Inducción de Intestinal injerto - versus - host Disease y su evaluación Mini-endoscópica en ratones vivos

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo que describe el trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas y permite evaluaciones repetitivas mini-endoscópica del colon distal in situ para la presencia, características y severidad de inflamación colónica en vivo ratones de intestinal injerto - versus - host disease.

Resumen

Agudo injerto - versus - host disease (GvHD) representa la complicación más severa que los pacientes previamente sometidos a cara de (allo-HCT) del trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas y se asocia frecuentemente con un resultado clínico pobre. Mientras que, por ejemplo, GvHD manifestaciones de la piel generalmente responden a terapias inmune supresora establecidas y, por lo tanto, no tienen un curso fatal, la presencia y la intensidad de la GvHD intestinal, especialmente de las partes de la mitad inferior del intestino, influir fuertemente en el resultado y en general la supervivencia de pacientes con agudo GvHD. opciones terapéuticas son esencialmente se limita a los clásicos agentes inmune supresora rendimiento sólo moderados efectos atenuantes de la enfermedad. Por lo tanto, un conocimiento detallado sobre la cascada inmune reside en el tejido, cambios en la microbiota intestinal y la respuesta estromal anterior, sobre y después de la aparición de EICH intestinal se necesitan urgentemente para entender los acontecimientos y los mecanismos que subyacen a su patogenesia y desarrollar opciones terapéuticas innovadoras. Modelos murinos de GvHD se emplean con frecuencia para identificar y evaluar funcionalmente las moléculas y vías de conducción supuestamente GvHD intestinal. Sin embargo, significa específicamente monitorear y evaluar inflamación intestinal con el tiempo esencialmente faltan desde puntuaciones establecidas para evaluar grado de EICH aguda habitualmente se componen de diversos parámetros que reflejan más bien sistémica GvHD manifestaciones. La evaluación detallada de GvHD intestinal ha sido restringida a estudios utilizando ratones eutanasia, exclusión de tal modo esencialmente longitudinal (es decir, cinética) análisis del compartimiento del colon bajo una determinada condición experimental (por ejemplo, anticuerpo-mediada bloqueo de una citocina proinflamatoria) en ratones vivos (es decir, en vivo). La evaluación in situ mini-endoscópica del colon distal de ratones tratados con HCT de allo que se describe aquí permite a) una evaluación macroscópica detallada de diferentes aspectos de la inflamación intestinal y b) la opción de recoger muestras de tejido para análisis posteriores en diferentes momentos a lo largo del período de observación. En general, el enfoque endoscópico mini proporciona un gran avance en evaluación de GvHD intestinal y monitoreo no invasivo preclínico.

Introducción

Malignidades hematopoyéticas derivadas directamente del compartimento de células madre hematopoyéticas y descontrolada, progresando rápidamente y graves desordenes inmune-mediados suelen ser indicaciones para HCT allo^1,2. Sin embargo, aunque son responsables de la ocurrencia de la respuesta de injerto contra tumor beneficio pronóstica, los linfocitos del donante con frecuencia inducir y promover un ataque inmune-mediado no deseado de los componentes de tejido sano en el recipiente allo-HCT , un proceso que se llama injerto - versus - host disease³. En el intestino, el supuesto GvHD intestinal, las manifestaciones representan la complicación más temida de la GvHD aguda, formas graves de que son habitualmente asociadas con una alta mortalidad^1,2,4.

General modelos murinos de allo-HCT han surgido como herramientas muy valiosas para identificar y estudiar mecanismos inmune-mediados subyacente a la patogenesia de GvHD⁵. Sin embargo, la evaluación cinética de, por ejemplo, efectos beneficiosos de las intervenciones terapéuticas novedosas con el tiempo en vivo ratones rutinariamente basa en la determinación de GvHD clínico puntuaciones⁶. Mientras que estos puntajes son convenientes reflejar, por ejemplo, la carga total de enfermedad (es decir, la GvHD sistémica), clínica puntuaciones falta la sensibilidad para reflejar confiablemente manifestaciones órgano específicas (por ejemplo,, en el intestino). Por lo tanto, conclusiones, por ejemplo con respecto a los efectos de gut-protección de una determinada intervención terapéutica, que se basan estos sistemas de puntuación generalmente se quedan cortas.

A pesar de los avances importantes a través de la invención de la novela todo el cuerpo la proyección de imagen modalidades en combinación con el uso de cualquier modelos de ratón genético bioluminiscente o fluorescente^7,8, metodologías directamente y específicamente evaluar la intestinal carecen de manifestación de GvHD en ratones vivos. Por lo tanto, la razón de ser del Protocolo de la evaluación endoscópica de fenotipo GvHD intestinal que se describe en la sección siguiente es superar este obstáculo. Además, la motivación debe también reducir el número de ratones experimentales ya que, hasta ahora, una evaluación detallada de las características celulares, morfológicas y moleculares (e.g., por histopatología o biología molecular) de GvHD intestinal manifestación en última instancia ha requerido el sacrificio del ratón experimental.

