İndüksiyon bağırsak Graft - versus - host hastalığı ve canlı fareler, Mini-endoskopik değerlendirme

Özet

Burada, Allojeneik Hematopoietik kök hücre transplantasyonu açıklar ve distal kolonun tekrarlayan mini-endoskopik değerlendirme yerinde varlığı, özellikleri ve canlı içinde kolon iltihabı şiddeti için izin veren bir protokol mevcut bağırsak graft - versus - host hastalığı fareler.

Özet

Akut Greft - versus - host hastalığı (GvHD) en ciddi komplikasyonu daha önce Allojeneik Hematopoietik kök hücre nakli (allo-HCT) yüz geçiren hastalar temsil eder ve sık sık bir zavallı klinik sonuçlar ile ilişkilidir. Süre, örneğin, deri belirtileri GvHD genellikle kurulan bağışıklık baskılayıcı tedavilere cevap vardır ve bu nedenle, önemli bir ders, varlığı ve özellikle parçalarının orta-için-alt bağırsak bağırsak GvHD yoğunluğunu almıyorsun güçlü etkisi sonucu ve genel olarak hasta akut GvHD. tedavi olanakları ile yaşama aslında sadece orta etkileri hastalık için Azaltıcı verimli klasik bağışıklık baskılayıcı acentelere sınırlı. Bu nedenle, doku yerleşik bağışıklık cascade hakkında detaylı bilgi bağırsak microbiota değiştirir ve stromal yanıt önceden üzerine ve bağırsak GvHD başlangıçlı sonra acilen olaylar ve altta yatan mekanizmaları anlamak için gereken onun patogenez ve yenilikçi tedavi olanakları geliştirmek için. Fare modelleri GvHD sık tanımlamak ve işlevsel moleküller ve putatively bağırsak GvHD sürüş yolları değerlendirmek için istihdam edilmektedir. Değerlendirmek ve akut GvHD notu için kurulan puanları düzenli olarak sistemik GvHD oldukça yansıtan çeşitli parametrelerin oluşmaktadır beri Ancak, özel olarak izlemek ve bağırsak iltihabı zaman içinde değerlendirmek anlamına gelir aslında eksik bulgular. Bağırsak GvHD ayrıntılı değerlendirme çalışmaları böylece aslında boyuna hariç olmak üzere fare, ötenazi kullanarak sınırlama getirildi (yani, kinetik) kolon bölmenin altında verilen bir deneysel koşul analizleri (örneğin, antikor aracılı proinflamatuar sitokin abluka) (yani, in vivo) canlı farelerde. Mini-endoskopik yerinde değerlendirme burada açıklanan allo HCT tedavi farelerin distal kolon bağırsak iltihabı ve b) seçeneği aşağı akım analizleri için doku örneği toplamak için farklı yönleri ayrıntılı bir) bir makroskopik değerlendirme sağlar Gözlem süresi boyunca çeşitli zaman puan. Genel olarak, mini-endoskopik yaklaşım preklinik noninvaziv izleme ve bağırsak GvHD değerlendirilmesi büyük bir ilerleme sağlar.

Giriş

Hematopoetik maligniteler, doğrudan hematopoetik kök hücre bölmesi ve kontrolsüz doğan hızla ilerliyor ve ağır immün aracılı bozuklukları çoğu kez allo-HCT^1,2gerçekleştirmek için göstergeler. Ancak, her ne kadar prognostik yararlı Greft-versus-tümör yanıt dosyasının örneği için muhasebe, donör lenfositler sık inducing ve sağlıklı doku bileşenleri allo-HCT alıcı içinde istenmeyen bir immün aracılı saldırıya teşvik , Greft - versus - host hastalığı³olarak adlandırılan bir süreç. Belirtiler gut, sözde bağırsak GvHD akut GvHD, hangi ciddi formları ile yüksek ölüm oranı^1,2,4rutin olarak ilişkili en korkulan komplikasyonu temsil eder.

Allo-HCT genel olarak, fare modelleri tanımlamak ve bağışıklık aracılıklı mekanizmalar GvHD⁵patogenezinde temel eğitim için çok değerli araçlar ortaya çıkmıştır. Ancak, kinetik değerlendirilmesi, örneğin, yararlı etkileri zaman içinde canlı fareler roman tedavi müdahaleler rutin dayanan klinik GvHD belirlenmesi puanları⁶. Bu sınavların yansıtmak uygun olmakla birlikte, örneğin, genel hastalık yükü (yani, sistemik GvHD), klinik olmaması güvenilir bir şekilde organ özgü belirtiler ayna için duyarlılık puanları (örneğin, gut). Bu nedenle, sonuçlar, örneğin bu sistemleri genellikle Puanlama dayanır gut-koruyucu etkileri belirli bir terapötik müdahale açısından yetersiz kalmaktadır.

Roman tüm vücut icadı ile önemli gelişmeler rağmen yöntemleri yöntemleri doğrudan ve özellikle her iki kollarındaki veya floresan genetik fare modelleri^7,8, belgili tanımlık kullanım ile birlikte görüntüleme bağırsak değerlendirmek GvHD tezahürü canlı farelerde eksik. Dolayısıyla, bu engeli aşmak için sonraki bölümde açıklanan bağırsak GvHD fenotip endoskopik değerlendirme protokolü arkasındaki mantığı olduğunu. Ayrıca, motivasyon defa, hücresel, morfolojik ve moleküler özellikleri detaylı bir değerlendirmesini beri deneysel fareler numaraları azaltmak da (örneğin, histopatoloji veya moleküler biyoloji), bağırsak GvHD tezahürü sonuçta deneysel fare kurban gerektirmiştir.

