
       4. Aggiungere una quantità appropriata dell'anticorpo di scelta (confronta con passo 1.2.20) i campioni per la colorazione del singolo in 100 µ l di tampone di FACS.
       5. Preparare una miscela di tutti gli anticorpi (mix master) contenente gli importi necessari sufficienti a macchiare separatamente le aliquote di cellule del midollo osseo conservate dal Priore (Vedi punto 1.2.17) e dopo (Vedi punto 1.2.19) magnetico svuotamento del T-cell. Aggiungere 100 µ l di master mix di entrambe le aliquote.
       6. Aggiungere 100 µ l di tampone di FACS al campione senza macchia.
       7. Incubare le cellule all'interno della piastra a 96 pozzetti per 20 min a 4 ° C al buio.
       8. Aggiungere 100 µ l di tampone di FACS e centrifugare le cellule all'interno della piastra a 96 pozzetti a 450 x g per 5 min a 4 ° C. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in 100 µ l di tampone di FACS.
       9. Centrifugare le cellule a 450 x g per 5 min a 4 ° C. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in 250 µ l di tampone di FACS.
       10. Trasferire i campioni ad un tubo rotondo-fondo polistirolo da 5 mL e analizzarli con uno strumento di cytometer di flusso è in grado di rilevare le molecole fluorescenti che sono state usate per etichettare gli anticorpi utilizzati per caratterizzare i campioni di cellule (Vedi punto 1.2.20).
       11. Confrontare la composizione cellulare da prima e dopo la separazione magnetica delle cellule.
           Nota: Una purezza di circa il 95% CD45.1⁺CD3^– (cioè, midollo osseo T-cellula-esaurito) cellule all'interno del cancello dal vivo viene solitamente ottenuta.
   21. Lavare le sospensioni delle cellule del midollo osseo di T-cellula-esaurito 2 x con soluzione PBS (450 x g per 5 min a 4 ° C) e, infine, risospendere le cellule in soluzione di PBS, regolando la concentrazione cellulare di 5 x 10⁷ cellule/mL. Conservare le cellule su ghiaccio bagnato fino l'iniezione.
   22. Iniettare cellule T-cellula-esaurito del midollo osseo in topi destinatari, che sono stati irradiati il giorno prima (Vedi sezione 1.1).
       1. Posizionare il mouse sperimentale in una camera a tenuta stagna e inducono anestesia per inalazione fino al 4% isoflurane, fino a quando il mouse è privo di sensi. Confermare l'analgesia e perdita di coscienza testando la perdita del riflesso di raddrizzamento e la conseguente perdita del pedale prelevare riflesso.
       2. Iniettare cellule di 5 x 10⁶ T-cellula-esaurito del midollo osseo (cioè, 100 µ l di 5 x 10⁷ cellule/mL) contenente soluzione di PBS utilizzando una siringa da 1 mL con ago 30 G per via endovenosa nello spazio retrobulbare contenente il seno venoso.
3. 2 ° giorno: Trasferimento delle cellule T
   Nota: Eseguire le procedure descritte di seguito in un cappuccio sterili per coltura e usare reagenti filtrati. Utilizzare CD45.2 C57Bl/6 (selvaggio-tipo; Topi WT) come donatori per alloreactive T cellule. L'utilizzo di sistemi di marcatura Congenici permette il distinguishability tra destinatario (CD45.2⁺ H2kd⁺ Balb/c topi) e tipi di cellule emopoietiche del donatore (cellule del midollo osseo: CD45.1⁺ H2kb⁺ B6. Topi SJL; cellule T allogeniche: CD45.2⁺ H2kb⁺ C57/Bl6 topi).
   1. Eutanasia topi C57Bl/6 in conformità con l'applicazione di linee guida istituzionali e autorità. Di conseguenza, anestetizzare topi per inalazione con una concentrazione del 5% isoflurane. Proseguire l'esposizione di isoflurane 1 min dopo l'arresto di respirazione e confermare l'eutanasia di dislocazione cervicale. Disinfettare il pelo e la pelle del mouse accuratamente con etanolo al 70%.
   2. Posizionare un colino con un setaccio a maglie 40 µm su un tubo di raccolta da 50 mL. Rimuovere la milza e posizionatelo sopra il filtro.
