JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

وقد وُصف بروتوكول مفصل لتنقية الأجسام المضادة أحادية النسيلة من سائل زراعة الخلايا المحصد (HCCF) من المفاعلات المجهرية الآلية وتحليلها لاحقاً. كما يتم عرض استخدام التحليلات لتحديد سمات الجودة الحرجة (CQAs) وتعظيم حجم العينة المحدود لاستخراج المعلومات الحيوية.

Abstract

الأجسام المضادة أحادية النسيلة (mAbs) هي واحدة من المنتجات البيولوجية الأكثر شعبية وتتميز بشكل جيد المصنعة اليوم. الأكثر شيوعا المنتجة باستخدام خلايا المبيض الهامستر الصينية (CHO) ، يجب تحسين الثقافة وظروف العملية لتحقيق أقصى قدر من titers الأجسام المضادة وتحقيق ملامح الجودة المستهدفة. عادة، يستخدم هذا التحسين المفاعلات الحيوية الدقيقة الآلية (15 مل) لفحص ظروف عملية متعددة بالتوازي. وتشمل معايير التحسين الأداء الثقافي وسمات الجودة الحرجة (CQAs) لمنتج الأجسام المضادة أحادية النسيلة (mAb)، والتي قد تؤثر على فعاليته وسلامته. وتشمل مقاييس الأداء الثقافي نمو الخلايا واستهلاك المغذيات، في حين تشمل الـ CQAs ملامح N-glycosylation والتجميع الخاصة بـ mAb، ومتغيرات الشحن، والوزن الجزيئي. يصف هذا البروتوكول المفصل كيفية تنقية وتحليل عينات HCCF التي ينتجها نظام مفاعل ميكروبروبيو آلي للحصول على مقاييس ونواتج أداء قيّمة. أولا، بروتين آلي يتم استخدام طريقة بروتين سريع للكروماتوغرافيا السائلة (FPLC) لتنقية mAb من عينات زراعة الخلايا التي تم حصادها. وبمجرد تركيزها، يتم تحليل ملامح الغليكان عن طريق قياس الطيف الكتلي باستخدام منصة محددة (راجع جدولالمواد). يتم تحديد الأوزان الجزيئية الأجسام المضادة وملامح التجميع باستخدام حجم استبعاد الكروماتوغرافيا متعددة زاوية تشتت الضوء (SEC-MALS)، في حين يتم تحليل المتغيرات تهمة باستخدام الكهروريس المنطقة الشعرية رقاقة (mCZE). بالإضافة إلى مقاييس الأداء الثقافي التي تم التقاطها أثناء عملية المفاعل الحيوي (أي قدرة الثقافة على البقاء، وحساب الخلايا، والأيض الشائع بما في ذلك الجلوتامين، والجلوكوز، واللاكتات، والأمونيا)، يتم تحليل الوسائط المستهلكة لتحديد المواد الغذائية المقيدة تحسين استراتيجيات التغذية وتصميم العملية الشاملة. ولذلك، يتم أيضا وصف بروتوكول مفصل للقياس الكمي المطلق للأحماض الأمينية عن طريق قياس الطيف الكتلي للكروماتوغرافيا السائلة (LC-MS) من الوسائط المستهلكة. تستفيد الأساليب المستخدمة في هذا البروتوكول من الأنظمة الأساسية عالية الإنتاجية المتوافقة مع أعداد كبيرة من العينات ذات الحجم الصغير.

Introduction

يتم استخدام علاجات البروتين لعلاج مجموعة متنوعة متزايدة من الحالات الطبية بما في ذلك مضاعفات زراعة الأنسجة، واضطرابات المناعة الذاتية، والسرطانات1. منذ عام 2004، وثقت إدارة الغذاء والدواء في الولايات المتحدة (USFDA) نسبة متزايدة من طلبات الترخيص البيولوجي (BLAs) من جميع الموافقات التي ينظمها مركز تقييم الأدوية والبحوث (CDER)، مع BLAs تمثل أكثر من 25٪ في عامي 2014 و 20152.

وبالنظر إلى هذا السوق الآخذة في التوسع، تواجه الشركات المصنعة للمستحضرات الصيدلانية الحيوية تحديا مع تقديم المزيد من المنتجات بسرعة مع نوعية متسقة. وقد ركزت الجهود الرامية إلى زيادة إنتاج المنتجات على هندسة الخلايا CHO وفحص خط الإنتاج، على الرغم من أن أهم التحسينات تعزى إلى التقدم المحرز في تحسين استراتيجية وسائل الإعلام / تغذية والضوابط البيئية ثقافة الخلايا1، 3 , 4 , 5 خلال عملية التصنيع.

وبما أن الـ mAbs يتم إنتاجها في نظام بيولوجي، يمكن أن يكون هناك تباين البروتين المتأصل. يمكن تغيير تكوين الأجسام المضادة بعد الترجمة، مثل غليكوزيل أو تتأثر بالتدهور أو ردود الفعل الأنزيمية. هذه الاختلافات الهيكلية قد تثير ردود فعل مناعية خطيرة أو تغييرربط الأجسام المضادة، والتي بدورها يمكن أن تقلل أو القضاء على وظيفة العلاجية المقصود5 . وهكذا، يتم رصد ومراقبة سمات الجودة الحرجة (CQAs) من الأجسام المضادة أحادية النسيلة - الملف الشخصي N-غليكان، وتوزيع متغير المسؤول، والنسبة المئوية للجسم المضاد في شكل أحادي - بانتظام والسيطرة عليها كجزء من نهج الجودة حسب التصميم (QbD) خلال عمليات التصنيع1،6. في بيئة الإنتاج المنظمة، يجب أن تفي البروتينات العلاجية بمعايير القبول ليتم ترخيصها كمنتج دواء تجاري معتمد7. الطرق المعروضة هنا عادة ما تكون جزءا من عملية توصيف الجودة لجسم مضاد7،8، وسوف يكون أي عالم البروتين على دراية باستخدامها.

وفي العملالسابق 9، تم وصف تطبيق وتشغيل المفاعلات المجهرية لفحص الإنتاجية العالية لظروف زراعة الخلايا في المعالجة الأحيائية في المنبع. المنتج النقي الذي تم الحصول عليه من ظروف وسائل الإعلام المختلفة يخضع لتحليل N-glycan باستخدام LC-MS. يمكن الكشف عن أنماط Glycosylation من البروتينات العلاجية وتتميز باستخدام تقنيات LC-MS10،11،و وقد تم ربط وجود مختلف أنواع الجلايسان إلى المعلمات العملية الحيوية مثل استراتيجية تغذية، ودرجة الحموضة، ودرجة الحرارة12. كما يتم تقييم تأثير ظروف الوسائط المختلفة على جودة المنتج، التي تشير إليها النسبة المئوية لـ IgG الناتجة في شكل أحادي، مع تحديد الحجم اللوني - تشتت الضوء متعدد الزوايا (SEC-MALS)13و14 , 15-يمثل ملف تعريف متغير الشحن عدداً من التعديلات16 التي يمكن أن تؤثر على وظيفة المنتج. الكهربائي للمنطقة المجهرية (mCZE) هو تقنية توفر وقت تحليل أسرع بكثير مقارنة بالتصوير اللوني التقليدي لتبادل الموجبة (CEX) وأساليب التركيز النظائري الشعرية (cIEF) المستخدمة في تحليل متغير الشحنة17 ،18. تم تحليل الوسائط مفاعل حيوي قضى لتتبع استهلاك الأحماض الأمينية أثناء إنتاج البروتين كما يتعلق بالتغيرات في سمات تحديد الأجسام المضادة19،20،21،22 , 23.

