אינדוקציה של מעיים שתל – מול – מארח מחלות והערכה מיני-אנדוסקופית שלה בעכברים בשידור חי

Summary

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מתאר השתלת תא גזע allogeneic hematopoietic ומאפשרת חוזרות הערכות מיני-אנדוסקופית של המעי הגס דיסטלי באתרו נוכחות, מאפיינים של חומרת דלקת מעי בתוך בשידור חי עכברים הסובלים מעיים שתל – מול – מארח מחלות.

Abstract

חריפה שתל – מול – מארח מחלות (GvHD) מייצג סיבוך חמור ביותר כי חולים שעברו בעבר גזע allogeneic התא hematopoietic (מאפשר-של HCT) השתלת הפנים, קשורה לעיתים קרובות עם תוצאה קליניים עניים. למשל, GvHD ביטויים של העור הם בדרך כלל מגיבים טיפולים מדכאים חיסונית הוקמה ותוך, לפיכך, לא לוקח קורס קטלנית, הנוכחות, האינטנסיביות של GvHD מעיים, במיוחד חלקים באמצע להתחתון של הבטן, משפיעים מאוד על התוצאה, באופן כללי ההישרדות של חולים עם חריפה GvHD. טיפולית אפשרויות מוגבלות בעיקרו הסוכנים מדכאים חיסונית קלאסי מניבים רק מתון מקלים-מחלת אפקטים. לפיכך, ידע מפורט על המפל רקמות תושב המערכת החיסונית, שינויים microbiota מעיים, התגובה סטרומה לפני, בעת ואחרי תחילת GvHD מעיים נחוצים בדחיפות כדי להבין את האירועים ובמנגנונים שבבסיס שלה הפתוגנזה לפתח אפשרויות טיפוליות חדשניות. מודלים מאתר של GvHD מועסקים לעיתים קרובות כדי לזהות ולהעריך באופן פונקציונלי מולקולות מסלולים putatively נהיגה GvHD מעיים. עם זאת, אומר במפורש לפקח ולהעריך דלקת מעיים לאורך זמן חסרים בעצם מאז הוקמה ציונים כדי להעריך כיתה GvHD אקוטי באופן שגרתי מורכבות של פרמטרים שונים המשקפים מעדיף GvHD מערכתית ביטויים. הערכה מפורטת של GvHD מעיים הוגבלה ללימודים שימוש בעכברים לאללה, ובכך למעשה למעט האורך (קרי, קינטי) ניתוחים של תא שטיפת המעי הגס תחת תנאי הניסוי (למשל, נוגדן בתיווך המצור ציטוקינים proinflammatory) בעכברים בשידור חי (קרי, in vivo). ההערכה באתרו מיני-אנדוסקופית של המעי הגס דיסטלי של מאפשר של HCT-מטופלים עכברים המתוארים כאן מאפשר a) הערכה מאקרוסקופית מפורט של היבטים שונים של דלקת מעיים ו- b) את האפשרות לאסוף דגימות רקמה עבור ניתוחים במורד הזרם- נקודות זמן שונות במהלך תקופת תצפית. באופן כללי, הגישה מיני-אנדוסקופית מספק התקדמות גדולה ב פרה לא פולשנית ניטור והערכה של GvHD מעיים.

Introduction

Hematopoietic ממאירות הנובעת ישירות מן התא בתאי גזע hematopoietic בלתי מבוקרת, מתקדם במהירות, הפרעות קשות בתיווך החיסונית לעתים קרובות אינדיקציות לביצוע מאפשר-של HCT^1,2. עם זאת, למרות החשבונאי המופע של התגובה שתל-נגד-גידול prognostic מועיל, התורם לימפוציטים הם לעתים קרובות גרימת וקידום התקפה בתיווך החיסון לא רצויים של רקמה בריאה רכיבים בתוך המטופל מאפשר-של HCT , תהליך זה נקרא שתל – מול – מארח מחלות³. ביטויים בבטן, GvHD מעיים, כביכול מייצגים הסיבוך המפחיד ביותר של GvHD אקוטי, צורות חמורות אשר קשורים באופן שגרתי עם תמותה גבוהה^1,2,4.

באופן כללי, מאתר דגמי מאפשר-של HCT הופיעו כלי יקר ערך לזהות וללמוד מנגנוני החיסון בתיווך שבבסיס בפתוגנזה של GvHD⁵. עם זאת, ההערכה קינטי, למשל, ההשפעות המיטיבות של התערבויות טיפוליות הרומן לאורך זמן בעכברים בשידור חי באופן שגרתי מבוסס על הקביעה של GvHD קליניים ציונים⁶. בעוד אלה ציונים מתאימים לשקף, למשל, המחלה הנטל הכולל (קרי, מערכתית GvHD), קליניים ציונים חוסר הרגישות באופן אמין לשקף ביטויים ייחודיים (למשל, בבטן). לפיכך, מסקנות, למשל בכל הנוגע תופעות בטן-מגן של התערבות טיפולית נתון, בהתבסס על אלה הבקיע מערכות בדרך כלל נופל קצר.

למרות התקדמות גדולה דרך ההמצאה של הרומן לכל הגוף הדמיה שיטות בשילוב עם השימוש של עכבר גנטי זוהרים או פלורסנט דגמי^7,8, מתודולוגיות ישירות, במיוחד להעריך את המעי ביטוי של GvHD בעכברים בשידור חי חסרים. ומכאן, הרציונל מאחורי הפרוטוקול של הערכת אנדוסקופי פנוטיפ GvHD מעיים המתוארים בסעיף הבא הוא כדי להתגבר על מכשול זה. יתר על כן, המוטיבציה היא גם לצמצם מספרים עכברים ניסיוני מאז, עד כה, הערכה מפורטת של המאפיינים הסלולר, מורפולוגיים מולקולרית (למשל, על ידי histopathology או ביולוגיה מולקולרית) של GvHD מעיים ביטוי דרש בסופו של דבר את ההקרבה של העכבר ניסיוני.