   3. Con un pistone della siringa, sminuzzare la milza nel colino. Lavare il filtro e lo stantuffo della siringa con PBS per raccogliere tutti gli splenocytes.
   4. Centrifugare le cellule all'interno del tubo di raccolta di 50 mL a 450 x g per 5 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.
   5. Risospendere il splenocytes in 3 mL di tampone lisante ACK per lisare cellule rosse del sangue. Incubare la sospensione cellulare per 3 min., in seguito, aggiungere 10 mL di PBS e centrifugare le cellule a 450 x g per 5 min a 4 ° C. Eliminare il supernatante e risospendere il splenocytes in PBS.
   6. Contare le cellule della milza, utilizzando un emocitometro. Deviare una parte aliquota di 6 x 10⁶ cellule per l'analisi di citometria a flusso, per valutare la grandezza di purificazione nel passaggio 1.3.9.
   7. Per un totale CD3⁺ cellula T isolamento da splenocytes totale, utilizzare un kit di purificazione cellulare disponibile in commercio. Isolare le cellule di T spleniche, seguendo il protocollo del produttore.
   8. Contare il CD3 splenica⁺ T cellule isolate come descritto nel passo 1.3.7, utilizzando un emocitometro. Conservare un'aliquota di 1 x 10⁶ T cellule per l'analisi di citometria a flusso.
      Nota: La resa in media di T splenico delle cellule per donatore topo isolato dalle gamme di separazione magnetica delle cellule da 1.3 x 10⁷ a 2 x 10⁷ cellule.
   9. Confermano il successo dell'isolamento della T-cellula tramite flusso cytometry. Per una descrizione dettagliata del protocollo colorazione, conferire e seguire passaggi 1.2.20.1 - 1.2.20.10.
      1. Macchia di 1 x 10⁶ splenocytes di passaggi 1.3.6 (prima della separazione magnetica delle cellule) e 1.3.8 (dopo separazione magnetica cellulare) con i seguenti anticorpi: α-CD45.2 (104), α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) e α-CD8α (53-6,7).
      2. Utilizzare le celle rimanenti dal punto 1.3.6 come controllo non macchia e per la colorazione del singolo con i rispettivi anticorpi, per impostare il citometro a flusso.
      3. Confrontare la composizione cellulare prima e dopo la separazione magnetica delle cellule.
         Nota: Una purezza ≥ 95% di CD45.2⁺CD3⁺ T cellule all'interno del cancello dal vivo dei linfociti devono essere compiute.
   10. Lavare le T cellule 2 volte con PBS (450 x g per 5 min a 4 ° C) e, infine, risospendere le cellule in soluzione di PBS, regolando la concentrazione di cellule a 7 x 10⁶ cellule/mL. Conservare le cellule su ghiaccio fino l'iniezione.
   11. Iniettare alloreactive, cellule di T spleniche (Vedi punto 1.3.10) in topi BALB/c irradiati che hanno precedentemente ricevuto CD45.1⁺ cellule di T-cellula-esaurito del midollo osseo (Vedi punto 1.2.22).
       1. Inducono anestesia posizionando il mouse sperimentale in una camera a tenuta stagna in cui viene esposta per fino a 4% isoflurane, fino a quando non perde la sua coscienza. Confermare l'analgesia e perdita di coscienza testando la perdita del riflesso di raddrizzamento e la conseguente perdita del pedale prelevare riflesso.
       2. Iniettare 0,7 x 10⁶ alloreactive CD3⁺ T cellule utilizzando una siringa da 1 mL con ago 30 G   (cioè, 100 µ l di 7 x 10⁶ cellule/mL) contenente soluzione PBS (Vedi punto 1.3.10), per via endovenosa nel retrobulbar spazio dei topi, per indurre la GvHD. denominare questi topi come il gruppo sperimentale.
       3. Iniettare un diverso gruppo di topi con 100 µ l di PBS da solo, per via endovenosa in spazio retrobulbar e denominare questo gruppo come gruppo di controllo, successivamente chiamato "no-T-cellula-trapiantati (non) topi".

2. valutazione di GvHD sistemica

Nota: Eseguire questa procedura in un ambiente semi-sterile in una camera sperimentale, concesso in licenza e attrezzata per movimentazione topi dal vivo all'interno della struttura animale.