Bizim kurum daha önce syngeneic kolit modelleri⁹sırasında kolon tezahürlerini bir mini-endoskopik değerlendirme metodolojisi olarak bildirdi. Burada sunulan iletişim kuralında, biz rafine ve colonoscopic uyarlanmış bir MHC sınıf HCT ve donör lenfosit alloreactive nakli üzerine bağırsak GvHD ile canlı farelerde alloresponse tahrik kolit için matris Puanlama ben tamamen ayarı uyumsuz . Biz dört parametre GvHD ilgili bağırsak kolon lezyonlar yansıtmak uygun tespit. Ayrıca, kolayca bağırsak GvHD belirli bir fare bir zaman noktasında bulunması önem derecesi hakkında okuyucu bilgilendirir yeni bir skor sonuçlanan herhangi bir tek belirleyici, ince ayarlı bir sınıflandırma sağlayan bir sistem kurduk. Histopatolojik analizleri üzerinde belirli bir eşiğe endoskopik bir skor orta yüksek sınıf doku iltihabı güvenilir bir şekilde tahmin doğruladı. Bu nedenle, mini-endoskopik değerlendirme rutin olarak deneysel farelerin fedakarlık gerektirir altın standart histopatoloji çalışma yerine göstermek için görünür. Önemlisi, bu iletişim kuralını hemen hemen herhangi bir zamanda noktada uygulanabilir ve hastalık^10,11boyunca tekrar tekrar kullanılabilir. Ayrıca, bioluminescence bağımlı yaklaşımlar kullanımı aksine, ışığını genetik olarak değiştirilmiş fareler gibi emek yoğun ve zaman alan ölçümleri gereklidir ve bu nedenle, hemen hemen herhangi bir fare hat üzerinde metodoloji uygulanabilir faiz.

Birlikte, allo-HCT hastalarda şiddetli bağırsak GvHD, zararlı klinik açıdan verilen alınan hızlı bilimsel ilerleme ve bağışıklık patogenezinde temel moleküler mekanizmaları içine daha fazla fikir acilen ihtiyaç vardır. Benzer şekilde, önemli, etik konuları bilgi kazanç deneysel fareler en az sayıda kullanımı ile elde edilmelidir talep ediyorum. Bu nedenle, her ikisi de bağırsak GvHD keşfetmek araştırma topluluğu alacaklar izlemek ve canlı deneysel Mouse bağırsak GvHD notu için deneysel çalışma zincirindeki kolon seri mini-endoskopik değerlendirme uygulayarak gelişmiş olabilir tanıdı modelleri, açıklanan ve burada sunulan protokolündeki doğrulanmış olarak.

Protokol

Deneysel yöntem tanımlamak burada Ansbach'da, Bavyera, Almanya hükümeti tarafından onaylanmış olması.