Nuestra institución ha divulgado previamente en la metodología de la evaluación mini-endoscópica de colon manifestaciones en el curso de colitis syngeneic modelos⁹. En el protocolo que presentamos, hemos refinado y adaptado el colonoscopic puntuación matrix para la colitis alloresponse-conducido en vivo ratones con EICH intestinal sobre trasplante de alloreactive HCT y donante de linfocitos en un MHC de clase totalmente unida mal ajuste . Se identificaron cuatro parámetros adecuados para reflejar lesiones colónicas relacionadas con el EICH intestinales. Además, establecimos un sistema que permite una clasificación ajustada de cualquier factor individual, dando lugar a una nueva escala que fácilmente informa al lector acerca de la severidad de GvHD intestinal presente en un ratón dado en un momento dado. Los análisis histopatológicos confirmaron que una puntuación endoscópica por encima de cierto umbral es predecir confiablemente moderado a alto grado inflamación de los tejidos. Por lo tanto, la evaluación endoscópica mini parece representar un sustituto del trabajo de la histopatología de patrón oro que habitualmente requiere el sacrificio de los ratones experimentales. Importante, este protocolo puede ser aplicado en prácticamente cualquier punto de tiempo dado y puede ser utilizado repetidamente durante el curso de la enfermedad^10,11. Además, en contraste con el uso de enfoques dependientes de bioluminiscencia, ninguna medida laboral intensa y laboriosa como entrecruzar genéticamente modificado ratones se requieren y, por lo tanto, la metodología puede ser aplicada en prácticamente cualquier línea de ratón de interés.

Tomados en conjunto, dado el punto de vista clínico perjudicial de pacientes allo-HCT con GvHD intestinal severo, rápido progreso científico y una visión más clara en los mecanismos moleculares subyacentes la patogenesia inmune están urgente. Asimismo, importantes consideraciones éticas exigen que el aumento de los conocimientos debe lograrse con el uso de la mínima cantidad de ratones experimentales. Por lo tanto, ambos reconocieron reclamaciones en la comunidad de investigación explorando GvHD intestinal se pueden avanzar mediante la aplicación de evaluaciones seriales mini-endoscópica del colon en la cadena de trabajo experimental para supervisar y GvHD intestinal en vivo ratón experimental del grado modelos, descrito y validado en el protocolo presentado aquí.

Protocolo

Los métodos experimentales descritos aquí han sido aprobados por el gobierno de Mittelfranken, Baviera, Alemania.