1. Seguire il decorso clinico di GvHD in topi individuali; in particolare, valutare e segnare i topi sperimentali 3 volte alla settimana per la presenza di sintomi clinici di GvHD, basato su un sistema di Punteggio descritto di seguito e adattato da un sistema di punteggio stabilito in precedenza da Cook et al.⁶.
   1. Pesare singolarmente ogni mouse, registra il peso e calcolare la perdita di peso di corpo fissato in riferimento al peso corporeo che è stato determinato prima dell'inizio dell'esperimento (corrispondente al 100%) il giorno 0 (punto 1.1.2). Punteggio ottenuto una perdita di peso di meno di 10% del peso iniziale con una perdita di peso di oltre il 25% di grado 3, una perdita di peso tra 10% e 25% con grado 1 e grado 0.
   2. Punteggio ottenuto il livello di attività di ogni mouse, discriminanti topi con un livello di attività normale (Punteggio = 0) da topi con un livello di attività moderatamente in diminuzione (Punteggio = 1) e nei topi con comportamento stazionario a meno che non sono esternamente stimolati (Punteggio = 2).
   3. Punteggio ottenuto la struttura della pelliccia, quindi discriminare una pelliccia normale, splendente e kempt (Punteggio = 0) da una pelliccia moderatamente arruffata (Punteggio = 1) e la presenza di macchie calvo (Punteggio = 2).
   4. Punteggio ottenuto la texture della pelle, pelle normale di discriminare (Punteggio = 0) da sporadiche macchie di scaling della pelle (ad es., presso la coda e le zampe) (Punteggio = 1) e ovvio ridimensionamento e aree di pelle irritata (Punteggio = 2).
   5. Analizzare la coerenza delle frazioni di sgabello secrete. Punteggio ottenuto sgabello con un normale (cioè, consistenza dura) con grado 0, sgabello con sgabello morbido e deformabile con grado 1 e sgabello senza alcuna consistenza e, quindi, con grave diarrea con grado 2.
   6. Riassumere tutti i parametri separatamente ha ottenuti un punteggio clinico massimo di 12 per topo.
2. Considerare e valutare i criteri di cessare l'esperimento a causa l'attuale livello di gravità di malattia del mouse individuo, secondo le linee guida istituzionali applicando e autorizzato protocollo animale.

3. valutazione di GvHD intestinale

1. Parziali di lesioni correlate a GvHD mini-endoscopia della regione distale del colon-retto
   NOTA:Eseguire questa operazione in un ambiente semisterile in una camera sperimentale, concesso in licenza e attrezzata per movimentazione topi dal vivo all'interno della struttura animale. Utilizzare una workstation mini-endoscopica che è approvata per l'uso di piccoli animali.
   1. Preparare il dispositivo endoscopico coprendo il telescopio (diametro di 1,9 mm) e una lunghezza di 10 cm con la guaina di esame endoscopico. Pulire e sterilizzare l'endoscopio con acqua ed etanolo.
   2. Accendere il computer, la fonte di luce allo xeno regolabili e il modulo della fotocamera e impostare lo stato attivo in modo che gli oggetti vicino alla lente dare un'immagine chiara.
   3. Collegare la pompa di aria per la guaina endoscopica. Per visualizzare il flusso di aria, immergere la punta dell'endoscopio in un Becher vetro riempito di acqua. Regolare il flusso d'aria regolando la valvola tra la pompa di aria e la guaina endoscopica. Regolare a un flusso di aria lento, costante, riflettuto da pochi continuamente crescente bolle.
   4. Posto un topo in una camera a tenuta stagna. Indurre l'anestesia per inalazione fino al 4% isoflurane fino a quando il mouse è privo di sensi. Confermare l'analgesia e uno stato assente dei riflessi testando la perdita del riflesso di raddrizzamento e la conseguente perdita del pedale prelevare riflesso.
   5. Utilizzare una macchina di anestesia veterinaria appropriato in conformità del protocollo animale utilizzato. Trasferire il mouse dalla camera all'area di lavoro di colonscopia. Qui, posizione il mouse anestetizzato, con il suo naso nel musetto (che è collegato allo strumento anestesia), in un ambiente pulito lavoro guaina in modo che il mouse si trova in una posizione prona, lo sperimentatore con suo quarti posteriori di fronte.