1. GvHD indüksiyon

1. 0. gün: Alıcı farelerin tüm vücuda radyasyon vermeliyiz
   1. Kadın CD45.2⁺ H2kd kullanmak⁺ BALB/c en az 10 haftalık alıcılar fareler.
   2. Ağırlık ve ağırlık GvHD İndüksiyon öncesi alıcı farelerin kaydedin.
      Not: Alıcı en az vücut ağırlığı 20 g olduğundan emin olun. Başlangıç vücut ağırlığı kilo kaybı bireysel fare GvHD indüksiyon ve ilerleme boyunca hesaplamak için referans değeri olarak görev yapacak.
   3. Beşe kadar fareler x-ışını irradiator kapsayıcısına getirin.
   4. X-ray 8 Gy tek bir doz ile tüm vücuda radyasyon vermeliyiz tarafından fareler ışınlatayım. CS¹³⁷ radyasyon kaynağı olarak kullanın.
2. 1. gün: Sulandırma T hücre tükenmiş kemik iliği ile ışınlanmış farelerin
   NOT:Anahatları belirlenmiş ve 1.2, bölümünde ayrıntılı olarak Allojenik Kemik iliği hücrelerinin nakli 24 h içinde ışınlama sonra gerçekleştirilmelidir. Gerçekleştirmek bir steril doku kültürü içinde aşağıda açıklanan işlemler hood ve filtre uygulanmış reaktifler kullanın. Allojeneik CD45.1/Ly5.1 B6 kullanın. SJL-Ptprca Pepcb/ Bağış için kemik iliği T hücre tükenmiş olarak BoyCrl fareler.
   1. CD45.1/Ly5.1 B6 ötenazi. Allojenik Kemik iliği hücreleri kurumsal yönergeleri, 12-24 h sonra alıcı BALB/c fare ışınlama uygun olarak bağış yapacaktır SJL fareler. Bunun için CD45.1/Ly5.1 B6 anestezi. SJL fareler %5 isoflurane Solunduğunda. Tutuklama nefes sonra isoflurane pozlama 1 dk ile devam etmek ve ötenazi tarafından servikal çıkığı onaylayın.
   2. Kürk ve deri fareyi % 70 etanol ile iyice dezenfekte edin.
   3. Böylece fare yüzükoyun sígara onun hindquarters deneyci karşı karşıya pozisyon fareyi üzerine temiz bir kılıf çalışma. Zayıf bir Semken pens ucu ile 13 cm uzunluğunda ve tırtıklı eğri ipuçları ile kürk kaldır. Forseps ve topuk ile sertleştirilmiş 8,5 cm düz ipuçları iyi makasla arasında cilt deşmek.
   4. Belgili tanımlık kesme cranially (yani, alt bacak ve uyluk kalça bölgesine üzerinde topuk) üzerinden uzamış. Deri ve kürk forseps yardımıyla hind lime kaldırın.
   5. Aynı yordamı diğer hind bacak üzerinde gerçekleştirin.
   6. Hind bacaklarda bitişik kalça eklem içinden çıkarın.
   7. Arka paws kes gitsin. Diz eklemi ile kesti. Uyluk ve fosfat tamponlu tuz (PBS) çözüm buz dolu bir 92 mm Petri birlikte her hind uzuv shank saklayın.
   8. Femur ve tibia kemikler dikkatle her uyluk ve shank mümkün olduğu kadar fazla kas dokusu kaldırarak temizleyin. Femur ve tibia kemikler steril RPMI 1640 orta ve yer tüm tibia ve uyluk kemikleri adım 1.2.7 toplanan kadar ıslak buz üzerinde kas dokudan temizlemiş dolu bir 50 mL tüp aktarın.
   9. Kemik iliği ayırmak için bir uyluk kemiği veya tibia kemik (hangi açıklandığı adım 1.2.8 olarak temizlenmiş oldu) bir seferde 50 mL tüp sizden RPMI 1640 orta ile dolu bir Petri (92 mm çaplı) aktarın. Femur veya tibia erişmek için kemik iliği içeren kemik boşluğu bir neşter ile uçlarını kesti.
   10. 5 mL RPMI 1640 orta ile 50 mL toplama Tüp hazırlayın. Kemik boşluğuna RPMI 1640 orta 1 mL ile dolu bir 1 mL şırınga bağlı 26 G iğne takın ve pistonu iterek koleksiyonu tüpüne kavite kemik iliğini temizlemek.
   11. Işık ve parlak kemik görünene kadar 1.2.10 adımı yineleyin (yani, kemik boşluğu gözle görülür kırmızımsı kemik iliği yoksun bir). Boş kemik atmak.
   12. Adımları 1.2.9 yükleme - adım 1.2.8, tüm femur ve tibia kemiklerinden kullanarak 1.2.11 yineleyin ve kurtarılan kemik iliği taşlarını aynı 50 mL toplama tüp 1.2.10 adımından toplamak. 1.2.8. adımdaki tüm kemikleri buna göre işlenene kadar toplama tüp ıslak buz üzerinde tutun.
   13. Bir tek hücre süspansiyon usulca kızardı, ufalanan kemik iliği adet yukarı ve aşağı pipetting tarafından oluşturun. Kemik iliği tek hücre süspansiyon üzerinde yeni bir 50 mL toplama tüpü bir 40 µm mesh ekran hücre süzgeç aracılığıyla filtre.
   14. Kemik iliği tek hücre süspansiyon 450 x g 4 ° C'de 5 min için de içeren 50 mL toplama tüp santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak.
   15. Pelet ACK lysing arabellek (1 mM Na₂EDTA 10 mM KHCO₃144 mM NH₄Cl; pH 7.2) kırmızı kan hücre lizis için 5 ml resuspend. 3 dakika oda sıcaklığında hücre süspansiyon kuluçkaya. Daha sonra hemen 10 mL PBS çözeltisi hücre süspansiyon için ekleyin.