המוסד שלנו דיווח בעבר על המתודולוגיה של הערכה מיני-אנדוסקופית של המעי הגס הגילויים במהלך syngeneic קוליטיס מודלים⁹. בפרוטוקול המובאת כאן, יש מעודן ואנו הותאם colonoscopic את הניקוד מטריקס עבור מונחי-alloresponse קוליטיס בעכברים בשידור חי עם מעיים GvHD על השתלת של alloreactive של HCT ושל התורמים לימפוציטים מחלקה MHC מלא תואמים הגדרה . זיהינו ארבעה פרמטרים מתאימים לשקף נגעים חוקן הקשורות GvHD מעיים. יתר על כן, הקמנו מערכת המאפשרת מכויל לדירוג של כל דטרמיננטה יחידה, וכתוצאה מכך ניקוד חדש המודיעה בקלות לקורא חומרת מעיים GvHD נוכח עכבר נתון בנקודת זמן נתונה. ניתוחים histopathological אישר כי ניקוד אנדוסקופי מעל לסף מסוים הוא אמין חיזוי דלקת ברקמות כיתה בינונית-גבוהה. לפיכך, מיני-אנדוסקופית להערכה מופיעה כדי לייצג תחליף עובד histopathology תקן זהב הדורש באופן שגרתי את ההקרבה של העכברים ניסיוני. חשוב, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם כמעט בכל נקודת זמן נתון, ניתן להשתמש שוב ושוב במהלך המחלה^10,11. יתר על כן, בניגוד השימוש ביולומינסנציה תלוית גישות, אין אמצעי העבודה רגשניים ולגזול כמו intercrossing גנטית שונה עכברים נדרשים, לפיכך, המתודולוגיה יכול להיות מיושם על העכבר כמעט בכל תחום ריבית.

יחדיו, בהתחשב ההיבט הקליני מזיקה מחולי מאפשר-של HCT GvHD מעיים חמורה, התקדמות מדעית מהירה, תובנה רבה יותר המנגנונים המולקולריים שבבסיס בפתוגנזה המערכת החיסונית הם צורך דחוף. באופן דומה, שיקולים חשובים, אתי דורשים כי הרווח של הידע צריך להיות מושגת עם הקישורים של מספר מינימלי של עכברים ניסיוני. לפיכך, שניהם מזוהה טענות על קהילת המחקר חקר GvHD מעיים ניתן מתקדמים על-ידי יישום הערכות טורי מיני-אנדוסקופית של המעי הגס בשרשרת עבודה ניסויית כדי לפקח, כיתה GvHD מעיים עכבר ניסיוני בשידור חי מודלים, כמו שמתואר המאומת בפרוטוקול המוצג כאן.

Protocol

ניסיוני בשיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הממשלה של Mittelfranken, בוואריה, גרמניה.