   6. Per mantenere l'anestesia durante la procedura di colonscopia, ridurre la concentrazione di isoflurano a circa il 2%. Monitorare la respirazione e la risposta alla stimolazione durante la colonscopia il mouse e se necessario, regolare la concentrazione di isoflurane presso il vaporizzatore. Coprire gli occhi del mouse con pomata per impedire loro di ottenere asciutto.
   7. Controllare l'efficacia dell'anestesia pizzicando tra le dita del mouse. In caso di assenza di reattività, passare al punto 3.1.8.
   8. Sollevare la coda appena sopra la radice della coda con una mano e inserire delicatamente l'endoscopio, posizionato in altra mano, attraverso l'ano nel retto.
   9. Mentre il flusso d'aria gonfia il lume del colon-retto, lentamente e con attenzione è possibile spostare l'endoscopio in avanti in direzione aborale.
   10. Posizionare l'endoscopio nel mezzo del lume colico e mantenere questa posizione al fine di minimizzare il contatto con la parete colica e per evitare di fare graffi, lesioni da parete più in profondità (ad es., con conseguente sanguinamento), o anche la perforazione della parete (Vedi punto 3.1.17) . Controllare questo passaggio definitivamente guardando il flusso video (cioè, sotto costante visualizzazione del compartimento Colico).
   11. Se le feci si restringono la vista, l'endoscopio ed eseguire un clistere sciacquando per via rettale con fino a 2 mL di soluzione fisiologica, usando una pipetta di Pasteur morbida. Utilizzare come poco liquido possibile, per impedire una diluizione involontaria di feci e altri effetti secondari influenzato negativamente le caratteristiche della superficie della mucosa e, infine, i risultati di punteggi.
   12. Cercare di posizionare regolarmente l'endoscopio in un definito (cioè, distinti) sede anatomica all'interno del colon distale per standardizzare le marcature di infiammazione colica e per ottimizzare la comparabilità dei risultati fra i topi e attraverso esperimenti.
       Nota: Normalmente, con l'endoscopio rigido, una profondità massima di 4 cm è raggiungibile per via rettale. Tra 2 e 4 cm aborally, colon regolarmente si trasforma in una flessione che non può essere passata con il colonscopio rigida. Utilizzare l'area del colon distale adiacente alla flessione come le marcature predefinito spot.
   13. Iniziare a registrare il flusso video e cominciare con le marcature di infiammazione.
   14. Valutare la GvHD legati infiammazione del colon segnando i parametri spiegato e rappresentato in tabella 1 e nella figura 3.
       1. Spostare l'endoscopio al segnando posto delicatamente e leggermente indietro - e avanti per valutare i diversi parametri.
       2. Valutare il parametro "traslucenza", nonché "la consistenza delle feci", posizionando l'endoscopio in una distanza più ampia rispetto la parete colica.
       3. Valutare i parametri "granularità" e "vascolarizzazione" posizionando l'endoscopio in prossimità della parete colica. Per questa attività, applicare con attenzione tensione ben dosato per la parete colica con la punta dell'endoscopio.
   15. Al completamento del processo di scoring, interrompere la registrazione.
       Nota: In seguito, il clip video registrato può essere utilizzato in totale o utilizzato per generare immagini rappresentative (cioè, screenshot) dei criteri mini-endoscopicamente valutati nel complesso che contribuiscono all'infiammazione del colon.
   16. Rimuovere con cautela l'endoscopio.
   17. Interrompere l'esposizione di isoflurane trasferendo il mouse ad una gabbia separata in cui è esposto all'aria ambiente. Caldo il mouse con una lampada a luce rossa e osservare il mouse finché recupera dall'anestetico e riacquista la piena consapevolezza.
       Nota: A causa dell'inflazione di aria del colon durante l'endoscopia, la regione addominale del mouse venga soffiata fino direttamente in seguito. Mentre questo è normale e di natura transitoria, prolungati segni di inflazione massiccia e anche progressiva dell'addome ed il guasto di recupero del mouse potrebbero indicare una perforazione accidentale del colon (in questo caso, il mouse ha bisogno di essere euthanized immediatamente).
   18. Al momento del ripristino completo, posizionare il mouse indietro nella sua gabbia rispettivo.
   19. Approccio opzionale: è anche possibile prendere le biopsie del tessuto vista-guida. Eseguire la procedura seguente.
       Nota: La colonscopia avverrà nello stesso modo come descritto ai punti 3.1.1 - 3.1.18, con le seguenti modifiche.