1. EICH inducción

1. Día 0: Total irradiación de cuerpo entero de los ratones receptores
   1. Uso femenino CD45.2⁺ H2kd⁺ BALB/c los ratones que son al menos 10 semanas de edad como beneficiarios.
   2. Pesar y registrar el peso de los ratones receptores antes de la inducción de la EICH.
      Nota: Asegúrese de que el destinatario tiene un peso corporal mínimo de 20 g. El peso inicial del cuerpo será el valor de referencia para calcular la pérdida de peso del ratón individual sobre el curso de inducción de la EICH y la progresión.
   3. Coloque cinco ratones en el recipiente del Irradiador de rayos x.
   4. Irradiar los ratones por la irradiación corporal total con una dosis única de 8 Gy de rayos x. Utilice Cs¹³⁷ como fuente de radiación.
2. Día 1: Reconstitución de los ratones irradiados con médula ósea t-célula-agotado
   NOTA:El trasplante de células allogeneic de la médula, como se describe y detallada en la sección 1.2, debe ocurrir dentro de 24 h después de la irradiación. Realizar los procedimientos descritos a continuación en un cultivo de tejido estéril campana y utilizar reactivos filtrados. Uso alogénico CD45.1/Ly5.1 B6. SJL-Ptprca Pepcb/ Ratones BoyCrl como donantes de médula ósea t-célula-agotado.
   1. Eutanasia CD45.1/Ly5.1 B6. Ratones SJL que donarán a las células de la médula de allogeneic conformidad con las directrices institucionales, 12-24 h después de la irradiación de los ratones BALB/c receptores. Para ello, anestesiar la B6 CD45.1/Ly5.1. Ratones SJL por la inhalación de 5% de isoflurano. Continuar con la exposición del isoflurano sobre 1 min después de la detención de la respiración y confirmar la eutanasia por dislocación cervical.
   2. Desinfectar la piel y la piel del ratón con etanol al 70%.
   3. Posición del ratón sobre un trabajo vaina para que el ratón está en una posición prona, con sus cuartos traseros hacia al experimentador. Levante la piel en el talón de Aquiles con la punta de una pinza Semken con una longitud de 13 cm y puntas curvas serradas. Haga una incisión en la piel entre el fórceps y el talón con una tijera fina endurecido 8.5 cm con puntas rectas.
   4. Alargar la incisión cranially (es decir, desde el talón sobre la parte inferior la pierna y del muslo hasta la región de la cadera). Quitar la piel y el pelaje de las extremidades con la ayuda de las pinzas.
   5. Realizar el mismo procedimiento en las extremidades.
   6. Quite los miembros posteriores por corte a través de los empalmes adyacentes de cadera.
   7. Corte las patas traseras. Corte a través de la articulación de la rodilla. Almacenar el muslo y la caña de cada extremidades en una 92 mm placa Petri con tampón fosfato (PBS) una solución salina en el hielo.
   8. Limpiar cuidadosamente los huesos fémur y tibia retirando tanto tejido muscular como sea posible de cada muslo y la caña. Transferir los huesos fémur y tibia a un tubo de 50 mL con Medio RPMI 1640 estéril y lugar en hielo húmedo hasta que todos los huesos de tibia y fémur recogidos en el paso 1.2.7 se limpian de tejido muscular.
   9. Para aislar de la médula ósea, transferir un hueso de fémur o tibia a la vez (que ha sido limpiada como se describe en paso 1.2.8) del tubo de 50 mL a una placa de Petri (con un diámetro de 92 mm) con Medio RPMI 1640. Cortar los extremos del fémur o tibia con un bisturí para obtener acceso a la cavidad del hueso que contiene la médula ósea.
   10. Preparar un tubo de recogida de 50 mL con 5 mL de Medio RPMI 1640. Inserte una aguja de 26 G conectada a una jeringa de 1 mL llenada con 1 mL de Medio RPMI 1640 en la cavidad ósea y lavar la médula ósea de la cavidad en el tubo de colección empujando el émbolo.
   11. Repetir el punto 1.2.10 hasta que el hueso aparece luz y brillante (es decir, la cavidad ósea carece visiblemente rojizas de la médula). Deseche el hueso vacío.
   12. Repita los pasos 1.2.9 - 1.2.11, utilizando todos los huesos fémur y tibia del paso 1.2.8 y recoger todas las piezas recuperadas de la médula en el mismo tubo de la colección de 50 mL de paso 1.2.10. Mantenga el tubo de la colección en hielo húmedo hasta que todos los huesos del paso 1.2.8 han sido procesados por consiguiente.
   13. Pipeteando suavemente las piezas de la médula ósea roja, desmenuzable hacia arriba y hacia abajo para crear una suspensión unicelular. Filtrar la suspensión de la sola célula de la médula ósea a través de un colador de 40 μm malla pantalla celular a un tubo nuevo de la colección de 50 mL.
   14. Centrifugar el tubo de la colección de 50 mL que contiene la suspensión de la sola célula de médula ósea en 450 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
   15. Resuspender el precipitado en 5 mL de buffer lisis ACK (1 mM Na₂EDTA 10 mM KHCO₃144 mM NH₄Cl; pH 7.2) para lisis de glóbulos rojos. Incubar la suspensión celular por 3 min a temperatura ambiente. Después, añadir 10 mL de PBS solución a la suspensión de células.
   16. Centrifugar la suspensión a 450 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante y resuspender las células en 2 mL de solución de PBS.
   17. Contar las células de la médula ósea, utilizando un hemocitómetro. Conservar una alícuota de 6 x 10⁶ células para el análisis de citometría de flujo comprobar la pureza de las células después de la purificación de la célula (ver paso 1.2.20).
   18. Para el agotamiento de las células T de la suspensión de la sola célula de la médula ósea, utilice un kit de purificación de células disponibles comercialmente. Magnéticamente agotan CD90.2⁺ las células (es decir, linfocitos) de la médula ósea total, siguiendo el protocolo del fabricante.
   19. Contar las células de médula ósea t-célula-agotado que se han aislado como se describe en paso 1.2.18, usando un hemocitómetro. Conservar una alícuota de 1 x 10⁶ células para el análisis de citometría de flujo llevar a cabo más tarde como se describe en el paso 1.2.20.
       Nota: El rendimiento celular en promedio derivado de ratón de un donante es generalmente de 2 x 10⁷ a 3.4 x 10⁷ células de médula ósea t-célula-agotado.
   20. Confirmar una depleción de células T exitosa mediante citometría de flujo. Mancha 1 x 10⁶ células, de pasos 1.2.17 (células de la médula ósea antes de la separación magnética de células) y 1.2.19 (células de la médula ósea t-célula-agotado después de la separación magnética de células), con los siguientes anticuerpos: α-CD45.1 (A20), α-CD3 (17A2), () α-CD4 GK1.5) y α-CD8α (53-6.7). Utilice las células restantes del paso 1.2.17 como control sin manchas y para los controles solo manchas, para configurar el citómetro de flujo.
       1. Transferencia de 1 x 10⁶ células de cada muestra en un pocillo de una placa de 96 pocillos con fondo de V para llevar a cabo el procedimiento de tinción de citometría de flujo.
       2. Desactivación de las células dentro de la placa de 96 pocillos (paso 1.2.20.1) 450 x g durante 5 min a 4 ° C. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 100 μl de tampón FACS (filtrado de PBS suplementado con 3% de suero bovino).
       3. Centrifugar las células dentro de la placa de 96 pocillos en 450 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