1. GvHD אינדוקציה

1. יום 0: גופית של העכברים הנמען
   1. השתמש הנשי CD45.2⁺ H2kd⁺ BALB/c עכברים כי הם בן כ נמענים לפחות 10 שבועות.
   2. שוקל ולהקליט את המשקל של העכברים הנמען לפני GvHD אינדוקציה.
      הערה: ודא כי הנמען יש משקל גוף מינימלית של 20 גרם. משקל הגוף מתחיל ישמש הערך הפניה כדי לחשב אובדן המשקל של העכבר בודדים במהלך הגיוס GvHD והתקדמות.
   3. מקום עכברים עד חמישה המכולה של רנטגן בעוצמה.
   4. להאיר את העכברים מאת גופית עם מנה אחת של 8 Gy של הרנטגן. להשתמש Cs¹³⁷ מקור קרינה.
2. יום 1: שיחזור של עכברים לקרינה עם T-תא-דלה מח עצם
   הערה:השתלת תאי מח עצם allogeneic, וגם עם מיתאר מפורטת בסעיף 1.2, צריך לקחת את המקום בתוך 24 שעות לאחר הקרנה. ביצוע ההליכים המתוארים להלן בתרבות רקמות סטריליים הוד ולהשתמש ריאגנטים מסוננים. השתמש allogeneic CD45.1/Ly5.1 B6. SJL-Ptprca Pepcb/ עכברים BoyCrl כמו תרומות מח עצם T תאים-מדולדל.
   1. המתת חסד CD45.1/Ly5.1 B6. עכברים SJL תתרום תאים במח העצם allogeneic בהתאם להנחיות מוסדיים, 12-24 שעות לאחר ההקרנות של העכברים BALB/c הנמען. בשביל זה, עזים ומתנגד של B6 CD45.1/Ly5.1. עכברים SJL על ידי שאיפה של 5% איזופלוריין. להמשיך עם החשיפה איזופלוריין מעל 1 דקות לאחר נושם המעצר ואשר המתת חסד מאת נקע בצוואר הרחם.
   2. לחטא את הפרווה והעור של העכבר ביסודיות עם 70% אתנול.
   3. מיקום העכבר על גבי נקי עובד נדן כך העכבר הוא במצב שכיבה, עם ישבנו הנפוח שלה מול הנסיין. הרם את הפרווה-האכילס עם קצה מלקחיים Semken באורך של 13 ס מ וטיפים מעוקל משונן. פצעים וחתכים בעור בין המלחציים העקב במספריים בסדר מוקשח 8.5 ס"מ, עם טיפים ישר.
   4. להאריך את החתך cranially (כלומר, מתוך בעקב הרגל התחתונה, הירך באזור מפרק הירך). הסר את העור והפרווה הגפיים האחוריות בעזרת המלקחיים.
   5. בצע את ההליך על האיבר הינד אחרים.
   6. הסר את הגפיים האחוריות על ידי חיתוך באמצעות מפרקי הירך הסמוך.
   7. לחתוך את הכפות האחורי. לחתוך דרך הברך. אחסן את הירך ואת shank של כל איבר. האחוריות יחד בצלוחית 92 מ מ מלא באגירה פוספט (PBS) תמיסת מלח על קרח.
   8. לנקות את העצמות עצם הירך, שוקה בקפידה על-ידי הסרת רקמת שריר רב ככל האפשר בכל הירך ואת shank. להעביר את העצמות עצם הירך, שוקה שפופרת 50 מ ל מלא בינוני RPMI 1640 סטרילי, במקום זה על קרח רטוב עד שכל העצמות השוקה, עצם הירך שנאספו בשלב 1.2.7 מנוקים מכל רקמת השריר.
   9. כדי לבודד את מח העצם, להעביר עצם הירך או טיביה אחת בכל פעם (אשר נוקה כשלב שמתואר 1.2.8) מהצינור 50 מ ל צלחת פטרי (בקוטר של 92 מ מ) מלא RPMI 1640 בינוני. לחתוך את הקצוות של עצם הירך או טיביה עם איזמל כדי לקבל גישה אל החלל של עצם המכיל את מח העצם.
   10. הכן צינור אוסף 50 מ עם 5 מ של RPMI 1640 בינוני. הוספת מחט 26 גרם המצורפת מזרק 1 מ"ל מלא 1 מ"ל של מדיום RPMI 1640 לתוך חלל העצם, לשטוף את לשד העצם החלל לתוך הצינור אוסף על ידי דחיפת הבוכנה.
   11. חזור על שלב 1.2.10 עד העצם מופיע בהיר ומבריק (קרי, חלל העצם נטול בעליל אדמדם מח העצם). למחוק את העצם ריק.
   12. חזור על שלבים 1.2.9 - 1.2.11, באמצעות כל עצמות הירך, שוקה מהשלב 1.2.8, ולאסוף את כל החלקים מח עצם התאושש בצינור אוסף של 50 מ ל אותו מהשלב 1.2.10. שמור את הצינור אוסף על קרח רטוב עד שכל העצמות מהשלב 1.2.8 עובדו בהתאם.
   13. ליצור השעיה תא בודד על ידי ברכות pipetting את החלקים מח עצם סמוק-פנים, ומתפורר למעלה ולמטה. לסנן התליה תא בודד מח עצם באמצעות מיקרומטר 40 מסך תא מסננת רשת מניחים על צינור אוסף 50 מ.
   14. Centrifuge 50 מ ל אוסף הצינור המכיל התליה תא בודד מח העצם ב x 450 גרם במשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
   15. Resuspend בגדר ב 5 מ ל ומונה lysing מאגר (1 מ מ נה₂EDTA; 10 מ מ KHCO₃; 144 מ"מ NH₄Cl pH 7.2) עבור פירוק תאי הדם האדומים. דגירה התליה תא למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, מיד להוסיף 10 מ של PBS פתרון התליה תא.
   16. Centrifuge את המתלים ב x 450 גרם במשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend תאי 2 מ"ל של PBS פתרון.
   17. לספור תאי מח העצם, שימוש של hemocytometer. לשמור על aliquot של תאים⁶ 6 x 10 לניתוח cytometry זרימה לבדוק את הטוהר של התאים לאחר תא טיהור (ראה שלב 1.2.20).
   18. לשימוש דלדול של תאי T מ מח עצם התליה תא בודד, ערכת טיהור תא זמינים מסחרית. דיסקות לרוקן תאים CD90.2⁺ (קרי, לימפוציטים) של תאי מח עצם הכולל, לפי הפרוטוקול של היצרן.
   19. לספור תאי T תאים-מדולדל מח עצם שהיו מבודדים כפי שמתואר בשלב 1.2.18, באמצעות hemocytometer. לשמור על aliquot של עונה 1 פרק 10 תאים⁶ לניתוח cytometry זרימה שיבוצעו בהמשך, כפי שמתואר בשלב 1.2.20.
       הערה: התשואה הממוצעת תא נגזר תורם אחד העכבר היא בדרך כלל 2 x 10⁷ 3.4 x 10⁷ תאים T תאים-מדולדל מח עצם.
   20. לאשר דלדול T-cell מוצלחת על ידי cytometry זרימה. כתם עונה 1 פרק 10⁶ תאים, נשמר מן השלבים 1.2.17 (תאי מח עצם לפני ההפרדה תא מגנטי) ו- 1.2.19 (תאי T תאים-מדולדל מח עצם לאחר ההפרדה תא מגנטי), עם נוגדנים הבאים: α-CD45.1 (A20), α-CD3 (17A2), (α-CD4 GK1.5), וα-CD8α (53-6.7). להשתמש את התאים הנותרים מהשלב 1.2.17 כפקד וללא רבב של ועבור מכתים יחיד פקדים, כדי להגדיר את זרימת cytometer.
       1. להעביר עונה 1 פרק 10⁶ תאים כל מדגם טוב של צלחת 96-ובכן עם V-תחתון כדי לבצע את cytometric זרימה מכתים בהליך.
       2. ספין למטה התאים בתוך הצלחת 96-ובכן (שלב 1.2.20.1) ב x 450 גרם במשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend תאי µL 100 FACS מאגר (PBS בתוספת 3% מסוננת סרום שור).
       3. Centrifuge התאים בתוך הצלחת 96-ובכן ב x 450 גרם במשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
       4. להוסיף כמות מספקת של הנוגדן של בחירה (השוואה עם צעד 1.2.20) הדגימות עבור צביעת יחיד ב- 100 µL מאגר FACS.