       1. Al punto 3.1.1, è necessario utilizzare una guaina di esame endoscopico con un canale di lavoro incorporato, invece di una guaina di esame semplice senza canali di lavoro, per la copertura del telescopio. Introdurre un forcipe di biopsia nel canale di lavoro fino a quando la sua punta è appena visibile davanti l'endoscopio a schermo video, perché questo impedisce in gran parte non intenzionale lesioni all'intestino.
       2. Procedere con procedura 3.1.2 - 3.1.11. Inserire l'endoscopio nel colon e spingere con attenzione in avanti al posto di interesse.
       3. Impiegare l'aiuto di un secondo sperimentatore per il compito di prendere le biopsie di tessuto colico. Chiedere il secondo sperimentatore per passare la punta della pinza biopsia nella regione colica di scelta premendo il forcipe all'interno del canale di lavoro lentamente in avanti fino a quando le ganasce delle pinze possono essere aperti. Durante questa procedura per ridurre al minimo il rischio di ferire la parete colica, guardare costantemente il flusso video.
       4. Recuperare un campione di tessuto della parete colica con attenzione aprendo e chiudendo le ganasce della pinza biopsia.
          Nota: Farlo con attenzione per evitare la perforazione della parete colica. Nel caso raro di una perforazione colica, sacrificare immediatamente il mouse interessato applicando misure in conformità con le linee guida istituzionali e sotto l'amministrazione degli anestetici.
       5. Tirare indietro e rimuovere le pinze chiuse fuori del canale di lavoro. Togliere il campione dalle ganasce della pinza biopsia immergendo e attentamente scuotendo il forcipe aperto nella soluzione PBS sterile. In seguito, scegliere condizioni di conservazione per il campione di tessuto, in conformità con le analisi previste a valle. Dopo la disinfezione con etanolo al 70%, le pinze possono essere riutilizzate per prendere ulteriori biopsie.
       6. Dopo aver preso le biopsie, rimuovere l'endoscopio e finire la colonscopia come descritto nei passaggi 3.1.16 - 3.1.18.
2. Analisi istopatologica
   1. Tra i giorni 26 e 30 dopo l'irradiazione con raggi x, eutanasia i topi destinatario allo-HCT in conformità con l'applicazione di autorità e le linee guida istituzionali. Per questo, anestetizzare i topi da inalazione di 5% isoflurane. Continuare con l'esposizione di isoflurane per 1 min dopo arresto di respirazione e confermare l'eutanasia di dislocazione cervicale. Disinfettare accuratamente il pelo e la pelle del mouse con etanolo al 70%.
   2. Aprire la cavità addominale e rimuovere i due punti. Trasferirlo in una capsula Petri (con un diametro di 92 mm) con PBS.
   3. Riempire una punta del dispensatore di 5 mL di PBS. Con l'aiuto di una pinzetta Semken con una lunghezza di 13 cm e punte zigrinate curvi, scivolare la parte distale del colon (circa 5 mm) sopra la punta della punta del dispensatore. Attentamente difficoltà i due punti con il forcipe presso la punta del dispensatore e svuotare il colon con PBS, premendo lo stantuffo della punta dell'erogatore per rimuovere le feci dall'intestino.
   4. Tagliare un segmento colico che si trova a circa 5 mm dall'ano, con l'aiuto di un bisturi.
   5. Fissare il campione di intestino resecato in 4,5% formaldeide durante la notte. Prima di incorporarlo in paraffina, posizionare il tessuto in posizione verticale.
   6. Taglio 3 µm sezioni trasversali di tessuto paraffina-incastonato del colon e macchia con ematossilina ed eosina (HE), utilizzando protocolli standard di colorazione.
   7. Preparare HE-macchiate di sezioni trasversali dei campioni di tessuto del colon.
   8. Adattato dalla matrice Punteggio riportata da Kaplan et al.¹², histopathologically segnare l'attività infiammatoria semiquantitativamente, con punteggi da 0-3: nessuna infiammazione (Punteggio = 0), lieve infiammazione (Punteggio = 1), moderare l'infiammazione (Punteggio = 2), e infiammazione severa (Punteggio = 3).
      Nota: Idealmente, impiegano per questo compito la competenza di un patologo che è esperto nella valutazione di GvHD intestinale murina e accecato la natura di quella sperimentale e gruppi di controllo.