       4. Añadir una cantidad adecuada de anticuerpos de elección (Comparar con paso 1.2.20) a las muestras para tinción solo en 100 μl de tampón FACS.
       5. Preparar una mezcla de todos los anticuerpos (mezcla principal) que contiene las cantidades apropiadas y suficientes para teñir por separado las alícuotas de células de médula ósea conservadas desde antes de (ver paso 1.2.17) y después (ver paso 1.2.19) magnético agotamiento del T-cell. Añadir 100 μl de la mezcla principal a ambas alícuotas.
       6. Añadir 100 μl de tampón FACS para la muestra sin manchas.
       7. Incube las células dentro de la placa de 96 pocillos por 20 min a 4 ° C en la oscuridad.
       8. Añada 100 μl de tampón FACS y centrifugar las células dentro de la placa de 96 pocillos en 450 x g durante 5 min a 4 ° C. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 100 μl de tampón FACS.
       9. Centrifugar las células a 450 x g durante 5 min a 4 ° C. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 250 μl de tampón FACS.
       10. Transferir las muestras a un tubo de fondo redondo poliestireno de 5 mL y analizarlos con un instrumento de citómetro de flujo que es capaz de detectar las moléculas fluorescentes que se utilizaron para identificar los anticuerpos empleados para caracterizar las muestras de células (ver paso 1.2.20).
       11. Comparar la composición de la célula antes y después de la separación magnética de células.
           Nota: Una pureza de aproximadamente el 95% CD45.1⁺CD3^– (es decir,-célula-agotado T de la médula) células dentro de la puerta vivo se logra.
   21. Lavar las suspensiones de células de médula ósea t-célula-agotado 2 x con solución de PBS (450 x g durante 5 min a 4 ° C) y, finalmente, resuspender las células en solución de PBS, ajuste la concentración celular a 5 x 10⁷ células/mL. Mantener las células en hielo húmedo hasta la inyección.
   22. Inyectar células de médula ósea t-célula-agotado en los ratones receptores, que se irradiaron el día anterior (véase sección 1.1).
       1. Coloque el ratón experimental en una cámara de prueba de fugas e inducir la anestesia por inhalación de hasta 4% isoflurano, hasta que el ratón está inconsciente. Confirmar la analgesia y pérdida de la conciencia por la prueba de la pérdida del reflejo del adrizamiento y la consiguiente pérdida del pedal retirar reflejo.
       2. Inyectar las células 5 x 10⁶ -célula-agotado T de la médula (es decir, 100 μl de 5 x 10⁷ células/mL) con solución de PBS utilizando una jeringa de 1 mL, equipada con una aguja de 30 G por vía intravenosa en el espacio retrobulbar que contiene el seno venoso.
3. Día 2: Transferencia de células T
   Nota: Los procedimientos descritos a continuación en una campana de cultivo estériles para tejidos y reactivos filtrados. Utilizar CD45.2 C57Bl/6 (tipo salvaje; Ratones como donantes las células aloreactivas T en peso). El uso de sistemas de marcador Congénicos permite el distinguishability entre receptor (CD45.2⁺ H2kd⁺ Balb/c mice) y tipos de donantes de células hematopoyéticas (células de médula ósea: CD45.1⁺ H2kb⁺ B6. Ratones SJL; alogénicas células T: CD45.2⁺ H2kb⁺ C57/Bl6 ratones).
   1. Eutanasia a ratones C57Bl/6 con arreglo a la aplicación de las directrices y las autoridades. Por lo tanto, anestesiar ratones por inhalación con una concentración de 5% de isoflurano. Continuar la exposición de isoflurano hasta 1 min después de la detención de la respiración y confirmar la eutanasia por dislocación cervical. Desinfectar la piel y la piel del ratón con etanol al 70%.
   2. Coloque un colador con una malla de 40 μm en un tubo de recogida de 50 mL. Extirpar el bazo y coloque en el colador.
   3. Con un émbolo de la jeringa, dilacerar el bazo en el colador. Lave el filtro y el émbolo de la jeringa con PBS para recoger todos los esplenocitos.
   4. Centrifugar las células dentro del tubo de la colección de 50 mL a 450 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
   5. Resuspender los esplenocitos en 3 mL de buffer lisis ACK lyse células de sangre rojas. Incubar la suspensión de células de 3 minutos después, añadir 10 mL de PBS y centrifugar las células a 450 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante y resuspender los esplenocitos en PBS.
   6. Contar las células de bazo, usando un hemocitómetro. Desviar una parte alícuota de 6 x 10⁶ células para el análisis de citometría de flujo, para evaluar la magnitud de la purificación en el paso 1.3.9.
   7. Para un total CD3⁺ T-cell aislamiento de esplenocitos totales, utilice un kit de purificación de células disponibles comercialmente. Aislar las células de T esplénicas, siguiendo el protocolo del fabricante.
   8. Cuenta el CD3 esplénico⁺ T células aisladas como se describe en paso 1.3.7, usando un hemocitómetro. Conservar una alícuota de 1 x 10⁶ T células para el análisis de citometría de flujo.
      Nota: El rendimiento sobre la media de T esplénico de las células por donantes de ratón aislado por rangos de separación de celdas magnéticas de 1.3 x 10⁷ 2 x 10⁷ células.
   9. Confirman el éxito del aislamiento de células T por citometría de flujo. Para una descripción detallada del Protocolo de tinción, conferir y siga pasos 1.2.20.1 - 1.2.20.10.
      1. Mancha 1 x 10⁶ esplenocitos de pasos 1.3.6 (antes de la separación magnética de células) y 1.3.8 (después de la separación magnética de la célula) con los siguientes anticuerpos: α-CD45.2 (104), α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) y α-CD8α (53-6.7).
      2. Utilice las células restantes del paso 1.3.6 como control sin manchas y para sola tinción con los anticuerpos respectivos, para configurar el citómetro de flujo.
      3. Comparar la composición de la célula antes y después de la separación magnética de células.
         Nota: Una pureza ≥ 95% de CD45.2⁺CD3⁺ T deben lograr células dentro de la puerta en linfocitos.
   10. Células de lavado la T x 2 con PBS (450 x g durante 5 min a 4 ° C) y, finalmente, resuspender las células en solución de PBS, ajuste la concentración celular a 7 x 10⁶ células/mL. Mantener las células en hielo hasta la inyección.
   11. Inyecte aloreactivas, esplénicas células T (ver paso 1.3.10) en ratones BALB/c irradiados que han recibido previamente CD45.1⁺ -célula-agotado T de la médula las células (ver paso 1.2.22).
       1. Inducen anestesia colocando el ratón experimental en una cámara hermética en la que se expone hasta el 4% de isoflurano hasta que pierde su sentido. Confirmar la analgesia y pérdida de la conciencia por la prueba de la pérdida del reflejo del adrizamiento y la consiguiente pérdida del pedal retirar reflejo.
       2. Inyecte 0.7 x 10⁶ alloreactive CD3⁺ T las células utilizando una jeringa de 1 mL, equipada con una aguja de 30 G   (es decir, 100 μl de 7 x 10⁶ células/mL) con solución de PBS (ver paso 1.3.10), por vía intravenosa en la retrobulbar espacio de los ratones para inducir GvHD. denominar estos ratones como el grupo experimental.
       3. Inyectar un grupo diferente de ratones con 100 μl de PBS solo, por vía intravenosa en el espacio retrobulbar, y denominar a este grupo como el grupo de control, posteriormente llamado "trasplantados de células T no (no) ratones".