       5. להכין תערובת של כל נוגדנים (בסיס mix) המכיל את כמויות מתאימות מספיק כדי בנפרד מכתים את מח העצם תא aliquots נשמר מן קודם (ראה שלב 1.2.17) ואחרי (ראה שלב 1.2.19) מגנטי דלדול T-cell. להוסיף 100 µL של המיקס בסיס שני aliquots.
       6. להוסיף רק 100 µL מאגר FACS המדגם וללא רבב.
       7. דגירה התאים בתוך הצלחת 96-ובכן כעשרים דקות ב 4 ° C בחושך.
       8. להוסיף 100 µL מאגר FACS, centrifuge את התאים בתוך הצלחת 96-ובכן ב x 450 גרם במשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend תאי µL 100 FACS המאגר.
       9. Centrifuge התאים ב x 450 גרם במשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend תאי µL 250 FACS המאגר.
       10. להעביר את הדגימות צינור עגול-התחתון מ ל פוליסטירן ולנתח אותם עם מכשיר cytometer זרימה הוא מסוגל לזהות מולקולות פלורסנט ששימשו לתייג את הנוגדנים מועסק כדי לאפיין את דגימות תאים (ראה שלב 1.2.20).
       11. להשוות את הרכב התא לפני ואחרי ההפרדה תא מגנטי.
           הערה: טוהר כ- 95% CD45.1⁺CD3^– (קרי, T-תא-דלה מח עצם) תאים בתוך השער חיים מושגת בדרך כלל.
   21. לשטוף את המתלים תא T תאים-מדולדל מח עצם 2 x עם פתרון PBS (450 x g למשך 5 דקות ב 4 ° C) ו, לבסוף, resuspend את התאים בפתרון PBS, התאמת את הריכוז תא 5 x 10⁷ תאים/מ ל.... לשמור את התאים על קרח רטוב עד הזריקה.
   22. מזריקים תאים במח העצם T תאים-מדולדל לתוך העכברים הנמען, אשר היו מוקרן יום לפני (ראו סעיף 1.1).
       1. הנח את העכבר ניסיוני בתוך תא עמיד בפני נזילה, לגרום הרדמה על ידי שאיפה של עד 4% איזופלוריין, עד העכבר מחוסר הכרה. לאשר שיכוך כאבים ואובדן הכרה על-ידי בדיקת אובדן רפלקס שקמה בעצמה אחרי שמפילים ולסגת אובדן עוקבות של דוושת רפלקס.
       2. להזריק 5 x 10⁶ תאים T תאים-מדולדל במח העצם (קרי, 100 µL של 5 x 10⁷ תאים/מ ל...) המכיל PBS הפתרון באמצעות מזרק 1 מ"ל מצויד עם מחט 30 גרם דרך הווריד לחלל retrobulbar המכיל הסינוס ורידים.
3. יום 2: העברת תאי T
   הערה: לבצע את ההליכים המתוארים להלן בשכונה תרביות רקמה סטרילי והשתמש ריאגנטים מסוננים. השתמש CD45.2 C57Bl/6 (פראי-סוג; עכברים WT) כמו לתורמים alloreactive T תאים. השימוש congenic מרקר מערכות מאפשרת את distinguishability בין המטופל (CD45.2⁺ H2kd⁺ Balb/c עכברים) וסוגי תא hematopoietic התורם (תאים במח העצם: CD45.1⁺ H2kb⁺ B6. SJL עכברים; תאי T allogeneic: CD45.2⁺ H2kb⁺ C57/Bl6 עכברים).
   1. המתת חסד C57Bl/6 עכברים בהתאם החלת המוסדיים הנחיות ורשויות. לכן, עזים ומתנגד עכברים באמצעות אינהלציה עם ריכוז של 5% איזופלוריין. להמשיך את החשיפה איזופלוריין עד 1 דקות לאחר נושם המעצר ואשר המתת חסד מאת נקע בצוואר הרחם. לחטא את הפרווה והעור של העכבר ביסודיות עם 70% אתנול.
   2. מניחים מסננת עם מסך 40 µm רשת על צינור אוסף 50 מ. להסיר את הטחול ומניחים אותו על גבי מסננת.
   3. עם פומפה מזרק, comminute הטחול ב מסננת. לשטוף את מסננת ואת משאבת מזרק עם PBS כדי לאסוף את כל splenocytes.
   4. Centrifuge התאים בתוך הצינור אוסף 50 מ ל- x 450 גרם עבור 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
   5. Resuspend את splenocytes ב 3 מ"ל של מאגר lysing ACK כדי lyse כדוריות דם אדומות. דגירה התליה תא 3 דקות לאחר מכן, להוסיף 10 מ ל- PBS, centrifuge התאים ב 450 x גרם במשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend את splenocytes ב- PBS.
   6. לספור תאי הטחול, שימוש של hemocytometer. להסיט את aliquot של תאים⁶ 6 x 10 לניתוח cytometry זרימה, כדי להעריך את סדר הגודל של טיהור בשלב 1.3.9.
   7. עבור CD3 סך⁺ T-cell הבידוד מאפליקציות הכולל splenocytes, להשתמש ערכת טיהור תא זמינים מסחרית. לבודד תאי T הטחול, ע פ הפרוטוקול של היצרן.
   8. לספור את הטחול CD3⁺ T תאים מבודדים כפי שמתואר צעד 1.3.7, שימוש של hemocytometer. לשמר את aliquot של עונה 1 פרק 10 תאים⁶ T לניתוח cytometry זרימה.
      הערה: התשואה על הממוצע של הטחול T תאים לכל העכבר התורם מבודדת על ידי טווחי תאים מגנטי ההפרדה בין 1.3 x 10⁷ 2 x 10⁷ תאים.
   9. לאשר את ההצלחה של הבידוד תא T על ידי cytometry זרימה. לקבלת תיאור מפורט של פרוטוקול מוכתמים, להתייעץ, בצע שלבים 1.2.20.1 - 1.2.20.10.
      1. כתם splenocytes⁶ עונה 1 פרק 10 של שלבים 1.3.6 (לפני ההפרדה תא מגנטי) ו 1.3.8 (לאחר ההפרדה תא מגנטי) עם נוגדנים הבאים: α-CD45.2 (104), α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) וα-CD8α (53-6.7).
      2. להשתמש התאים הנותרים מהשלב 1.3.6 כפקד וללא רבב של ועבור מכתים יחיד עם נוגדנים המתאימים, להגדיר את cytometer זרימה.
      3. להשוות בין הרכב התא לפני ואחרי תא מגנטי ההפרדה.
         הערה: טוהר של % ≥95 CD45.2⁺CD3⁺ T תאים בתוך השער בשידור חי לימפוציט צריך להתבצע.
   10. ווש ה-T תאים 2 x עם PBS (450 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C) ו, לבסוף, resuspend את התאים בפתרון PBS, התאמת את הריכוז תא 7 x 10⁶ תאים/מ ל.... לשמור את התאים על הקרח עד הזריקה.
   11. מזריקים alloreactive, הטחול בתאי T (ראה שלב 1.3.10) לתוך לקרינה BALB/c עכברים שקיבלו בעבר CD45.1⁺ תאי T תאים-מדולדל מח עצם (ראה שלב 1.2.22).
       1. לגרום הרדמה על ידי הצבת העכבר ניסיוני בתוך תא עמיד בפני נזילה שבו הוא נחשף עד 4% איזופלוריין עד שזה מאבד את ההכרה שלו. לאשר שיכוך כאבים ואובדן הכרה על-ידי בדיקת אובדן רפלקס שקמה בעצמה אחרי שמפילים ולסגת אובדן עוקבות של דוושת רפלקס.
       2. להזריק 0.7 x⁶ 10 alloreactive CD3⁺ T תאים באמצעות מזרק 1 מ"ל מצויד עם מחט 30 גרם   (כלומר, 100 µL של 7 x 10⁶ תאים/מ ל...) המכיל PBS פתרון (ראה שלב 1.3.10), דרך הווריד לתוך retrobulbar מרחב של העכברים, לזירוז GvHD. Denominate אלו עכברים כמו קבוצת הניסוי.
       3. להזריק לקבוצה אחרת של עכברים עם µL 100 ל- PBS לבד, דרך הווריד לחלל retrobulbar, ויש denominate קבוצה זו כחלק מקבוצת הביקורת, המכונה "לא-T-תא-מושתלים (לא) עכברים".