تسمح لنا تحليلات البروتين بتحديد معلمات العملية الحرجة (CPPs) استنادًا إلى العلاقات بين مدخلات العملية والتغيرات في الـ CQAs. وأثناء تطوير العمليات الأحيائية، فإن تحديد وقياس برامج الإنتاج الأنظف يبينان بشكل أساسي مراقبة العمليات ويضمنان عدم تغيير المنتج، وهو أمر أساسي في بيئات التصنيع التي تخضع لضوابط صارمة. في هذه الورقة، يتم عرض تقنيات تحليلية لقياس بعض الخصائص البيوكيميائية للبروتين الأكثر صلة بمنتجات CQAs (N-جليكان الشخصي، والمتغيرات المسؤولة، وتجانس الحجم).

Protocol

1. تنقية الأجسام المضادة

ملاحظة: المخزن المؤقت equilibration للجسم المضاد في المنزل هو 25 MM Tris، 100 مل كل العازلة elution المستخدمة هو 0.1 M حمض الخليك. المخازن المؤقتة والراتنج (البروتين A) تعتمد على الأجسام المضادة المحددة تنقية. حجم العمود يعادل ارتفاع السرير من الراتنج. يتم تحديد مقدار المرحلة المتنقلة المستخدمة من حيث حجم العمود.

  1. تهيئة نظام التنقية
    1. افتح البرنامج المرفق بنظام التنقية. باستخدام الإرشادات اليدوية، قم بمعادلة العمود مع المخزن المؤقت للتوازن بمعدل تدفق قدره 2 مل/دقيقة لمدة 40 دقيقة.
    2. في جامع الكسور، ضع 15 مل أنابيب مخروطية لجمع الأيلوات الأجسام المضادة النقية و50 مل أنابيب مخروطية لجمع التدفق من خلال غسل الملح عالية. تأكد من إعادة تعيين جامع الكسر إلى موضع البدء عن طريق فتح وإغلاق جامع الكسور قبل بدء التشغيل. يتم الاحتفاظ جامع الكسر عند 7 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن إعادة تعيين جامع الكسر يدوياً ضمن علامة التبويب جامع الكسر في إعدادات، لكل من أنابيب 15 مل و 50 مل.
  2. حقن عينة
    ملاحظة: تم الحصول على السائل زراعة الخلايا المقطوعة المستخدمة في الإجراءات التالية من خلايا المبيض الهامستر الصينية المستزرعة في المفاعلات الحيوية الدقيقة الآلية9.
    1. أضف سائل زراعة خلايا الحصاد المفلتر ة 0.22 م إلى حقنة فارغة سعة 12 مل، يتم تغطية نهاية فوهة الفوهة.
    2. عقد حقنة مع فوهة تواجه أسفل، إدراج الغطاس حقنة حتى جزء صغير من الغطاس هو في. التأكد من أن السائل لا يتسرب، بدوره حقنة مع فوهة تواجه وإزالة الغطاء.
    3. لا يزال عقد حقنة مع فوهة تواجه ما يصل، ودفع الاسطوانة لتبديد أي الهواء حتى السائل ثقافة الخلية هو في غيض من فوهة. إدراج فوهة حقنة في ميناء الحقن اليدوي على نظام تنقية وتطور لتشديد.
    4. دفع لأسفل على الغطاس حتى يتم حقن كل عينة ومرئية في المرفقة 10 مل حلقة عينة كبيرة حجم.
    5. افتح ملف الأسلوب المحفوظ. حفظ ملف النتيجة في الموقع المطلوب وحدد اسم الملف عند المطالبة. ضرب تشغيل بعد أن تم حقن العينة في حلقة عينة حجم كبير.
  3. تشغيل طريقة التنقية
    1. حدد الطريقة المحفوظة وانقر فوق تشغيل عند مطالبتك بواسطة برنامج الصك (الخطوة 1.2.5).
      ملاحظة: تم إعداد النظام لتشغيل الخطوات التالية. لا يحتاج المستخدم إلى القيام بأي شيء أثناء تشغيل الأداة.
    2. معادلة العمود مع ثلاثة مجلدات عمود (السير الذاتية) من المخزن المؤقت للتوازن بمعدل تدفق 2 مل/دقيقة. وبمجرد أن يتم معادلة العمود، سيقوم النظام، باستخدام حلقة عينة كبيرة من وحدات التخزين، بحقن العينة على العمود بمعدل تدفق قدره 1 مل/دقيقة.
    3. انخفاض في إشارة الأشعة فوق البنفسجية في 280 نانومتر يشير إلى أن يتم الانتهاء من تحميل العينة. اغسل العمود بمخزن عازل للتوازن بمعدل تدفق قدره 2 مل/دقيقة حتى تنخفض إشارة الأشعة فوق البنفسجية إلى أقل من 25 م.au.
    4. استخدم أربعة سير ذاتية من 25 مليون متر مربع مع 1 M NaCl في درجة الحموضة 7.5 لإجراء غسل الملح العالي الثانوي بمعدل تدفق 2 مل/دقيقة. سيقوم جامع كسر النظام بجمع أي بروتين/ حمض نووي يخرج من العمود أثناء غسل الملح في أنابيب 50 مل.
    5. تطبيق خمسة السير الذاتية من المخزن المؤقت elution بمعدل تدفق 1 مل / دقيقة لelute الأجسام المضادة خارج العمود. جمع eluate في أنابيب 15 مل على أساس إشارة الأشعة فوق البنفسجية؛ عندما تكون إشارة الأشعة فوق البنفسجية 280 فوق 35 ميوم أو، يبدأ جمع؛ تنتهي المجموعة عندما تنخفض الإشارة إلى أقل من 50 م.م.أو؛ وهذا ما يسمى قطع الذروة.
      ملاحظة: قطع الذروة يضمن تطبيع ملامح elution وتجنب المخلفات الذروة التي قد تحتوي على المجاميع البروتين24.
    6. اغسل العمود باستخدام ثلاثة سير ذاتية للمخزن الاحتياطي للتوازن. ينتهي السباق بعد خطوة الغسيل.
    7. بعد الإلتوى على الفور تحييد البروتين النقي باستخدام 1 M تريس قاعدة إلى رقم الحموضة من ~ 5.5. قياس تركيز البروتين باستخدام مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية فيس بحجم صغير عند 280 نانومتر و260 نانومتر وتخزينه عند درجة حرارة 4 درجة مئوية.
    8. تركيز الأجسام المضادة النقية باستخدام وحدات الطرد المركزي (الخطوة 2). ثم قم بإخضاع الأجسام المضادة النقية لتحليل الغليكان باستخدام LC-MS وبعد تحليل ملف تعريف التجميع باستخدام SEC-MALS (الخطوتان 3 و4).
      ملاحظة: لا ينبغي تجميد الأجسام المضادة النقية دون مزيد من تبادل العازلة كما دورات تجميد ذوبان متكررة يمكن أن يسبب التجميع وهطول الأمطار.