   16. Süspansiyon vasıl 450 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi Süpernatant atın ve 2 mL PBS çözeltisi hücrelerde resuspend.
   17. Bir hemasitometre kullanarak kemik iliği hücreleri saymak. Bir aliquot 6 x 10⁶ hücre hücre arıtma sonra hücreleri saflığı kontrol etmek Akış Sitometresi Analizi için korumak (bkz. Adım 1.2.20).
   18. T hücrelerden kemik iliği tek hücre süspansiyon tükenmesi için piyasada bulunan hücre arıtma seti kullanın. Manyetik olarak CD90.2⁺ hücreleri (yani, lenfositler) üreticinin protokol sonrası toplam kemik iliği hücrelerinden tüketmek.
   19. Bir hemasitometre kullanarak adımda 1.2.18, anlatıldığı gibi izole edilmiş T hücre tükenmiş kemik iliği hücreleri saymak. Bir aliquot daha sonra gerçekleştirilecek Akış Sitometresi Analizi için 1 x 10⁶ hücre 1.2.20 adımda anlatıldığı gibi korumak.
       Not: Bir donör fareden türetilmiş ortalamanın üzerinde hücre verim genellikle 2 x 10⁷ 3,4 x 10⁷ T hücre tükenmiş kemik iliği hücreleri olduğunu.
   20. Başarılı bir T-hücre tükenmesi akış sitometresi ile onaylayın. 1 x 10⁶ hücreler, kimden adım 1.2.17 (manyetik hücre ayırma önce kemik iliği hücreleri) ve 1.2.19 (manyetik hücre ayırma sonra T hücre tükenmiş kemik iliği hücreleri), aşağıdaki antikorlar ile korunmuş leke: α-CD45.1 (A20), α-CD3 (17A2), α-CD4 () GK1.5) ve α-CD8α (53-6,7). Adım 1.2.17 kalan hücreleri günahı denetimi ve denetimler, tek boyama için akış sitometresi ayarlamak için kullanın.
       1. 1 x 10⁶ hücreler her örnekten bir V-alt yordamı boyama akış sitometrik gerçekleştirmek için 96-şey plakalı bir kuyu aktarın.
       2. Spin aşağı hücrelerin içinde 450 x g 4 ° C'de 5 min için de 96-şey plaka (adım 1.2.20.1) Süpernatant atın ve 100 µL FACS arabelleği (%3 ile desteklenmiş PBS Sığır serum filtre) hücrelerde resuspend.
       3. 96-şey plaka 450 x g 4 ° C'de 5 min için de hücrelerde santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak.
       4. Uygun bir seçim (adım 1.2.20 ile karşılaştırın) antikor miktarı örnekleri tek FACS arabellek 100 µL içinde boyama için ekleyin.
       5. Uygun tutarlar ayrı ayrı önceden korunmuş kemik iliği hücre aliquots leke için yeterli içeren tüm antikorlar (ana mix) karışımı hazırlayın (bkz. Adım 1.2.17) ve sonra (bkz. Adım 1.2.19) manyetik T hücreli tükenmesi. Her iki aliquots için 100 µL ana karışımı ekleyin.
       6. Sadece 100 µL FACS arabelleği günahı örnek ekleyin.
       7. Karanlıkta 4 ° C'de 20 dk 96-şey plaka hücrelerde kuluçkaya.
       8. FACS arabelleği 100 µL ekleyin ve 96-şey plaka 450 x g 4 ° C'de 5 min için de hücrelerde santrifüj kapasitesi Süpernatant atın ve 100 µL FACS arabelleği hücrelerde resuspend.
       9. 450 x g 4 ° C'de 5 min için hücreleri santrifüj kapasitesi Süpernatant atın ve 250 µL FACS arabelleği hücrelerde resuspend.
       10. Örnekleri 5 mL polistren yuvarlak alt tüp aktarmak ve bunları bir akış sitometresi aletle (bkz. Adım 1.2.20) hücre örnekleri karakterize etmek için istihdam antikorlar etiketlemek için kullanılan floresan molekülleri tespit edebilmektedir analiz.
       11. Önce ve sonra manyetik hücre ayrılık hücre kompozisyon karşılaştırın.
           Not: Bir saflık yaklaşık % 95 CD45.1⁺CD3^- (yani, T hücre tükenmiş kemik iliği) canlı kapısı hücrelerde genellikle elde edilir.
   21. T hücre tükenmiş kemik iliği hücre süspansiyonlar 2 yıkama x PBS çözüm (450 x g 4 ° C'de 5 min için) ile ve son olarak, PBS çözüm, hücre konsantrasyonu 5 x 10⁷ hücre/ml ayarlama hücrelerde resuspend. Islak buz hücrelerdeyse enjeksiyon kadar tutun.
   22. T hücre tükenmiş kemik iliği hücreleri (bakınız Bölüm 1.1) önceki gün ışınlanmış alıcı fareler içine enjekte.
       1. Bir sızıntı geçirmez odasında deneysel fareyi getirin ve tarafından % 4'e kadar inhalasyon anestezi neden fare bilinçsiz olana isoflurane. Analjezi ve bilinç kaybı iyileştiren refleks kaybı test ederek onaylayın ve pedal sonraki kaybı çekilme refleks.
       2. 5 x 10⁶ T hücre tükenmiş kemik iliği hücreleri (yani, 5 x 10⁷ hücre/mL, 100 µL) enjekte 30 G iğne ile donatılmış bir 1 mL şırınga kullanarak PBS solüsyon içeren uzaya venöz sinüs içeren intravenöz retrobulbar.