2. הערכה של GvHD מערכתית

הערה: ביצוע הליך זה סביבה סטרילית למחצה בחדר ניסיוני מורשה, מצוידים לטיפול עכברים חיים בתוך המתקן בעלי חיים.

1. בצע את המסלול הקליני של GvHD בעכברים בודדים; באופן ספציפי, להעריך, ציון העכברים ניסיוני 3 x שבוע לנוכחות של GvHD סימפטומים קליניים, בהתבסס על שיטת הניקוד המתוארים להלן, הותאם ממערכת הניקוד נוסדה קודם לכן על ידי קוק et al.⁶.
   1. שוקל את העכבר כל אחד בנפרד, רושמות את המשקל, לחשב את אובדן משקל הגוף thespecific ביחס משקל הגוף זה נקבע לפני תחילת הניסוי (תואם ל- 100%) ביום 0 (שלב 1.1.2). ציון במשקל של פחות מ-10% מכלל המשקל ההתחלתי עם ציון 0, במשקל בין 10% ל- 25% עם כיתה 1 במשקל של יותר מ- 25% עם ציון 3.
   2. ציון רמת הפעילות של כל עכבר, מפלה עכברים עם רמת פעילות רגילה (ציון = 0) של עכברים עם רמת פעילות מצומצמת למדי (ציון = 1) ועכברים עם התנהגות נייח אלא אם כן הם מגורה באופן חיצוני (ציון = 2).
   3. ציון המרקם הפרווה, ובכך להפלות נורמלי, מבריק, האטרקציות, כגון פרווה (ציון = 0) מן פרווה בינוני הסתור (ציון = 1) ואת נוכחותם של קרחות (ציון = 2).
   4. להבקיע את מרקם העור, להפלות לעור רגיל (ציון = 0) מאתרי סדיר של קנה מידה של העור (למשל, על הזנב ואת הכפות) (ציון = 1) ושינוי גודל ברור של אזורי עור כואבות (ציון = 2).
   5. לנתח את מרקם של שברים מופרשים בצואה. ציון שרפרף רגיל (כלומר, עקביות קשה) בציון 0 שרפרף עם שרפרף deformable ורך עם כיתה 1, צואה ללא כל עקביות, ומכאן, עם שלשול עם ציון 2.
   6. לסכם כל הפרמטרים בנפרד הצליחו ציון קליני מקסימלי של 12 לכל העכבר.
2. שקול, להעריך את הקריטריונים של הפסקת הניסוי בשל רמת חומרת המחלה הנוכחית של העכבר בודדים, בהתאם להנחיות המוסדית החלה ומורשים פרוטוקול בעלי חיים.