2. evaluación de GvHD sistémica

Nota: Realizar este procedimiento en un entorno semi estériles en una sala experimental con licencia y equipado para el manejo de ratones vivos dentro de las instalaciones animales.

1. Seguir el curso clínico de la GvHD en ratones individuales; en concreto, evaluar y anotar los ratones experimentales 3 x por semana para detectar la presencia de síntomas clínicos de la GvHD, basado en un sistema de puntuación se describe a continuación y adaptado de un sistema de puntuación establecido previamente por Cook et al.⁶.
   1. Pesar cada ratón individualmente, registrar el peso y calcular thespecific pérdida de peso en relación con el peso del cuerpo que fue determinada antes del inicio del experimento (correspondiente al 100%) en el día 0 (paso 1.1.2). Anotar una pérdida de peso de menos del 10% del peso inicial con una pérdida de peso de más del 25% con grado 3, grado 0 y una pérdida de peso entre 10% y 25% con grado 1.
   2. Anotar el nivel de actividad de cada ratón, ratones exigentes con un nivel de actividad normal (puntuación = 0) de los ratones con un nivel de actividad moderadamente disminuida (puntuación = 1) y ratones con comportamientos fijos a menos que estén estimulados externamente (puntuación = 2).
   3. Marcar la textura de la piel, tal modo discriminar un pelaje normal, brillante y moderno (puntuación = 0) de un pelaje rizado moderado (puntuación = 1) y la presencia de calvas (puntuación = 2).
   4. Marcar la textura de la piel, piel normal que discrimina (puntuación = 0) de puntos esporádicos de descamación de la piel (por ejemplo, en la cola y las patas) (puntuación = 1) y escala obvio y áreas de la piel dolor (puntuación = 2).
   5. Analizar la consistencia de las fracciones de heces secretadas. Puntuación de taburete con una normal (es decir, consistencia dura) con el grado 0, taburete con taburete blando y deformable con grado 1 y sin ninguna consistencia y por lo tanto, con diarrea severa con grado 2 en las heces.
   6. En Resumen todos los parámetros por separado anotados a una máxima puntuación clínica de 12 por ratón.
2. Considerar y evaluar los criterios del Cesar el experimento de debido al nivel de gravedad de la enfermedad actual del ratón individual, con arreglo a las directrices institucionales aplicando y autorizado protocolo animal.