3. 2. gün: Transfer T hücreleri
   Not: Steril doku kültürü mahallede aşağıda açıklanan yordamları gerçekleştirmek ve filtre uygulanmış reaktifler kullanın. CD45.2 C57Bl/6 (vahşi-türü; kullanın Alloreactive T hücreleri için bağış olarak WT) fareler. Distinguishability alıcı arasında congenic marker sistemleri kullanım sağlar (CD45.2⁺ H2kd⁺ Balb/c fare) ve donör hematopoietik hücre tipleri (kemik iliği hücreleri: CD45.1⁺ H2kb⁺ B6. SJL fareler; Allojeneik T hücreleri: CD45.2⁺ H2kb⁺ C57/Bl6 fareler).
   1. C57Bl/6 fare uygun olarak uygulama ötenazi kurumsal yönergeleri ve yetkililer. Bu nedenle, fareler %5 isoflurane bir konsantrasyon ile Solunduğunda anestezi. Tutuklama nefes sonra 1 dk kadar isoflurane pozlama devam ve ötenazi tarafından servikal çıkığı onaylayın. Kürk ve deri fareyi % 70 etanol ile iyice dezenfekte edin.
   2. Bir süzgeç ile 40 µm örgü perde bir 50 mL toplama tüp yerleştirin. Dalak çıkarın ve süzgeç yerleştirin.
   3. Bir şırınga pistonu ile süzgeç dalak comminute. Süzgeç ve şırınga dalgıç tüm splenocytes toplamak için PBS ile yıkayın.
   4. 450 x g 4 ° C'de 5 min için de 50 mL toplama tüp içindeki hücrelere santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak.
   5. Splenocytes 3 mL kırmızı kan hücreleri parçalayıcı için ACK lysing tampon resuspend. 3 dk. sonra PBS 10 mL ekleyin ve santrifüj kapasitesi 450 x g 4 ° C'de 5 min için de hücreleri hücre süspansiyon kuluçkaya Süpernatant atın ve PBS içinde splenocytes resuspend.
   6. Bir hemasitometre kullanarak dalak hücreleri saymak. Bir aliquot için Akış Sitometresi Analizi, arıtma adım 1.3.9 büyüklüğü değerlendirmek için 6 x 10⁶ hücre başka yöne çek.
   7. Toplam CD3 için⁺ T hücre izolasyon toplam splenocytes, piyasada bulunan hücre arıtma seti kullanın. Üreticinin protokol sonrası dalak T hücreleri izole et.
   8. Dalak CD3 saymak⁺ T hücreleri izole açıklandığı gibi adım 1.3.7, bir hemasitometre kullanarak. Akış Sitometresi Analizi için 1 x 10⁶ T hücrelerinin bir aliquot korumak.
      Not: Üzerinde ortalama verim dalak t hücreleri tarafından manyetik hücre ayrılık aralıkları 1.3 x 10 izole donör fare başına⁷ 2 x 10⁷ hücrelere.
   9. T-hücre izolasyon başarısı akış sitometresi ile onaylayın. Boyama Protokolü ayrıntılı açıklaması, görüşmek ve merdiven 1.2.20.1 - 1.2.20.10.
      1. 1 x 10⁶ splenocytes 1.3.6 (önce manyetik hücre ayırma) ve 1.3.8 adımlardan (manyetik hücre ayrılıktan sonra) aşağıdaki antikorlar ile leke: α-CD45.2 (104), α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) ve α-CD8α (53-6,7).
      2. 1.3.6. adımdaki kalan hücreleri bir günahı denetimi olarak ve tek ilgili antikorlar ile boyama için akış sitometresi ayarlamak için kullanın.
      3. Önce ve sonra manyetik hücre ayrılık hücre kompozisyon karşılaştırın.
         Not: Bir saflık ≥95 CD45.2⁺CD3 şirketinin %⁺ T hücre lenfosit canlı kapı içinde gerçekleştirilmesi.
   10. Yıkama T hücreleri PBS ile 2 x (450 x g 4 ° C'de 5 min için) ve son olarak, PBS çözüm, 7 x 10⁶ hücre/ml hücre konsantrasyonu ayarlama hücrelerde resuspend. Buz hücrelerdeyse enjeksiyon kadar tutun.
   11. Alloreactive, (bkz. Adım 1.3.10) dalak T hücreleri daha önce CD45.1⁺ T hücre tükenmiş kemik iliği hücreleri (bkz. Adım 1.2.22) almış olan radyoaktif BALB/c fareler içine enjekte.
       1. Anestezi ikna etmek içinde onun bilincini kaybeder kadar % 4 isoflurane için yukarı maruz bir sızıntı geçirmez odasında deneysel fareyi yerleştirerek. Analjezi ve bilinç kaybı iyileştiren refleks kaybı test ederek onaylayın ve pedal sonraki kaybı çekilme refleks.
       2. ⁺ T 0,7 x 10⁶ alloreactive CD3 enjekte 30 G iğne ile donatılmış bir 1 mL şırınga kullanarak hücreleri   (yani, 7 x 10⁶ hücre/mL, 100 µL) PBS solüsyon içeren (bkz. Adım 1.3.10), intravenöz retrobulbar içine Uzay GvHD. ikna etmek için farelerin bu farelerde deneysel grup olarak adlandırmak.
       3. Bir başka gruba farelerin PBS yalnız, 100 µL ile intravenöz retrobulbar uzaya enjekte ve bu grup daha sonra denilen kontrol grubu adlandırmak "no-T-hücre-nakledilen (değil) fare".