3. הערכה של GvHD מעיים

1. הניקוד של נגעים הקשורות GvHD באמצעות אנדוסקופיה המצומצמת של אזור המעי הדיסטלי
   הערה:ביצוע זה סביבה semisterile בחדר ניסיוני מורשה, מצוידים לטיפול עכברים חיים בתוך המתקן בעלי חיים. השתמש תחנת עבודה מיני-אנדוסקופי כך אושרה לשימוש של חיות קטנות.
   1. הכן את התקן אנדוסקופי בכך שכיסתה את הטלסקופ (קוטר של 1.9 מ מ), באורך של 10 ס מ עם נדן בדיקה אנדוסקופית. לנקות ולחטא אנדוסקופ עם מים ואתנול.
   2. לעבור על המחשב, מקור האור מתכווננת קסנון במודול המצלמה, כוון את הפוקוס באופן כי אוביקטים בסביבות העדשה לתת תמונה ברורה.
   3. להתחבר משאבת האוויר נדן אנדוסקופי. כדי להמחיש את זרם האוויר, לטבול את קצה אנדוסקופ לתוך כוס גביע מלא במים. לווסת את זרם אוויר על-ידי התאמת את השסתום בין משאבת האוויר ו נדן אנדוסקופי. להסתגל זה זרם אוויר איטית מתמדת, בא לידי ביטוי כמה עולה ללא הרף בועות.
   4. המקום עכבר לתא עמיד בפני נזילה. לגרום הרדמה על ידי שאיפה של עד 4% איזופלוריין עד העכבר מחוסר הכרה. לאשר שיכוך כאבים, מצב הנעדר של הרפלקסים על-ידי בדיקת אובדן רפלקס שקמה בעצמה אחרי שמפילים ולסגת אובדן עוקבות של דוושת רפלקס.
   5. השתמש מכונת הרדמה וטרינריים המתאימים על פי פרוטוקול בעלי חיים שמשמש. להעביר את העכבר מן החדר לסביבת העבודה של קולונוסקופיה. . כאן, מיקום העכבר anesthetized, עם האף שלה ב- nosecone (אשר מחובר המכשיר הרדמה), על גבי נקי עובד נדן כך העכבר הוא במצב שכיבה, מול הנסיין עם ישבנו הנפוח שלה.
   6. כדי לשמור על הרדמה במהלך ההליך קולונוסקופיה, להפחית את ריכוז איזופלוריין כ- 2%. לפקח על הנשימה של העכבר, בתגובה לגירוי במהלך הקולונוסקופיה ולהתאים את הריכוז איזופלוריין-מאדה במידת הצורך. מכסים את העיניים של העכבר עם salve כדי למנוע מהם להגיע יבש.
   7. לשלוט את היעילות של ההרדמה על ידי צובט בין האצבעות של העכבר. במקרה של נעדר תגובתיות, להמשיך לצעוד 3.1.8.
   8. הרם את הזנב רק מעל לבסיס הזנב עם יד אחת ולהוסיף בזהירות אנדוסקופ, מוצבים ביד אחרים, דרך פי הטבעת לתוך פי הטבעת.
   9. בעוד זרם האוויר מנפח לומן המעי הגס, לאט ובזהירות להעביר אנדוסקופ קדימה בכיוון aboral.
   10. למקם אנדוסקופ באמצע שטיפת המעי הגס לומן, לשמור על עמדה זו על מנת לצמצם מגע עם הקיר שטיפת המעי הגס ועל מנת למנוע שריטות, פציעות הקשורות קיר עמוק יותר (למשל, וכתוצאה מכך הדימום), או אפילו קיר מחורר (ראה שלב 3.1.17) . לשלוט שלב זה על-ידי צפייה לצמיתות את זרם הווידאו (קרי, תחת חזותית מתמדת של תא שטיפת המעי הגס).
   11. אם הצואה מתכווצים התצוגה, להסיר אנדוסקופ, לבצע חוקן על ידי שטיפה רקטאלית עם עד 2 מ"ל של תמיסת מלח, באמצעות פיפטה רך של פסטר. להשתמש נוזלי קטן ככל האפשר, כדי למנוע של דילול לא מכוונות של הצואה ואפקטים משניים אחרים באופן שלילי משפיע על המאפיינים של השטח הרירית, בסופו של דבר, התוצאות הבקיע.
   12. נסו למקם באופן קבוע אנדוסקופ-כהגדרתו (קרי, נפרדות) אתר אנטומי בתוך המעי הגס דיסטלי לתקנן על מניה של דלקת מעי וכדי לייעל את comparability של הניקוד תוצאות בין עכברים לאורך ניסויים.
       הערה: בדרך כלל, עם אנדוסקופ נוקשה, ניתן להגיע לעומק מקסימלי של 4 ס מ באמצעות המסלול רקטלי. בין 2 ל 4 ס מ. aborally, המעי הגס באופן קבוע הופך flexure שאי אפשר לעבור עם הקולונוסקופ נוקשה. השתמש באזור המעי הגס הסמוך יש flexure בתור ברירת המחדל על מניה ספוט.
   13. להתחיל להקליט את זרם הווידאו ותתחיל עם החריצים של דלקת.
   14. להעריך את דלקת הקשורות GvHD של המעי הגס כשקלע את הפרמטרים הסביר, מתואר טבלה 1 , איור 3.
       1. להזיז אנדוסקופ הבקיע ספוט בעדינות, מעט מאחור - וקדימה כדי להעריך את הפרמטרים השונים.
       2. להעריך את הפרמטר "המוגבהת", וכן "צואה עקביות", על-ידי הצבת אנדוסקופ במרחק רחב יותר ביחס לקיר המעי הגס.
       3. להעריך את הפרמטרים "צפיפות" ואת "vascularity" על-ידי הצבת אנדוסקופ קרוב לדופן המעי הגס. עבור משימה זו, בזהירות להחיל את המתח היטב עצומות לדופן המעי הגס עם קצה אנדוסקופ.
   15. עם סיומו של תהליך הניקוד, לעצור את ההקלטה.
       הערה: לאחר מכן, סרטון הווידאו המוקלט ניתן להשתמש סה כ או המשמש ליצירת להחליפן בתמונות (קרי, צילומי מסך) הקריטריונים מיני-endoscopically המוערך בסך הכל תורם לדלקת המעי הגס.