3. evaluación de GvHD Intestinal

1. Puntuación de las lesiones relacionadas con el EICH por mini-endoscopia de la región colorrectal distal
   NOTA:Realizar esto en un entorno semisterile en una sala experimental con licencia y equipado para el manejo de ratones vivos dentro de las instalaciones animales. Usar una plataforma mini-endoscópica que es aprobado para el uso de pequeños animales.
   1. Prepare el dispositivo endoscópico al cubrir el telescopio con (1,9 mm de diámetro) y una longitud de 10 cm con la vaina de la examinación endoscópica. Limpiar y esterilizar el endoscopio con agua y etanol.
   2. Encender el ordenador, la fuente de luz de xenón ajustable y el módulo de la cámara y ajustar el enfoque de forma que los objetos cerca de la lente dan una imagen clara.
   3. Conecte la bomba de aire a la vaina endoscópica. Para visualizar la corriente de aire, sumergir la punta del endoscopio en un vaso de vaso de precipitados llenado de agua. Regular la corriente de aire mediante el ajuste de la válvula entre la bomba de aire y la vaina endoscópica. Ajustar a una corriente de aire lenta y constante, reflejada en unos continuamente ascendente burbujas.
   4. Coloque un ratón en una cámara de prueba de fugas. Inducir la anestesia por inhalación de hasta 4% isoflurano hasta que el ratón está inconsciente. Confirmar la analgesia y un estado ausente de los reflejos por la prueba de la pérdida del reflejo del adrizamiento y la consiguiente pérdida del pedal retirar reflejo.
   5. Use una máquina de anestesia veterinaria apropiada según el protocolo animal utilizado. Transferir el ratón de la cámara en el espacio de trabajo de la colonoscopia. Aquí, posición del ratón anestesiado, con su nariz en la nariz (que está conectada al aparato de anestesia), en un limpio trabajo vaina para que el ratón está en una posición propensa, que enfrenta al experimentador con sus cuartos traseros.
   6. Para mantener la anestesia durante el procedimiento de colonoscopia, reducir la concentración de isoflurano a aproximadamente el 2%. Controlar respiración y respuesta a la estimulación durante la colonoscopia el mouse y ajustar la concentración de isoflurano en el vaporizador, si es necesario. Cubrir los ojos del ratón con ungüento para evitar que se seca.
   7. Control de la eficacia de la anestesia pellizcando entre los dedos del ratón. En el caso de ausencia de reactividad, proceda al paso 3.1.8.
   8. Levante la cola justo por encima de la raíz de la cola con una mano y con cuidado Introduzca el endoscopio, colocado en el otro lado, a través del ano en el recto.
   9. Mientras que la corriente de aire infla el lumen del colon, lentamente y con cuidado pasar el endoscopio hacia adelante en dirección aboral.
   10. Colocar el endoscopio en el lumen colónico y mantener esta posición con el fin de minimizar el contacto con la pared colónica y a evitar los arañazos, lesiones relacionadas con la pared más profunda (por ejemplo, dando por resultado la sangría), o incluso perforación de la pared (ver paso 3.1.17) . Este paso de control permanentemente observando la secuencia de vídeo (es decir, bajo la constante visualización del compartimiento del colon).
   11. Si las heces constricción la vista, retire el endoscopio y realizar un enema por vía rectal de lavado con hasta 2 mL de solución salina, utilizando una pipeta Pasteur suave. Utilice como poco líquido como sea posible, para evitar una dilución involuntaria de las heces y otros efectos secundarios afectando negativamente las características de la superficie de la mucosa y, en definitiva, los resultados de puntuación.
   12. Trate de colocar regularmente el endoscopio en un definido (es decir,, distintos) sitio anatómico en el colon distal para estandarizar el marcador de inflamación colónica y optimizar la comparabilidad de resultados entre ratones y a través de experimentos con calificaciones.
       Nota: Normalmente, con el endoscopio rígido, una profundidad máxima de 4 cm puede llegar por la vía rectal. Entre 2 y 4 cm de aborally, el colon regularmente se convierte en una flexión que no se puede pasar con el colonoscopio rígido. Uso de la región del colon distal adyacente a la flexión como el marcador predeterminado punto.
   13. Empezar a grabar la secuencia de vídeo y empezar con el marcador de la inflamación.
   14. Evaluar la inflamación relacionada con la EICH de los dos puntos al anotar los parámetros explicados y descritos en la tabla 1 y figura 3.
       1. Mover el endoscopio en la puntuación punto suavemente y ligeramente detrás y hacia adelante para evaluar los diferentes parámetros.
       2. Evaluar el parámetro de "transparencia", así como la "consistencia de las heces", colocando el endoscopio en una distancia más amplia en lo referente a la pared colónica.
       3. Evaluar los parámetros "granularidad" y "vascularización" colocando el endoscopio en proximidad cercana a la pared colónica. Para esta tarea, aplique tensión bien dosificada cuidadosamente a la pared colónica con la punta del endoscopio.
   15. Al finalizar el proceso de calificación, detener la grabación.
       Nota: Después, el clip de video grabado puede ser utilizado en total o para generar imágenes representativas (es decir, imágenes) de los criterios evaluados endoscópicamente mini en general contribuyendo a los inflamación colónica.