2. sistemik GvHD değerlendirilmesi

Not: Bu yordamı bir yarı steril lisanslı ve hayvan tesis içinde canlı fareler işlemek için donanımlı deneysel bir odada çevreleyen içinde gerçekleştirmek.

1. GvHD klinik seyir bireysel farelerde izleyin; Özellikle, değerlendirmek ve deneysel fareler 3 haftada bir skorlama sistemi aşağıda açıklanmıştır ve daha önce aşçı ve ark.⁶tarafından kurulmuş bir skorlama sistemi adapte dayalı klinik GvHD belirtiler varlığı için x puan edinildi.
   1. Her fare ayrı ayrı tartmak ağırlığı kaydetmek ve thespecific vücut kilo kaybı referans olarak gün 0 (adım 1.1.2) tespit edilmiştir (% 100'e karşılık gelen) deney başlamadan önce vücut ağırlığı hesaplayın. Bir kilo kaybı Sınıf 0, % 10 ve grade 1 ile % 25 arasında bir kilo kaybı ve seviye 3 ile % 25'den fazla kilo kaybı ile başlayan ağırlık daha az % 10 puan.
   2. Her fare, normal aktivite düzeyi ile ayrımcılık fareler etkinlik düzeyini puan edinildi (skor = 0) orta derecede azalmış aktivite düzeyi ile fareler üzerinden (puan = 1) ve sabit davranışı ile fareler dışarıdan uyarılmış olmadıkları sürece (skor = 2).
   3. Böylece normal, parlak ve kempt kürk ayrımcılık kürk doku puan edinildi (skor = 0) orta fırfır yakalı bir kürk üzerinden (Skor = 1) ve kel noktalar varlığı (skor = 2).
   4. Ayrımcılık normal cilt cilt dokusunu puan edinildi (skor = 0) sporadik noktalardan (örneğin, at kuyruğu ve pençeleri) cilt ölçekleme (puan = 1) ve açık ölçekleme ve acıyan deri bölgelerinde (skor = 2).
   5. Salgılanan dışkı kesirler tutarlılığını analiz. Dışkı ile normal bir (yani, sabit tutarlılık) notu 0, dışkı ile deforme ve yumuşak dışkı ile grade 1 ve dışkı olmadan herhangi bir tutarlılık ve, dolayısıyla, şiddetli ishal ile grade 2 puan.
   6. Tüm ayrı ayrı attı parametreleri için 12 fare başına maksimal klinik puan toplamak.
2. Düşünün ve deney uygulanan kurumsal yönergelere uygun olarak bireysel fareyi geçerli hastalık önem düzeyini nedeniyle durdurması kriterleri değerlendirmek ve hayvan iletişim kuralı yetkili.