2. تركيز الأجسام المضادة النقية

ملاحظة: العازلة تريس خلات هو 0.1 M حمض الخليك تحييدها مع 1 M تريس قاعدة إلى درجة الحموضة من ~ 5.5.

  1. إدراج 100 كيلودي دا مرشحات في أنابيب الطرد المركزي.
  2. غسل المرشحات مع 500 درجة مئوية من الماء المقطر مزدوجة. الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 14،000 × ز في درجة حرارة الغرفة (RT). كرر هذه الخطوة مرتين. تجاهل الفيلتر.
  3. نقل المرشحات الشطف إلى أنابيب الطرد المركزي الطازجة وإضافة 500 درجة مئوية من العينة إلى كل مرشح. الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 14،000 × ز.
  4. عكس المرشح إلى أنبوب تدور جديدة. الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 1000 × ز لجمع العينة المركزة.
  5. تحديد تركيزات العينة باستخدام مقياس الطيف الضوئي UV-Vis. فارغة الطيفية باستخدام حل من العازلة تريس خلات. استخدام معامل انقراض البروتين من 1.37 مل • (مغ • سم)-1 في 280 نانومتر ل1٪ (٪ م / الخامس) حل IgG.
  6. استخدم العينة المركزة لإعداد 12.5 ميكرولتر من 2 ملغ/مل حل عمل لتحليل الغليكان و30 ميكرولتر من 3.5 ملغ/مل حل عمل لSEC-MALS.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا. وينبغي تبريد العينات عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. وعند تركيز 2 ملغم/مل، ينبغي أن تكون هذه العينات مستقرة لمدة ثلاثة أشهر على الأقل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية، بينما قد تتسارع التركيزات الأعلى.

3. تحليل N-غليكانباستخدام التحليل الطيفي الشامل

  1. N-جليكان وضع العلامات والعزل
    1. ابدأ بتركيزات الأجسام المضادة من 2 ملغ/مل في مخزن مؤقت مناسب مثل فوسفات الصوديوم المحايد أو سيترات أو حاجز HEPES. إعداد معيار mAb سليمة (مثل NIST mAb) في 2 ملغ / مل لمعالجة جنبا إلى جنب مع العينات التجريبية لتكون بمثابة مراقبة إيجابية.
      ملاحظة: يجب أن تكون الأجسام المضادة في المخزن المؤقت النهائي الذي لا يحتوي على SDS وأقل من 0.1 m nucleophiles (مثل Tris أو DTT أو glycine أو الهيستيدين). يجب إزالة SDS في المخزن المؤقت نموذج. إذا كانت النوى في المخزن المؤقت، ثم تخفيف لهم أو إجراء تبادل المخزن المؤقت لأنها سوف تتداخل مع مجموعة. يتم توفير البروتوكول العام مع مجموعة الغليكان.
    2. تخفيف 7.5 ميكرولتر من الأجسام المضادة مع 15.3 ميكرولتر من الماء LC-MS الصف في أنابيب 1 مل المقدمة مع مجموعة ثم تشوه باستخدام 6 ميكرولتر من 5٪ حل من السطحي صديقة للإنزيم وMS ودية في 90 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
    3. تبريد العينات لمدة 3 دقائق إلى درجة حرارة الغرفة (RT). ثم، إضافة 1.2 درجة مئوية من PNGase F وحضانة لمدة 5 دقائق في 50 درجة مئوية.
    4. بعد التبريد 3 دقائق إلى RT، تسمية N-غليكانات مشققة عن طريق إضافة 12 ميكرولتر من الفلورسنت وضع العلامات الكاشف المذاب في ثنائي ميثيل فورماميد اللامائية (DMF) والانتظار لمدة 5 دقائق.
    5. ضع لوحة كروماتوغرافيا التفاعل المائي (HILIC) في مشعب فراغ مع الشماة وعلبة النفايات. استخدام ماصة متعددة القنوات لأعداد كبيرة من العينات.
    6. حالة الآبار مع 200 درجة مئوية من الماء، حيث يتم تعديل الفراغ بحيث السائل سوف يستغرق 15-30 ثانية لتمرير من خلال الراتنج HILIC. Equilibrate مع 200 درجة مئوية من 85٪ ACN قبل تحميل خليط الغليكان ACN المخفف المسمى (400 درجة مئوية)، وتطبيق الفراغ بعد إضافة كل سائل جديد إلى الآبار. غسل الراتنج مع 600 درجة مئوية من 1٪ حمض الفورميك (FA) / 90٪ ACN مرتين.
    7. استبدل علبة النفايات بأنابيب تجميع 600 ميكرولتر. Elute وصفت N-غليكانمع SPE elution العازلة (3 elutions من 30 € L لكل منهما) في أنابيب جمع. تمييع elutions المجمعة مع 310 درجة مئوية من DMF / ACN عينة مخففة. ماصة العينات في قارورة العينات السيارات لتكون جاهزة لتحليل الفلورة (FLR)-MS.
      ملاحظة: هذه العينات مستقرة عند تخزينها في -80 درجة مئوية لمدة شهر واحد على الأقل. تخزين لوحة HILIC في التعبئة والتغليف الأصلي، مسجلة مغلقة وداخل المجفف للاستخدام في المستقبل.
  2. تحليل LC-MS من N-glycans المسمى
    1. تحليل عينات الإلوتيون N-glycan المسمى على نظام التصوير اللوني السائل فائق الأداء (UPLC) إلى جانب كاشف الفلورة ومطياف الكتلة الرباعيالوقت من الطيران (Q-ToF). استخدم عمودًا معتمدًا للفصل اللوني للغليكانات والحرارة إلى 60 درجة مئوية أثناء الفواصل.
      ملاحظة: يجب مسح العمود مع acetonitrile 60% و 40% H2O قبل الاستخدام: 50 السير الذاتية قبل الاستخدام الأول أو 20 السير الذاتية إذا تم استخدام العمود من قبل.
      1. استخدام 50 m m فورمات الأمونيوم (AmF) (مصنوعة من المرحلة المتنقلة التركيز) و 100٪ LC-MS-الصف ACN للمراحل المتنقلة. وAmF حساسة للتغيرات في الحموضة ويمكن استخدامها لمدة 1 شهر بعد الخلط. تعيين معدل التدفق الأولي إلى 0.4 مل / دقيقة، مع تدرج LC توفير زيادة AmF خلال مرحلة الإلتصاق.
      2. تعيين كاشف FLR لقياس في EX 265/EM 425 نانومتر مع معدل أخذ العينات من 2 هرتز. استخدام اللوكين enkephalin (2 نانوغرام / ميكرولتر في 50٪ ACN / 0.1٪ FA) للمرجع الشامل الداخلي، في وضع "عدم تطبيق التصحيح".
        ملاحظة: سيتم تطبيق تصحيح المرجع الكتلي الداخلي لاحقاً أثناء معالجة البيانات.
      3. إعادة تعليق سلم dextran بالتتابع في 22.5 ميكرولتر من H2O، 25 ميكرولتر من DMF و 52.5 ميكرولتر من ACN. إعداد aliquots 10 درجة مئوية للتخزين في -80 درجة مئوية، كما سلم ليست مستقرة لأكثر من 24 ساعة في درجات حرارة أعلى (درجة حرارة الغرفة، 4 درجة مئوية). يتحلل سلم dextran بعد أكثر من دورة تجميد ذوبان.
      4. وضع العينات في العينات السيارات تعيين إلى 10 درجة مئوية. تحميل قارورة من سلم dextran جنبا إلى جنب مع العينات، كما سيتم استخدام المعلومات وقت الاحتفاظ من سلم للمهام في حين أن المعلومات الجماعية المستخدمة للتحقق من صحة الهوية. استخدام حقن 10 ميكرولتر للعينات وحقن 7.5 ميكرولتر للسلم. حقن العينات في ثلاثة أضعاف. تشغيل الأسلوب الذي تم تحميله.
  3. تعريف N-Glycan لبيانات LC-MS
    1. إجراء معالجة البيانات من خلال برنامج محسّن لبيانات قياس الطيف الكتلي للكروماتوغرافيا المائية (HILIC-FLR-MS).
    2. تطبيق تصحيحات المرجع الكتلي الداخلي داخل البرنامج. تعيين حقن سلم dextran بأنها "قياسي" في عينةالمعلومات. في طريقة التحليل، قم بتعيين أوقات الاحتفاظ بمركب الفصل لتلك المركبات سلم التي تم الكشف عنها أثناء التشغيل.
    3. للتأكد من أن المنطقة % سيتم إرجاعها للجليكوان اتّصل بها، قم بتعديل طريقة التحليل: ضمن علامة التبويب معالجة، انقر فوق إعدادات التكميم - معايرة وتعيين "نوع تناسب منحنى المعايرة" إلى "الاستجابة النسبية (%)".