   16. Retire con cuidado el endoscopio.
   17. Deje de exposición de isoflurano al transferir el ratón a una jaula separada en la que se expone a aire ambiente. Caliente el ratón con una lámpara de luz roja y observar el ratón hasta que se recupera de la anestesia y recupera el sentido completo.
       Nota: Debido a la inflación del aire del colon durante la endoscopia, la región abdominal del ratón puede aparecer sopló para arriba directamente después. Mientras que esto es normal y de naturaleza transitoria, prolongadas signos de inflación masiva e incluso progresiva del abdomen y la falta de recuperación del ratón pueden indicar una perforación accidental de los dos puntos (en este caso, el ratón deben ser sacrificados ««««inmediatamente).
   18. Recuperación completa, coloque el ratón en su jaula correspondiente.
   19. Método opcional: también es posible tomar biopsias de tejido guiado por la vista. Seguir los siguientes pasos.
       Nota: La colonoscopia se realizará de la misma manera como se describe en pasos 3.1.1 - 3.1.18, con las siguientes modificaciones.
       1. En el paso 3.1.1, utilice una vaina de Examen endoscópico con un canal de trabajo integrado, en lugar de una vaina simple examen sin canales de trabajo, para cubrir el telescopio. Introducir un fórceps de biopsia en el canal de trabajo hasta que su punta es apenas visible delante del endoscopio en la pantalla porque esto evita en gran medida lesiones no intencionales en el intestino.
       2. Proceder con pasos 3.1.2 - 3.1.11. Insertar el endoscopio en el colon y empuje cuidadosamente hacia adelante al punto de interés.
       3. Emplear la ayuda de un segundo experimentador para la tarea de tomar biopsias de tejido colónico. Pedir el segundo experimentador para navegar por la punta de las pinzas de biopsia para la región colónica de elección empujando las pinzas dentro del canal de trabajo lentamente hacia adelante hasta que las mordazas de las pinzas se pueden abrir. Ver constantemente la secuencia de vídeo durante este procedimiento para minimizar el riesgo de lesionar la pared colónica.
       4. Recuperar una muestra de tejido de la pared colónica con cuidado abriendo y cerrando las mandíbulas de las pinzas de biopsia.
          Nota: Hacerlo con precaución para evitar la perforación de la pared colónica. En el raro caso de una perforación colónica, sacrificar inmediatamente el ratón afectado mediante la aplicación de medidas de conformidad con las directrices institucionales y bajo la administración continua de anestésicos.
       5. Tire y retire las pinzas cerradas fuera del canal de trabajo. Retire a la muestra de las mordazas de las pinzas de biopsia por inmersión y agitación con cuidado las pinzas abiertas en solución de PBS estéril. Después, seleccione las condiciones de almacenamiento adecuada para la muestra de tejido, según los análisis posteriores previstos. Después de la desinfección con etanol al 70%, el fórceps puede ser reutilizado para tomar otras biopsias.
       6. Después de tomar biopsias, retire el endoscopio y terminar la colonoscopia como se describe en pasos 3.1.16 - 3.1.18.
2. Análisis histopatológico
   1. Entre 26 y 30 días después de la irradiación de rayos x, eutanasia a los ratones receptores allo-HCT según aplicando las autoridades y las directrices. Para ello, anestesiar los ratones por la inhalación de 5% de isoflurano. Continuar con la exposición de isoflurane durante 1 minuto después de la detención de la respiración y confirmar la eutanasia por dislocación cervical. Desinfectar cuidadosamente la piel y la piel del ratón con etanol al 70%.
   2. Abrir la cavidad abdominal y retire los dos puntos. Transfiéralo a un plato de Petri (con un diámetro de 92 mm) con PBS.
   3. Llene una punta del dosificador de 5 mL con PBS. Con la ayuda de una pinza Semken con una longitud de 13 cm y filo curvadas consejos, deslizar la parte distal del colon (aproximadamente 5 mm) sobre la punta de la punta del dispensador. Fijar los dos puntos con las pinzas en la punta del dispensador y lavar el colon con PBS presionando el émbolo de la punta del dispensador para eliminar las heces del intestino.
   4. Cortar un segmento colónico situado a unos 5 mm del ano, con la ayuda de un bisturí.
   5. Fijar a la muestra de intestino resecado en 4,5% de formaldehído durante la noche. Antes de inclusión en parafina, coloque el tejido en posición vertical.
   6. Corte 3 μm cortes del tejido parafina-encajado dos puntos transversales y tinción con hematoxilina y eosina (HE), utilizando protocolos de tinción.
   7. Preparar el teñido él secciones transversales de las muestras de tejido del colon.
   8. Adaptado de la matriz de puntuación por Kaplan et al¹², histopathologically puntuación de la actividad inflamatoria semiquantitatively, con puntuaciones de 0-3: sin inflamación (puntuación = 0), inflamación leve (puntuación = 1), moderada inflamación (puntuación = 2), y la inflamación severa (puntuación = 3).
      Nota: Lo ideal sería emplear para esta tarea la experiencia de un patólogo experimentado en la evaluación de GvHD intestinal murino y ciego a la naturaleza experimental y grupos de control.