   16. הסר בזהירות אנדוסקופ.
   17. להפסיק איזופלוריין תערוכות על ידי העברת העכבר לכלוב נפרד שבו הוא נחשף הסביבתית. לחמם את העכבר עם מנורה האורות האדומים ולבחון את העכבר עד והשיחזור ההרדמה להכרה מלאה.
       הערה: בשל האינפלציה אוויר של המעי הגס במהלך סי. טי, אזור הבטן של העכבר עשוי להופיע פצפוצי למעלה ישירות לאחר מכן. אמנם זה נורמלי ולא של הארעיות, סימנים ממושך של אינפלציה מסיבית, אפילו המתקדמת של הבטן וכישלון של שחזור של העכבר עשוי להצביע על ניקוב לא מכוונות של המעי הגס (במקרה זה, הצרכים העכבר המתה מיד).
   18. על התאוששות מלאה, מקם את העכבר בחזרה לכלוב שלו בהתאמה.
   19. הגישה אופציונלי: זה גם אפשרי לקחת ביופסיות רקמות מודרך בתצוגה. לנקוט בצעדים הבאים.
       הערה: הקולונוסקופיה יבוצעו באותו אופן כפי שתואר בשלבים 3.1.1 - 3.1.18, עם השינויים הבאים.
       1. בשלב 3.1.1, להשתמש נדן בדיקה אנדוסקופית עם ערוץ עבודה מובנית, במקום נדן בדיקה פשוטה ללא ערוצי עבודה, מכסים את הטלסקופ. להציג מלקחיים ביופסיה לתוך הערוץ לעבוד עד את קצהו יהיה גלוי רק מול אנדוסקופ על מסך וידאו כי זה בעיקר מונע פגיעה לא מכוונת אל המעי.
       2. להמשיך עם שלבים 3.1.2 - 3.1.11. הכנס אנדוסקופ לתוך המעי הגס ופי לדחוף אותו בקפידה קדימה לנקודה של ריבית.
       3. מעסיקים את עזרתו של הנסיין השני של הפעילות של לקיחת ביופסיות רקמת מעי. שואל הנסיין השני כדי לנווט את קצה המלקחיים ביופסיה לאזור חוקן של בחירה על ידי דחיפת המלקחיים בתוך התעלה לעבוד לאט קדימה עד שניתן לפתוח מלתעותיו של המלקחיים. כל הזמן לצפות זרם הווידאו במהלך הליך זה כדי למזער את הסיכון ופצעו את הקיר חוקן.
       4. לשחזר דגימת רקמה קיר המעי הגס על ידי פתיחה וסגירה מלתעותיו של המלקחיים ביופסיה בקפידה.
          הערה: . תעשה את זה בזהירות כדי למנוע את הנקב. של הקיר חוקן במקרה נדיר של ניקוב המעי הגס, מיד להקריב את העכבר המושפעים על-ידי החלת מידות בהתאם להנחיות מוסדיים, תחת ממשל רציפה של חומרי הרדמה.
       5. משוך לאחור ולהסיר את המלקחיים סגור התעלה עבודה. הסר את הדגימה מתוך מלתעותיו של המלקחיים ביופסיה על ידי טבילה ורעדתי בקפידה המלקחיים נפתח ב- PBS פתרון סטרילי. לאחר מכן, בחר תנאי האחסון הנכון דגימת הרקמות, לפי הבדיקות במורד הזרם המתוכנן. לאחר חיטוי עם 70% אתנול, המלקחיים ניתן להשתמש כדי לקחת עוד יותר ביופסיות.
       6. לאחר נטילת ביופסיות, להסיר אנדוסקופ וסיום הקולונוסקופיה כמתואר בצעדים 3.1.16 - 3.1.18.
2. ניתוח histopathological
   1. בין ימים 26 ו- 30 לאחר ההקרנות רנטגן, המתת חסד העכברים הנמען מאפשר-של HCT בהתאם החלת המוסדיים הנחיות ורשויות. בשביל זה, עזים ומתנגד העכברים על ידי שאיפה של 5% איזופלוריין. להמשיך עם החשיפה איזופלוריין עבור 1 דקות לאחר נושם המעצר ואשר המתת חסד מאת נקע בצוואר הרחם. ביסודיות לחטא את הפרווה והעור של העכבר עם 70% אתנול.
   2. פתיחת חלל הבטן ולהסיר את המעי הגס. להעביר את זה צלחת פטרי (בקוטר של 92 מ"מ) עם PBS.
   3. למלא טיפ מנפק מ עם PBS. בעזרת מלקחיים Semken באורך של 13 ס מ וטיפים מעוקל משונן, להחליק החלק הדיסטלי של המעי הגס (כ 5 מ מ) על פני קצהו של קצה מנפק. לתקן את המעי הגס עם המלקחיים בקצה מנפק ובזהירות ריקון המעי הגס עם PBS על-ידי לחיצה הבוכנה של קצה מנפק להסיר צואה מהמעי.
   4. לגזור מקטע מעי ממוקם כ 5 מ מ פי הטבעת, בעזרת אזמל.
   5. את הדגימה resected בטן ב- 4.5% פורמלדהיד בן לילה. לפני להטביעו פרפין, מקם את הרקמה בתנוחה זקופה.
   6. לחתוך 3 מיקרומטר חצו מקטעי רקמת המעי הגס פרפין-מוטבע, תכתים אותם ועם hematoxylin אאוזין (HE), באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים מוכתמים.
   7. להכין שהוכתמו הוא חתכי רוחב של דגימות רקמה המעי הגס.
   8. הותאם מתוך מטריצת התוצאות שדווחו על-ידי et al. קפלן¹², histopathologically להבקיע את פעילות דלקתית semiquantitatively, עם ציונים מגיל 0-3: אין דלקת (ציון = 0), דלקת קלה (ציון = 1), בינוני דלקת (ציון = 2), דלקת חמורה (ציון = 3).
      הערה: באופן אידיאלי, מעסיקים עבור משימה זו המומחיות של פתולוג מנוסה בהערכה של GvHD מעיים מאתר, לראות את הטבע של ניסיוני והקבוצות בקרה.