4- تحليل تجميع الأجسام المضادة باستخدام SEC-MALS

  1. إعداد العينات
    1. نقل 3.5 ملغ / مل (الخطوة 2) البروتين المخفف إلى قارورة مع إدراج الزجاج 150 درجة مئوية. استخدام طرف تحميل هلام لpipet في الجرس السفلي من إدراج لتجنب إدخال فقاعات.
    2. قم بغطاء القارورة بغطاء الحاجز وحلل هاذا القارورة على الفور. يُحفظ عند درجة حرارة 4 درجات مئوية إذا تم تحليله لاحقًا.
  2. تكوين SEC-MALS وequilibration
    ملاحظة: تحليل التجميع على SEC-MALS تكوين مع اللونية السائلة فائقة الضغط العالي (UHPLC) مع كاشف MALS وكاشف مؤشر الانكسار التي تسيطر عليها برامج MALS.
    1. تكوين ملف طريقة في برنامج UHPLC للتحكم في نظام UHPLC، وتعيين معدل التدفق إلى 0.4 مل / دقيقة مع مرحلة متنقلة من 1X الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) (المخفف ة من 10X)، وحجم الحقن إلى 5 ميكرولتر، ودرجة حرارة العمود إلى 25 درجة مئوية ، وكاشف صفيف الصمام الثنائي (DAD) لمراقبة 280 نانومتر. تعيين وقت التشغيل إلى 20 دقيقة.
    2. الواجهة بين UHPLC ومتعددة الزاوية ضوء التشتت - كاشفات مؤشر الانكسار (MALS-RI) يتطلب استخدام الإخراج التناظرية على DAD. تعيين التوهين أبي إلى 1000 وحدة من الاتحاد الافريقي في ملف طريقة DAD وAU / الأشعة فوق البنفسجية الإعداد إلى 1 (الأشعة فوق البنفسجيةالصك> قنوات>قناة1).
    3. تشغيل مصباح داد 30 دقيقة قبل بدء التحليل وتعيين الطول الموجي إلى 280 نانومتر. في نفس الوقت، قم بإزالة الخلية المرجعية فهرس الانكسار (RI) لمدة 15 دقيقة أو حتى يكون الأساس مستقراً ثم قم بإغلاق الخلية المرجعية.
    4. تكوين تسلسل برامج SEC-MALS، وتحديد وقت التجميع إلى 12 دقيقة، وحجم الحقن إلى 5 ميكرولتر، وdn/dc إلى 0.185 مل/غرام، ومعامل الانقراض A280 إذا تم تحديده تجريبيًا سابقًا أو إلى 1.37 مل*(mg*cm)-1،وتركيز عينه. انقر فوق تشغيل وانتظر حتى يظهر مربع الحوار "انتظار الحقن" على الشاشة.
      ملاحظة: معامل الانقراض A280 هو محدد للبروتين من الفائدة وينبغي تحديدتجريبيا.
    5. تكوين قائمة نموذج في برنامج UHPLC بنفس الترتيب كما هو الحال في برنامج MALS-RI وإرسال.
      ملاحظة: من المهم تشغيل فحص ملاءمة النظام قبل وبعد تشغيل. عادة ما يستخدم ألبوم المصل البقري للتحقق من اتساع الذروة، وهي علامة على أن عمود SEC قد يحتاج إلى تنظيف أو استبدال. ويمكن استخدام نفس الحقن القياسية BSA لتحديد محاذاة الإشارة، وتوسيع الذروة، وتطبيع كاشف.
  3. التحليل الكلي مع برامج MALS
    1. انقر على علامة التبويب التي تم وضع علامة عليها الإجراءات. تحديد الحد الأدنى من مستوى الإنعحالة المطلوب؛ لا شيء عادة ما يكون كافيا.
    2. تحقق من أنه تم رسم خطوط الأساس بشكل صحيح وضبطها إذا لزم الأمر، لقنوات LS1 و LS2 و LS3 وRI والأشعة فوق البنفسجية. تعيين منطقة الذروة من الفائدة.
    3. مراجعة توزيع الكتلة الجزيئية للتأكد من أن القمم المسماة تحتوي على جزيئات ذات حجم مماثل.