Resultados

El protocolo actual, describir la evaluación mini-endoscópica de lesiones asociadas de GvHD intestinales del colon distal, ha sido establecido y validado en ratones sometidos previamente a la inducción sistémica de un modelo de GvHD aguda severa. En este estudio, usamos una clase de MHC unió completamente mal sistema modelo en que BALB/c ratones fueron irradiados letalmente, seguida por el trasplante de médula alogénico t-célula-agotado y por la administración de inducir GvHD all...

Discusión

El protocolo describe la metodología de la inducción y evaluación mini-endoscópica del colon fenotipo observado en el curso de GvHD intestinal. Sirve el mayor propósito de permitir a los científicos estudiar GvHD intestinal longitudinalmente y de forma no invasiva en el transcurso de toda enfermedad (es decir, desde el inicio de la manifestación colónica y la progresión hasta la actividad máxima de la enfermedad).

Sin embargo, hay algunos pasos críticos y limitaciones importantes in...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator	Gamma-Service Meical GmbH
Phosphate-buffered saline (PBS )	Sigma-Aldrich Co. LLC.	D8662-6x500ML
Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips)	Fine Science Tools	11009-13
Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm)	Fine Science Tools	14090-09
RPMI-1640 Medium	Sigma-Aldrich Co. LLC.	R8758-500ML
Hypodermic needle (26 G)	B. Braun Melsungen AG	4657683
1 mL syring	B. Braun Melsungen AG	9166017V
50 mL tube	Sarstedt Ag & Co.KG	62,547,254
Cell strainer with a 40 µm mesh screen	BD Falcon	352340
Ammonium chloride (NH4Cl)	Sigma-Aldrich Co. LLC.	11209	ingredient of ACK lysing buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA)	Carl Roth GmbH & Co.KG	8043.2	ingredient of ACK lysing buffer
Potassium bicarbonate (KHCO3)	Merck KGaA	1,048,540,500	ingredient of ACK lysing buffer
CD90.2 MicroBeads, mouse	Miltenyi Biotec GmbH	130-049-101	magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells
Pan T Cell Isolation Kit II, mouse	Miltenyi Biotec GmbH	130-095-130	magnet cell separation to isolate splenic T cells
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731)	Biolegend	109822
Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645)	Biolegend	100214
FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691)	Biolegend	100406
PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168)	Biolegend	110730
APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753)	Biolegend	100714
Filtrated bovine serum	Pan Biotec	P40-47500	ingredient of FACS buffer
96-well polystyrene V-bottom plates	Greiner Bio-One	651201
Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL)	Falcon	352052
BD LSRFortessa II flow cytometer	BD Bioscience Co.
Insulin syringe with sterile interior (30 G)	BD	324826
Oxy Vet Oxymat 3	Eickemeyer		oxygen concentrator  for anesthesia
NarkoVet	Eickemeyer	213062
Plexiglass chamber	Eickemeyer	214620
Straight Forward Telescope	KARL STORZ SE &Co KG	64301 AA	part of the experimental setup for colonoscopy
Protection and Examination Sheath	KARL STORZ SE &Co KG	61029 C	part of the experimental setup for colonoscopy
Examination Sheath with working channel	KARL STORZ SE &Co KG	61029 D	part of the experimental setup for colonoscopy
Biopsy Forceps	KARL STORZ SE &Co KG	61071 ZJ	part of the experimental setup for colonoscopy
175 Watt SCB XenonLight Source	KARL STORZ SE &Co KG	20132120	part of the experimental setup for colonoscopy
Fiber Optic Light Cable	KARL STORZ SE &Co KG	495 NL	part of the experimental setup for colonoscopy
Image 1 S3 Camera Head	KARL STORZ SE &Co KG	22220030	part of the experimental setup for colonoscopy
Image 1 SCB Camera Control Unit	KARL STORZ SE &Co KG	22200020	part of the experimental setup for colonoscopy
LCD monitor	Olympus	OEV181H	part of the experimental setup for colonoscopy
Forane / Isofluran	AbbVie Inc.	B506
Formaldehyde solution 37 %	Carl Roth GmbH & Co.KG	7398.1
5.0 mL Dispenser tip	Eppendorf AG	30089456