3. bağırsak GvHD değerlendirilmesi

1. Distal kolorektal bölge mini endoskopi tarafından GvHD ilgili lezyonlari Puanlama
   NOT:Bu bir semisterile lisanslı ve hayvan tesis içinde canlı fareler işlemek için donanımlı deneysel bir odada çevreleyen içinde gerçekleştirin. Onaylandıktan mini-endoskopik bir iş istasyonu için küçük hayvanları kullanım.
   1. Endoskopik aygıtı (1.9 mm çapında) ve 10 cm uzunluğunda teleskopla kapsayan ile endoskopik muayene kılıf hazırlamak. Temiz ve su ve etanol ile endoskop sterilize.
   2. Bilgisayar ayarlanabilir xenon ışık kaynağı ve fotoğraf makinesi ölçü birimi geçin ve odak lens yakın nesneleri net bir görüntü vermek bir şekilde ayarla.
   3. Hava pompası için endoskopik kılıf bağlayın. Hava akımı görselleştirmek için endoskop ucu su kabı cam içine daldırma. Hava akımı arasında hava pompası ve endoskopik Kılıf Kapak ayarlayarak düzenler. Birkaç sürekli artan tarafından yansıyan bir yavaş, sabit hava akımı için ayarlamak kabarcıklar.
   4. Bir fare bir sızıntı geçirmez odasına koyun. Tarafından % 4'e kadar inhalasyon anestezi neden fare bilinçsiz olana isoflurane. İyileştiren refleks kaybı test ederek analjezi ve refleksleri yok durumunu onaylamak ve pedal sonraki kaybı çekilme refleks.
   5. Bir uygun veteriner anestezi makinesi uygun olarak kullanılan hayvan iletişim kuralı kullanın. Fare odasından kolonoskopi çalışma alanına aktarın. Burada, konum imzalat fareyle onun burnuna (hangi anestezi alet bağlı) nosecone, üzerine temiz bir faredir deneyci onun hindquarters ile karşı karşıya yüzükoyun sígara kılıf çalışmaya.
   6. Kolonoskopi işlemi sırasında anestezi korumak için yaklaşık % 2 isoflurane konsantrasyon azaltmak. Fare solunum ve stimülasyon kolonoskopi sırasında yanıt izlemek ve gerekirse Buharlaştırıcı isoflurane konsantrasyonu ayarlayın. Onları kuru girmesini önlemek için salve gözlerle fare kapsar.
   7. Denetim fare ayak parmakları arasında pinching tarafından anestezi etkinliği. Olması durumunda reaktivite yok, 3.1.8 adım geçin.
   8. Kuyruk kuyruk kök tek elle hemen üzerinde Asansör ve dikkatli bir şekilde diğer elinde içine rektum anüs yoluyla konumlandırılmış endoskop, Ekle.
   9. Hava akımı kolorektal lümen açılırsa iken, yavaş ve dikkatli endoskop ileri aboral yönünde taşır.
   10. Kolon lümen ortasında endoskop yerleştirin ve kolon Duvar ile teması en aza indirmek için ve çizikler, daha derin duvar ilgili yaralanmalar önüne geçmek için bu pozisyonu koruyun (örneğin, kanama sonucu), ya da hatta perforasyonu duvar (bkz. Adım 3.1.17) . Bu adım kalıcı olarak altında (yani, kolon bölme sabit görselleştirme) video akışı izleyerek kontrol.
   11. Dışkı görünümü daraltır, endoskop kaldırmak ve rektal salin, yumuşak bir Pasteur Pipet kullanma ilâ 2 mL ile temizlenerek lavman gerçekleştirin. İstenmeyen bir seyreltme dışkı ve mukozal yüzeyin ve sonuçta, Puanlama sonuçları özelliklerini olumsuz etkileyen diğer ikincil etkileri önlemek için mümkün olduğunca küçük sıvı olarak kullanın.
   12. Düzenli olarak endoskop tanımlanmış pozisyonu deneyin (yani, ayrı) anatomik site içinde distal kolon kolon iltihabı Puanlama standart hale getirmek ve sonuçları deneyler ve fareler arasında Puanlama karşılaştırılabilir optimize etmek için.
       Not: Normalde, katı endoskop ile maksimal 4 cm derinliğe rektal yol ile ulaşılabilir. 2 ila 4 cm arasında aborally, iki nokta üst üste düzenli olarak sert colonoscope ile geçirilemez bir bükülme dönüşüyor. Varsayılan Puanlama olarak kivrimi için spot klemple bitişik iki nokta üst üste bölgesi kullanın.
   13. Video akışı kaydı ve iltihabı Puanlama ile başlamak başla.
   14. İki nokta üst üste GvHD ilgili iltihabı açıkladı ve Tablo 1 ve Şekil 3tasvir parametreleri Puanlama tarafından değerlendirmek.
       1. Nokta yavaşça Puanlama ve biraz arka - endoskop taşıma ve farklı parametreleri değerlendirmek için ileri.
       2. Parametre "translucency" yanı sıra "dışkı tutarlılık", kolon duvara göre daha geniş bir gün ışığında endoskop konumlandırma tarafından değerlendirmek.
       3. Parametreleri "taneciklik" ve "vascularity" kolon duvara yakın endoskop konumlandırma tarafından değerlendirmek. Bu görev için dikkatlice endoskop ucu kolon duvarla iyi biraz dozlayıp gerilim uygulanır.
   15. Puanlama işlemi tamamlandıktan sonra kaydı durdurmak.
       Not: Daha sonra kaydedilen video klibi toplamda kullanılan veya temsilcisi görüntüler (örneğin, ekran) genel olarak kolon iltihabı için katkıda bulunan mini-endoskopik biçilen ölçüt oluşturmak için kullanılır.
   16. Endoskop dikkatli bir şekilde çıkarın.
   17. İsoflurane Fuar ayrı bir kafes içinde için ortam havası maruz kalmaktadır için fareyi aktararak durdurun. Fare ile bir kırmızı ışık lamba sıcak ve anestetik kurtarır ve tam bilinci yerine kadar fareyi gözlemlemek.
       Not: Hava enflasyon kolon nedeniyle endoskopi sırasında karın bölgesi fare doğrudan sonra kadar şişmiş görünebilir. Bu normal ve geçici doğa, uzun süreli belirtileri karın büyük ve hatta artan enflasyon ve hata kurtarma fare (Bu durumda, fare euthanized gereken kolon istenmeyen bir delikli gösterebilir hemen).
   18. Tam kurtarma fareyi ilgili onun kafesine geri getirin.
   19. İsteğe bağlı yaklaşım: doku görünümü destekli biyopsi almak mümkündür. Aşağıdaki adımları uygulayın.
       Not: Kolonoskopi aynı şekilde adımları 3.1.1 - 3.1.18, aşağıdaki değişiklikler ile açıklandığı gibi yapılır.
       1. 3.1.1. adımda bir endoskopik muayene kılıf yerine basit muayene kılıf olmadan çalışma kanalları, yerleşik bir çalışma kanallı teleskop kapsayan için kullanın. Ucu bu oranda bağırsak istenmeyen yaralanma engeller çünkü sadece endoskop video ekranında önünde görünene kadar bir biyopsi forceps çalışma kanal tanıtmak.
       2. Tarih adımlarla 3.1.2 - 3.1.11 devam. Endoskop kolon ve dikkatlice ileri itmek faiz fincan ekleyin.
       3. Kolon doku biyopsi alarak görev için ikinci bir deneyci yardımıyla istihdam. Biyopsi forceps tercih kolon bölgesine ucu forseps jaws açana kadar forseps çalışma kanal içinde yavaş yavaş ileri iterek gezinmek için ikinci deneyci sor. Sürekli video akışı kolon duvar zarar riskini en aza indirmek için bu yordam sırasında dikkat et.
       4. Kolon duvar doku örneği dikkatle açılış ve kapanış biyopsi forceps jaws kurtarmak.
          Not: Kolon duvar perforasyon önlemek için dikkatli bir şekilde bunu. Bir kolon perforasyon nadir durumlarda hemen etkilenen fare ölçümleri kurumsal yönergelere uygun olarak ve anestezi sürekli yönetimi altında uygulayarak kurban.
       5. Geri çekin ve çalışma Kanal dışında kapalı forseps kaldırın. Örnek biyopsi forceps jaws daldırma ve dikkatli bir şekilde açılan forseps steril PBS çözümde titriyor çıkarın. Daha sonra uygun saklama koşulları için uygun olarak planlanan aşağı akım analizleri doku örneği seçin. % 70 etanol ile dezenfeksiyon işleminden sonra forseps biyopsi almak daha fazla için yeniden kullanılabilir.
       6. Biyopsi aldıktan sonra endoskop kaldırmak ve kolonoskopi adımlarda 3.1.16 - 3.1.18 açıklandığı gibi bitirmek.
2. Histopatolojik Analizi
   1. Gün arasında 26 ve 30'dan sonra X-ray ışınlama, allo-HCT alıcı fare uygun olarak kurumsal yönergeleri ve yetkililer ötenazi. Bunun için %5 isoflurane inhalasyon tarafından fareler anestezi. İsoflurane pozlama 1 dakika tutuklama nefes sonra devam edin ve ötenazi tarafından servikal çıkığı onaylayın. İyice dezenfekte kürk ve deri % 70 etanol ile fare.
   2. Karın boşluğu açın ve iki nokta üst üste çıkarın. PBS ile (92 mm çaplı) Petri kabına aktarın.
   3. 5 mL dağıtıcı bahşiş PBS ile doldurun. 13 cm ve tırtıklı eğri ipuçları, kayma kesici uç uç üzerinde iki nokta üstüste (yaklaşık 5 mm) distal parçası uzunluğunda bir Semken forseps yardımıyla. Dikkatle kesici uç forseps ile iki nokta üst üste düzeltmek ve dışkı bağırsak kaldırmak için dalgıç kesici uç aşağı basarak PBS ile kolon temizlemek.
   4. 5 mm bir neşter yardımıyla anüs arasında yer alan bir kolon kesimi kesip.
   5. Rezeke gut numune % 4.5 formaldehit gecede düzeltmek. Parafin içinde katıştırma önce doku dik bir pozisyonda yerleştirin.
   6. Kesme 3 µm parafin gömülü kolon doku bölümlerini çapraz ve Hematoksilen ve eozin (HE), onlarla standart boyama protokolleri kullanarak leke.
   7. O lekeli kesitleri kolon doku örneklerinin hazırlayın.
   8. Kaplan ve ark.¹²tarafından bildirilen Puanlama matris uyarlanmış, histopathologically inflamatuar etkinlik semiquantitatively, 0-3 puanları ile puan edinildi: iltihap yok (skor = 0), hafif inflamasyon (puan = 1), orta iltihabı (skor = 2), ve şiddetli inflamasyon (skor = 3).
      Not: İdeal olarak, bu görev için fare bağırsak GvHD değerlendirilmesinde deneyimli ve deneysel doğası ve kontrol grubu için kör bir patolog uzmanlık istihdam.