5. تهمة تحليل البديل

  1. إعداد العينات ووضع العلامات
    1. تبدأ مع 80 درجة مئوية من محلول الأجسام المضادة 3.5 ملغ / مل. إزالة الملح العينة باستخدام عمود إزالة الأملاح 0.5 مل (7K MWCO). إعداد العمود عن طريق العض أولا قبالة سدادة أسفل، ثم تخفيف سدادة أعلى، ووضعها في أنبوب 1.7 مل الطرد المركزي الصغير. الطرد المركزي عمود إزالة الأملاح لمدة دقيقة واحدة في 1500 × ز.
      ملاحظة: وضع علامة على الجزء الخارجي من العمود بنقطة بحيث يمكن وضعه في الاتجاه الأصلي للخطوات التالية.
    2. نقل العمود إلى أنبوب جديد للطرد المركزي الصغير. إضافة 80 درجة مئوية من البروتين المخفف إلى الجزء العلوي من العمود. محاذاة العمود إلى الاتجاه الأصلي. الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 1500 × ز. إزالة العينة من الطرد المركزي، وتجاهل العمود إزالة الأملاح وخلط العينة جيدا.
      ملاحظة: لا يلزم إزالة الأملاح إلا إذا كانت مصفوفة العينة تحتوي على الأمينات الأولية، سواغ من شأنها أن تعكر صفو العينة الكهربائي، أو غيرها من المواد غير المتوافقة.
    3. تخفيف العينة إلى تركيز نهائي من 2 ملغ /مل في حجم 25 درجة مئوية وإضافة 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت لوضع العلامات (انظر جدول المواد: تهمة Variant الكاشفكيت) في لوحة 96 جيدا. إعداد الكاشف وضع العلامات عن طريق تخفيف الكمية اللازمة من الكاشف وضع العلامات (انظر جدول المواد: تهمة Variant الكاشفكيت) 1:30 في ثنائي ميثيل فورماميد. احتضان العينة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة بعيدا عن الضوء.
      ملاحظة: من المهم إذابة ثم استخدام هذا الكاشف على الفور واستخدامه في غضون 10 دقيقة من الخلط مع DMF.
    4. بعد الحضانة، إضافة 60 درجة مئوية من الماء الكاشف الصف ومزيج جيدا عن طريق الأنابيب. تغطية لوحة مع ختم لوحة والطرد المركزي لوحة في 1000 × ز لمدة 1 دقيقة.
  2. إعداد شريحة متغير الشحنة
    1. إعداد رقاقة البديل تهمة عن طريق إزالة حل التخزين وغسل الآبار 1، 3، 4، 7، 8، و 10 مع الماء. ثم استبدال المياه مع pH 7.2 المخزن المؤقت قيد التشغيل (انظر جدول المواد: تهمة Variant الكاشف كيت).
    2. إضافة 750 μL من الفاصل الهيدروجيني 7.2 تشغيل المخزن المؤقت إلى أنبوب المخزن المؤقت ووضع أنبوب المخزن المؤقت في البقعة المشار إليها في الزاوية العلوية اليسرى من علبة العينة. الآن إزالة ختم لوحة من لوحة 96 جيدا، اضغط على لوحة تفريغ على واجهة المستخدم الصك، وإدراج لوحة في علبة عينة GXII.
      ملاحظة: تم استخدام المخازن المؤقتة pH 7.2 لهذا التحليل. يمكن استخدام المخازن المؤقتة pH 5.6-7.2 استناداً إلى pI البروتين. عند استخدام المخازن المؤقتة للرقم الهيدروجيني السفلي، قد تكون هناك حاجة إلى أوقات تشغيل عينة أطول.
    3. اضغط على الزر إلغاء تحميل الشريحة على واجهة المستخدم. تأكد من أن الأقطاب الكهربائية خالية من أي جزيئات، وإذا لم يكن كذلك، نظيفة مع مسحة حرة الوبر. عند إدراج رقاقة تأكد من أن النافذة في وسط رقاقة خالية من الجسيمات أو اللطخات. إذا لزم الأمر، نظيفة مع قطعة قماش لينة خالية من الوبر.
      ملاحظة: عند العمل مع رقائق الكهربائي الشعرية، قم بإزالة العازلة عن طريق الطموح فراغ، تليها الإضافة الفورية للحل التالي لمنع الآبار من الجفاف. للحد من إدخال فقاعات، وممارسة تقنية الأنابيب العكسية. عند التعامل مع رقاقة، أن تضع في اعتبارها الشعرية الهشة تمتد من الجزء السفلي من رقاقة، والتأكد من أنها لا تجف ولا كسر من خلال التعامل الخام.
    4. أغلق الغطاء على غرفة الرقاقة وحدد تحليل HT Protein Charge Variant. انقر فوق الزر تشغيل. اتبع المطالبات لتحديد الآبار العينة، نوع اللوحة، وقت التبيّس (68 أو 90 أو 100 s) واسم الملف. انقر فوق ابدأ في نهاية المطالبات.
    5. تنظيف رقاقة يتطلب غسل كل بئر 2X مع الماء، تليها إضافة المخزن المؤقت (انظر جدول المواد: تهمة Variant الكاشفكيت). مرة واحدة في المخزن المؤقت للتخزين، استبدال رقاقة في الصك، وعند طلب، حدد HT بروتين تهمة التقوله. على الشاشة الرئيسية حدد غسل على واجهة المستخدم. بمجرد الانتهاء، قم بإزالة الرقاقة، وامسح الأقطاب الكهربائية بالماء ومسحة خالية من الوبر، ولتخزين الرقاقة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  3. تحليل متغير الشحن
    1. افتح برنامج تحليل الأداة. استيراد تشغيل عن طريق الانتقال إلى ملف>استيراد ملف البيانات... والنقر على الملف المطلوب *.gxd. سيتم ترحيل الاسم فقط إلى البرامج، لذلك إعادة تسمية الآبار مفيد (أدوات > محرر اسمالعينة ). حدد الملفات التي سيتم تصديرها عن طريق الضغط باستمرار على shift أثناء تحديد الملفات. انقر فوق ملف>تصدير... وحدد المربع البيانات الخام ثم مربع تنسيق AIA.
    2. افتح علامة التبويب استعراض المشاريع ضمن برنامج التحليل. انقر على قاعدة البيانات>استيراد البيانات... وحدد المصدرة *. CDF الملفات.
    3. بمجرد استيرادها، انتقل إلى علامة التبويب حقن، حدد الملفات المراد تحليلها، انقر بزر الماوس الأيمن وانتقل إلى عملية... في الإطار الذي يظهر، حدد خانة الاختيار المجاورة للعملية وحدد مربع الراديو "استخدام أسلوب المعالجة المحدد" وطريقة المعالجة المطلوبة من المربع المنسدل. في المربع المنسدل أدناه مباشرة المسمى "كيف:" حدد معايرة وQuantitate. بمجرد معالجتها، انتقل إلى علامة التبويب النتائج وتحقق من تكامل الألوان.
      ملاحظة: أسلوب المعالجة يحتاج إلى التحقق لكل أسلوب. كنقطة بداية، يتم تضمين المعلمات المستخدمة لأسلوب المعالجة الحالي في الملف التكميلي.
      ملاحظة: يمكن تصدير البيانات في شكل تقرير أو يمكن تصدير القياس الكمي الذروة فقط. ويمكن القيام بذلك في نفس الوقت أثناء المعالجة أو من إطار النتائج.