תוצאות

בפרוטוקול הנוכחי, המתארת את ההערכה מיני-אנדוסקופית של המעי GvHD-הקשורים נגעים של המעי הדיסטלי, הוקמה ואומת בעכברים בעבר נתון של אינדוקציה מערכתית של מודל GvHD אקוטי חמורה. במחקר זה, היינו מחלקה MHC אני תואמים באופן מלא מערכת מודל אשר BALB/ג' עכברים היו אולם מוקרן, ולאחר מכן את השת?...

Discussion

הפרוטוקול מתאר את המתודולוגיה של אינדוקציה ובחינת מיני-אנדוסקופית פנוטיפ חוקן נצפתה במהלך GvHD מעיים. היא מגישה את מטרת הרחב מאפשר למדענים ללמוד GvHD מעיים longitudinally ו noninvasively במהלך המחלה כולו (כלומר, מתוך תחילתה של ביטוי חוקן והתקדמות עד פעילות המחלה מקסימלי).

עם זאת, ישנם כמה של?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator	Gamma-Service Meical GmbH
Phosphate-buffered saline (PBS )	Sigma-Aldrich Co. LLC.	D8662-6x500ML
Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips)	Fine Science Tools	11009-13
Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm)	Fine Science Tools	14090-09
RPMI-1640 Medium	Sigma-Aldrich Co. LLC.	R8758-500ML
Hypodermic needle (26 G)	B. Braun Melsungen AG	4657683
1 mL syring	B. Braun Melsungen AG	9166017V
50 mL tube	Sarstedt Ag & Co.KG	62,547,254
Cell strainer with a 40 µm mesh screen	BD Falcon	352340
Ammonium chloride (NH4Cl)	Sigma-Aldrich Co. LLC.	11209	ingredient of ACK lysing buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA)	Carl Roth GmbH & Co.KG	8043.2	ingredient of ACK lysing buffer
Potassium bicarbonate (KHCO3)	Merck KGaA	1,048,540,500	ingredient of ACK lysing buffer
CD90.2 MicroBeads, mouse	Miltenyi Biotec GmbH	130-049-101	magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells
Pan T Cell Isolation Kit II, mouse	Miltenyi Biotec GmbH	130-095-130	magnet cell separation to isolate splenic T cells
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731)	Biolegend	109822
Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645)	Biolegend	100214
FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691)	Biolegend	100406
PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168)	Biolegend	110730
APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753)	Biolegend	100714
Filtrated bovine serum	Pan Biotec	P40-47500	ingredient of FACS buffer
96-well polystyrene V-bottom plates	Greiner Bio-One	651201
Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL)	Falcon	352052
BD LSRFortessa II flow cytometer	BD Bioscience Co.
Insulin syringe with sterile interior (30 G)	BD	324826
Oxy Vet Oxymat 3	Eickemeyer		oxygen concentrator  for anesthesia
NarkoVet	Eickemeyer	213062
Plexiglass chamber	Eickemeyer	214620
Straight Forward Telescope	KARL STORZ SE &Co KG	64301 AA	part of the experimental setup for colonoscopy
Protection and Examination Sheath	KARL STORZ SE &Co KG	61029 C	part of the experimental setup for colonoscopy
Examination Sheath with working channel	KARL STORZ SE &Co KG	61029 D	part of the experimental setup for colonoscopy
Biopsy Forceps	KARL STORZ SE &Co KG	61071 ZJ	part of the experimental setup for colonoscopy
175 Watt SCB XenonLight Source	KARL STORZ SE &Co KG	20132120	part of the experimental setup for colonoscopy
Fiber Optic Light Cable	KARL STORZ SE &Co KG	495 NL	part of the experimental setup for colonoscopy
Image 1 S3 Camera Head	KARL STORZ SE &Co KG	22220030	part of the experimental setup for colonoscopy
Image 1 SCB Camera Control Unit	KARL STORZ SE &Co KG	22200020	part of the experimental setup for colonoscopy
LCD monitor	Olympus	OEV181H	part of the experimental setup for colonoscopy
Forane / Isofluran	AbbVie Inc.	B506
Formaldehyde solution 37 %	Carl Roth GmbH & Co.KG	7398.1
5.0 mL Dispenser tip	Eppendorf AG	30089456