Sonuçlar

Distal kolon, bağırsak GvHD ilişkili lezyon mini-endoskopik değerlendirilmesi açıklayan geçerli protokol kurulan ve daha önce şiddetli akut GvHD manken sistemik indüksiyon tabi farelerde doğrulanmış. Bu çalışmada, biz tam olarak hangi BALB/C'de fareler öğrenirim ışınlanmış, ardından T hücre tükenmiş Allojenik Kemik iliği nakli ve^{alloreactive C57BL/6 CD3 GvHD indükleyici yönetim modeli sistemi eşleşmeyen bir MHC sınıf kullanılan +} T lenfositler...

Tartışmalar

İndüksiyon metodolojisi ve mini-endoskopik kolon fenotip bağırsak GvHD sırasında gözlenen değerlendirmenin protokolünü açıklar. Bu bağırsak GvHD boyuna ve noninvazif (yani, başlangıcından kolon tezahürü ve ilerleme maksimal hastalık aktivitesi kadar) tüm hastalığı boyunca çalışmaya bilim adamları daha geniş amacı hizmet vermektedir.

Ancak, orada bazı önemli adımlar ve önemli sınırlamalar deneyci teknolojileri ilgili bilimsel bağlamda uygulanmadan önce dikk...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator	Gamma-Service Meical GmbH
Phosphate-buffered saline (PBS )	Sigma-Aldrich Co. LLC.	D8662-6x500ML
Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips)	Fine Science Tools	11009-13
Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm)	Fine Science Tools	14090-09
RPMI-1640 Medium	Sigma-Aldrich Co. LLC.	R8758-500ML
Hypodermic needle (26 G)	B. Braun Melsungen AG	4657683
1 mL syring	B. Braun Melsungen AG	9166017V
50 mL tube	Sarstedt Ag & Co.KG	62,547,254
Cell strainer with a 40 µm mesh screen	BD Falcon	352340
Ammonium chloride (NH4Cl)	Sigma-Aldrich Co. LLC.	11209	ingredient of ACK lysing buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA)	Carl Roth GmbH & Co.KG	8043.2	ingredient of ACK lysing buffer
Potassium bicarbonate (KHCO3)	Merck KGaA	1,048,540,500	ingredient of ACK lysing buffer
CD90.2 MicroBeads, mouse	Miltenyi Biotec GmbH	130-049-101	magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells
Pan T Cell Isolation Kit II, mouse	Miltenyi Biotec GmbH	130-095-130	magnet cell separation to isolate splenic T cells
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731)	Biolegend	109822
Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645)	Biolegend	100214
FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691)	Biolegend	100406
PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168)	Biolegend	110730
APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753)	Biolegend	100714
Filtrated bovine serum	Pan Biotec	P40-47500	ingredient of FACS buffer
96-well polystyrene V-bottom plates	Greiner Bio-One	651201
Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL)	Falcon	352052
BD LSRFortessa II flow cytometer	BD Bioscience Co.
Insulin syringe with sterile interior (30 G)	BD	324826
Oxy Vet Oxymat 3	Eickemeyer		oxygen concentrator  for anesthesia
NarkoVet	Eickemeyer	213062
Plexiglass chamber	Eickemeyer	214620
Straight Forward Telescope	KARL STORZ SE &Co KG	64301 AA	part of the experimental setup for colonoscopy
Protection and Examination Sheath	KARL STORZ SE &Co KG	61029 C	part of the experimental setup for colonoscopy
Examination Sheath with working channel	KARL STORZ SE &Co KG	61029 D	part of the experimental setup for colonoscopy
Biopsy Forceps	KARL STORZ SE &Co KG	61071 ZJ	part of the experimental setup for colonoscopy
175 Watt SCB XenonLight Source	KARL STORZ SE &Co KG	20132120	part of the experimental setup for colonoscopy
Fiber Optic Light Cable	KARL STORZ SE &Co KG	495 NL	part of the experimental setup for colonoscopy
Image 1 S3 Camera Head	KARL STORZ SE &Co KG	22220030	part of the experimental setup for colonoscopy
Image 1 SCB Camera Control Unit	KARL STORZ SE &Co KG	22200020	part of the experimental setup for colonoscopy
LCD monitor	Olympus	OEV181H	part of the experimental setup for colonoscopy
Forane / Isofluran	AbbVie Inc.	B506
Formaldehyde solution 37 %	Carl Roth GmbH & Co.KG	7398.1
5.0 mL Dispenser tip	Eppendorf AG	30089456