Risultati

Il protocollo attuale, che descrive la valutazione mini-endoscopica delle lesioni associate a GvHD intestinale del colon distale, è stato stabilito e convalidato in topi precedentemente sottoposti ad induzione sistemica di un modello di GvHD acuto severo. In questo studio, abbiamo usato un MHC di classe mal adattato completamente sistema di modello in cui BALB/c topi sono stati irradiati letalmente, seguita da trapianto di T-cellula-esaurito allogeneic del midollo osseo e dall'amministra...

Discussione

Il protocollo descrive la metodologia di induzione e mini-endoscopica valutazione del fenotipo Colico osservato nel corso della GvHD intestinale. Serve lo scopo più ampio di consentendo agli scienziati di studiare la GvHD intestinale longitudinalmente e non invadente nel corso intero della malattia (cioè, fin dall'inizio della manifestazione colica e progressione fino alle attività di malattia massima).

Tuttavia, ci sono alcuni passaggi critici e importanti limitazioni inerenti alle metodol...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator	Gamma-Service Meical GmbH
Phosphate-buffered saline (PBS )	Sigma-Aldrich Co. LLC.	D8662-6x500ML
Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips)	Fine Science Tools	11009-13
Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm)	Fine Science Tools	14090-09
RPMI-1640 Medium	Sigma-Aldrich Co. LLC.	R8758-500ML
Hypodermic needle (26 G)	B. Braun Melsungen AG	4657683
1 mL syring	B. Braun Melsungen AG	9166017V
50 mL tube	Sarstedt Ag & Co.KG	62,547,254
Cell strainer with a 40 µm mesh screen	BD Falcon	352340
Ammonium chloride (NH4Cl)	Sigma-Aldrich Co. LLC.	11209	ingredient of ACK lysing buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA)	Carl Roth GmbH & Co.KG	8043.2	ingredient of ACK lysing buffer
Potassium bicarbonate (KHCO3)	Merck KGaA	1,048,540,500	ingredient of ACK lysing buffer
CD90.2 MicroBeads, mouse	Miltenyi Biotec GmbH	130-049-101	magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells
Pan T Cell Isolation Kit II, mouse	Miltenyi Biotec GmbH	130-095-130	magnet cell separation to isolate splenic T cells
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731)	Biolegend	109822
Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645)	Biolegend	100214
FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691)	Biolegend	100406
PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168)	Biolegend	110730
APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753)	Biolegend	100714
Filtrated bovine serum	Pan Biotec	P40-47500	ingredient of FACS buffer
96-well polystyrene V-bottom plates	Greiner Bio-One	651201
Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL)	Falcon	352052
BD LSRFortessa II flow cytometer	BD Bioscience Co.
Insulin syringe with sterile interior (30 G)	BD	324826
Oxy Vet Oxymat 3	Eickemeyer		oxygen concentrator  for anesthesia
NarkoVet	Eickemeyer	213062
Plexiglass chamber	Eickemeyer	214620
Straight Forward Telescope	KARL STORZ SE &Co KG	64301 AA	part of the experimental setup for colonoscopy
Protection and Examination Sheath	KARL STORZ SE &Co KG	61029 C	part of the experimental setup for colonoscopy
Examination Sheath with working channel	KARL STORZ SE &Co KG	61029 D	part of the experimental setup for colonoscopy
Biopsy Forceps	KARL STORZ SE &Co KG	61071 ZJ	part of the experimental setup for colonoscopy
175 Watt SCB XenonLight Source	KARL STORZ SE &Co KG	20132120	part of the experimental setup for colonoscopy
Fiber Optic Light Cable	KARL STORZ SE &Co KG	495 NL	part of the experimental setup for colonoscopy
Image 1 S3 Camera Head	KARL STORZ SE &Co KG	22220030	part of the experimental setup for colonoscopy
Image 1 SCB Camera Control Unit	KARL STORZ SE &Co KG	22200020	part of the experimental setup for colonoscopy
LCD monitor	Olympus	OEV181H	part of the experimental setup for colonoscopy
Forane / Isofluran	AbbVie Inc.	B506
Formaldehyde solution 37 %	Carl Roth GmbH & Co.KG	7398.1
5.0 mL Dispenser tip	Eppendorf AG	30089456