6. تحليل الأحماض الأمينية

  1. إعداد منحنى قياسي للكم المطلق الأحماض الأمينية من قبل LC-MS
    1. إعداد خليط الأحماض الأمينية الموسعة (EAA) عن طريق حل 59.45 ملغ من Asn، 59.00 ملغ من الهيب، 65.77 ملغ من Gln، و 91.95 ملغ من Trp في 25 مل من 0.1 N حمض الهيدروكلوريك. التركيز النهائي لكل حمض أميني في خليط EAA هو 18 نمول / ميكرولتر.
    2. إعداد معيار الداخلية (ISTD) حل الأسهم عن طريق حل 58.58 ملغ من Nva و 44.54 ملغ من سار في 50 مل من حمض الهيدروكلوريك.
    3. إعداد معايير الأحماض الأمينية الكاملة عن طريق الجمع بين محلول الأوراق المالية الأحماض الأمينية التي تحتوي على علة، Asp، Arg، Cys، Glu، Gly، له، إيل، ليو، ميت، في، برو، سير، ثر، Trp، Tyr، فال في 1 nmol / ميكرولتر كل مع خليط EAA لتركيزات الأحماض الأمينية النهائية من 900 ، 225، 90، 22.5، و 9 بمول/ميكرولتر.
    4. وضع تركيزات الأحماض الأمينية في قارورة عينة في autosampler من UPLC. توليد منحنى معايرة (9 إلى 900 بمول / ميكرولتر) في برنامج الصك على أساس تركيزات الأحماض الأمينية القياسية باستخدام التعليمات التالية.
    5. استخدم Q-ToF في وضع الحساسية الإيجابية للبخاخ الكهربائي (ESI) إلى جانب UPLC لتحليل الأحماض الأمينية السليمة. لفصل الكروماتوغرافية، استخدم عمود المرحلة العادية المصنوعة لفصل الأحماض الأمينية. إعداد المخازن المؤقتة التالية مع الكواشف الصف الطيفي الكتلة: A = acetonitrile + 0.1٪ حمض الفورميك و B = 100 mM فورمات الأمونيوم. تعيين معدل تدفق LC إلى 0.6 مل / دقيقة ودرجة حرارة العمود إلى 40 درجة مئوية.
    6. استخدم شروط التدرج التالية لمدة 15 دقيقة لفصل الأحماض الأمينية: 14% B (0-3 min)، 14-100% B (3-10 دقيقة)، 100% B (10-13 دقيقة)، 100-8% B (13-14 دقيقة)، 8% B (14-15 دقيقة).
    7. استخدم قوائم الأعمدة "نوع العينة" و"Conc A" في برنامج الحصول على MS لإنشاء منحنى معايرة للتحليل المستقبلي لوسائط المفاعل الحيوي الخام في برنامج التكميم. لجعل هذه الأعمدة تظهر في برنامج الاكتساب، استخدم الأمر تخصيص العرض...
    8. نوع العينة لمعايير الأحماض الأمينية سيكون "قياسي" في حين أن عينات وسائل الإعلام ستكون "Analyte". املأ عمود "Conc A" بالتركيزات العددية للمعايير في الوحدات المطلوبة (على مثل: pmol/μL).
    9. تشغيل تركيزات الأحماض الأمينية القياسية المعدة مرتين على الأقل. التحقق من أن أداة UPLC ومطياف الكتلة تعمل بشكل صحيح عن طريق التحقق من قمم ISTD.
    10. استخدم الخيار "تحرير أسلوب" في تطبيق التكميم لإنشاء أسلوب الكم (ملف *.mdb). تعريف جميع الأحماض الأمينية ذات الأهمية في تطبيق الكم، مثل اسم المركب، م / ز قيمة ووقت الاحتفاظ المتوقع. تغيير معلمات التكامل للأسلوب هنا.
    11. استخدم طريقة الأحماض الأمينية التي تم إنشاؤها على العينات القياسية لإنشاء منحنى المعايرة. يمكن تصدير هذا المنحنى إلى ملف *.cdb للاستخدام مع نماذج الوسائط باستخدام الأمر تصدير>معايرة...
    12. في تطبيق التكميم، احفظ التخطيط المطلوب إلى ملف *.qlt لتطبيقه على مجموعات البيانات المستقبلية باستخدام "حفظ التخطيط باسم...". الاسم (اسم الحقن) والمنطقة وConc هي أعمدة الإخراج الأكثر أهمية.
  2. تحليل الأحماض الأمينية من وسائل الإعلام مفاعل حيوي الخام من قبل LC-MS
    1. مركز معالجة مركزية للمفاعلات الحيوية الخام بـ 1,962 × ز لمدة 5 دقائق ويمر عبر فلتر 0.22 ميكرومتر.
    2. متابعة تنظيف حمض البيركلوريك لإزالة البروتين والجسيمات: خلط وسائل الإعلام مفاعل حيوي المصفاة مع 0.4 N HClO4 بنسبة 1:1 والطرد المركزي في 14700 × ز لمدة 5 دقائق في RT. جمع وسائل الإعلام أوضح في قارورة autosampler.
      ملاحظة: ضبط حجم الحقن حسب الحاجة لجعل تركيزات الأحماض الأمينية تقع ضمن نطاق المعايرة. اعتمادا على الصك، يمكن تعديل حجم الحقن بين 0.1 درجة مئوية و 10 درجة مئوية.
    3. تشغيل نماذج الوسائط في ثلاثة أضعاف بواسطة LC-MS. استخدام "نماذج العملية" ضمن برنامج الكم جنبا إلى جنب مع الأسلوب (*.mdb) وملف المعايرة (*.cdb). سيتم تطبيق الطريقة ومنحنى المعايرة تلقائيا على عينات وسائل الإعلام الخام عن طريق تطبيق الكم بمجرد الانتهاء من جميع الحقن.
    4. لتصدير البيانات للتحليل في برنامج آخر (مثل جدولبيانات)، استخدم الأمر "طباعة" وإنشاء ملف *.xps أو *.pdf.

النتائج

يتم تنقية السائل زراعة الخلايا التي تم حصادها من المفاعل الحيوي الآلي على نطاق صغير باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة سريعة البروتين (FPLC)، كما رأينا في الشكل 1 وسمات الجودة الحرجة للبروتينات النقية (CQAs) تتميز بمختلف الأساليب التحليلية المصب. وهذا فائدة رئيسية من نظام المفاعلات المجهرية الآلي؛ ويمكن تقييم الاختلافات في CQAs بسرعة عبر مجموعة واسعة من الظروف. وينبغي أن تظهر بيانات N-glycan من MAbs المنتجة من CHO التي تتم معالجتها عن طريق قياس الطيف الكتلي مثل مخططات الكروماتوغرام الموضحة في الشكل 2. يصور هذا الرقم مقارنة بين اثنين من الكروماتوغرام تبين أن ذروة mannose 5 (M5) من عينة واحدة أقل بكثير. إذا لوحظ خط أساس صاخبة فقط بدلاً من القمم، قد يعني هذا أن إعداد اللوني خاطئ أو أن الإجراء غير ناجح. باستخدام عناصر التحكم، يمكن تبسيط استكشاف الأخطاء وإصلاحها. أولا، تقييم قمم FLR من سلم dextran; تشير هذه القمم إلى أن النظام اللوني يعمل بشكل صحيح. بعد ذلك، قارن القمم التي تم الحصول عليها تجريبيًا مع تلك التي تم الحصول عليها من معيار mAb سليمة معالجة. إذا كانت القمم من المعيار مرئية، ولكن لم يتم التعرف على قمم عينة، ثم لم تتم معالجة عينات mAb بشكل صحيح. قد يكون هذا بسبب وجود SDS أو النوى في المخزن المؤقت تتداخل مع وضع العلامات N-غليكان وتنقية.

يمكن استخدام SEC-MALS لتقييم اثنين من CQAs أكثر: ملف التجميع والوزن الجزيئي للجسم المضاد. ويشبه الرسم البياني للكرومات والرسم البياني التمثيلي لـ SEC-MALS الرسم البياني الذي هو مبين في الشكل 3. تم تحديد توزيع الكتلة الجزيئية والوزن الجزيئي المطلق باستخدام البرنامج المطلوب مع معامل انقراض قدره 1.37 مل * (مغ * سم)-1 وdn/dc من 0.185 مل / غرام. كما يتم تنفيذ ذروة استدعاء وتعيين الأساس في البرنامج يدوياً، قد تختلف النتائج قليلاً من مستخدم إلى آخر. الوزن الجزيئي المطلق للIgG1 الأحادي من الشكل 3 هو 1.504 × 105 دا ± 0.38٪ (أزرق) ومجمع ترتيب أعلى هو 7.799 × 105 دا ± 3.0٪ (الأحمر). تعدد التشتت من المجاميع هو أكبر بكثير من ذلك من مونومر، كما هو مبينفي التوزيع الشامل الأضراس الحمراء من الذروة 1 (الشكل 3). والكمية الصغيرة من العينة وأهمية التجميع كـ CQA تجعل هذه التقنية أداة تحليلية تكميلية قيّمة للغاية لنظام المفاعلات المجهرية الآلي.

نتيجة mCZE هو الكهربائي، كما هو الحال في الشكل 4، والذي يظهر الملف الشخصي البديل تهمة لجسم مضاد أحادي النسيلة. الملف الشخصي هو توقيع فريد للبروتين يجري التحقيق وحساسة للغاية لدرجة الحموضة التشغيل. كما يظهر على الذروة الحرة صبغ إلى يسار الملف الشخصي البديل تهمة. عند إنشاء رقم الهيدروجيني التشغيل، هناك بعض السلطة التقديرية للمشغل لتحقيق التوازن بين القرار والإشارة؛ وبالإضافة إلى ذلك، يجب على المشغل ضمان فصل جيد من الذروة الحرة صبغ الذي يهاجر في ~ 30 s. ويمكن إزالة الملح من العينة بعد وضع العلامات لإزالة هذه الذروة، على الرغم من أن هذا يؤدي إلى خسارة كبيرة في الإشارة. بمجرد إنشاء رقم الهيدروجيني التشغيل، يمكن مقارنة ملفات تعريف العينة. في حين متسقة عموما، يمكن أن تؤدي التغييرات في كفاءة وضع العلامات أو الاختلافات في سواغ إلى اختلافات طفيفة في ترحيل عينة وملف تعريف متغير تهمة مما يجعل من الصعب مقارنة الترجيوم الكهربائي مباشرة. وبدلاً من ذلك، تستند طريقة المقارنة عادة ً إلى النسب المئوية للأنواع الأساسية والرئيسية والحمضية. في هذه الحالة، يمكن تحديد الاختلافات النسبية الصغيرة مثل 1-2٪ باستخدام mCZE.

يمكن رصد استهلاك الأحماض الأمينية لتحديد ما إذا كان الاستنفاد يسبب تغييرات في CQAs. يمكن استخدام قراءة اتّصال الكروماتوغرام من مطياف الكتلة لتقييم النجاح في إنشاء منحنى معايرة للكم المطلق للأحماض الأمينية في عينات الوسائط المفاعل الحيوي الخام. ويبين الشكل 5 رسمين بيانيين لونيين أيونيإجماليين (TIC) ومخطط كروماتوغرام أيوني استخراجي (XIC) كنتائج تمثيلية خلال هذه العملية. في الشكل 5A، يصور TIC المعروض إشارة الخلفية من النظام المؤقت حيث تم حقن فراغ الماء فقط. الشكل 5 B يصور TIC ممثل من معيار الأحماض الأمينية حيث، بالمقارنة مع المياه فارغة، يمكن ملاحظة قمم صغيرة تتوافق مع الأنواع الأحماض الأمينية الفردية (مثل يسين في 7.96 دقيقة). لدمج الذروة وتسهيل التحديد الكمي لمنطقة الذروة (وبالتالي التركيز)، يتم استخدام XIC حيث يتم عرض إشارة فقط من "نافذة كتلة كروماتوغرام" محددة. اعتمادا على حساسية الصك ونوعية الفصل اللوني، فإن نافذة الكتلة المثلى يجب أن يحددها المستخدم. في هذا المثال (الشكل 5C) ، وXIC من يسين (م / ض = 147.1144) مع نافذة كتلة من 10 جزء في المليون يظهر حيث يظهر يسين في معيار الأحماض الأمينية elutes قبالة العمود في 8.03 دقيقة.

figure-results-4725
الشكل 1 . الكروماتوغرام التمثيلي لمخطط التنقية باستخدام تقنية الكروماتوغرافيا السائلة للبروتين السريع (FPLC). يتم تسمية مراحل طريقة التنقية المقابلة لوحدة التخزين (مل) على طول المحور س. يتم رصد امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 280 نانومتر (mAU y-محور، خط صلب) طوال دورة تنقية. يتم إزاحة الشوائب غير ملزمة على وجه التحديد عن طريق زيادة الموصلية (mS /cm y-axis, dashed line) أثناء غسل الملح العالي. يظهر). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5458
الشكل 2 تم الحصول على مخطط كروماتوغرام الفلورة التمثيلي من الغليكانات ذات العلامات التي يتم التحقق منها على نطاق واسع. المحور س هو وقت الاحتفاظ (بالدقائق) بينما محور ص هو كثافة الإشارة. الذروة في 14.94 دقيقة يمثل مانوسي 5 (M5) غليكان، حيث يمكن ملاحظة فرق كبير بين قوة إشارة M5 بين العينات التي هي متراكبة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6095
الشكل 3 توزيع الوزن الجزيئي للجسم المضاد أحادي النسيلة IgG1. مخطط كروماتوغرام لجسم مضاد أحادي النسيلة IgG1 سليم يفصله الكروماتوغرافيا استبعاد الحجم في 1x PBS (pH7.4). ويتم رصد الامتصاص عند 280 نانومتر (أسود؛ المحور الأيسر) واستخدمت أجهزة الكشف عن مؤشرات التشتت والضوء لحساب الوزن الجزيئي المطلق لكل قمة (الأحمر والأزرق؛ المحور الأيمن). يشار إلى الأنواع عالية الوزن الجزيئي مع ذروة المسمى "HMW". الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6821
الشكل 4 . شحن الملف الشخصي البديل من الأجسام المضادة أحادية النسيلة IgG1. يتم إنشاء هذا الرسم الكهربائي على منصة mCZE. يهاجر قمة الصبغة الحرة في حوالي 30 ق ويتم فصلها بشكل جيد عن IgG1. وللتقدير الكمي، تم تقسيم القمم إلى أنواع أساسية ورئيسية وحمضية باستخدام برمجيات تحليل بيانات الأجهزة. يحدد الخط الأحمر مناطق الذروة المتكاملة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-7480
الشكل 5 النتائج التمثيلية للكروماتوغرامات الأيونية لتحليل الأحماض الأمينية المستندة إلى الطيف الكتلي لوسائل الإعلام المفاعل الحيوي الخام. المحور س هو الوقت (بالدقائق) في حين أنالمحور ص هو شدة الإشارة (A) الماء الفارغ بمثابة التحكم السلبي ويكشف عن إشارة الخلفية التي لوحظت على مدى التدرج اللوني السائل (B) والأحماض الأمينية 225 pmol /μL يستخدم المعيار هنا كتحكم إيجابي، كما تمثل القمم الفردية التي لوحظت في هذا الكروماطوغرام الأيونالكلي الأحماض الأمينية المختلفة للمزيج القياسي الذي يتم حله لونيا (C) ممثل مستخرج من الكروماتوغرام الأيون يستخرج لm /z 147.1144، وهو يسين. ال 7.96 دقيقة قمة في [ب] يماثل إلى ال 8.03 قمة في [ك] من يسين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

يحتوي الصندوق على حطام وجسيمات كبيرة يمكن أن تسد وتدمر الأجهزة المكلفة، وبالتالي هناك حاجة إلى توضيح الثقافة قبل مزيد من المعالجة النهائية. الطرد المركزي هو عموما النهج الأول لفصل الخلايا وغيرها من الجسيمات غير القابلة للذوبان من البروتينات تليها الترشيح. ثم يخضع هذا HCCF المصفاة للبروتين السريع اللوني السائل (FPLC) لتنقية. تنقية HCCF من المفاعلات المجهرية الآلية للحصول على المنتج هو خطوة هامة في معالجة المصب. هنا، يتم استخدام نظام FPLC على سطح المقعد مع بروتين عمود A للحصول على الأجسام المضادة أحادية النسيلة من HCCF. يمكن أن توفر تحليلات العمليات التمهيدية رؤية مفيدة لسلوك الخلايا وتوجه تصميم العمليات الحيوية، مما يساعد على الحصول على منتج جودة متسقة وموثوق بها. كما تسمح لنا Analytics بربط سمات الجودة الحرجة (CQAs) بالعمليات التمهيدية والنهائية. وترد هنا أربعة مقالات شائعة الاستخدام في توصيف الأجسام المضادة أحادية النسيلة. وهذه التقنيات قوية وموثوق بها وقابلة للنشر بسهولة لتحليل العمليات والمنتجات من مجموعة متنوعة من مصادر المنبع التي لا تُطهى إلا جزئياً وقد لا تزال تحتوي على مستويات متبقية من الحمض النووي وHCP.

عند تنظيف العينات للتحليلات، يجب تحقيق توازن مهم بين إنشاء عينة نظيفة بما فيه الكفاية للتحليل مع الحفاظ على التباين الموجود في المفاعل الحيوي. والملوثات الأكثر شيوعاً التي تؤثر على المنتج هي الحمض النووي وHCP، والتي يمكن فحصها بقياس نسبة الامتصاص عند 260/280 نانومتر ومن خلال SDS-PAGE أو μCE-SDS. الاختبارات المعروضة هنا ليست حساسة لمستويات منخفضة من محتوى الحمض النووي. نقاء المنتج هو > 95٪ نقية، كما يحددها μCE-SDS.

تحليل متغير تهمة مع نظام الكهربائي microcapillary يوفر طريقة عالية الإنتاجية لتحديد المتغيرات تهمة، مع رقائق والكواشف التي هي سهلة نسبيا لتنفيذ. طبيعة هذه التقنية وكيمياء الكاشف وضع العلامات على حد سواء حساسة للسواغ وغيرها من الأمينات الأولية، وبالتالي تتطلب خطوة إزالة الأملاح لمعظم مصفوفات العينة. من الخبرة، وانخفاض مستويات الحمض النووي المشترك في الهجرة مع الصبغة الحرة من رد فعل وضع العلامات ولا تؤثر على نوعية النتائج. في حين أن تقلب القياس الكمي الأساسي والرئيسي والحمضي هو عادة <1%، فإن المستويات الأعلى من الحمض النووي والملوثات الأخرى يمكن أن تزيد من تقلب الفحص. من المهم للغاية أن تكون متسقة مع وضع العلامات البروتين وضمان الاستخدام الفوري لDMF بعد إزالة من الزجاجة ويجري مختلطة مع الصبغة. ينصح ليسين و / أو معايير الهيستيدين كضوابط وضع العلامات. مع مرور الوقت، واعتمادا على نوعية العينة، رقائق يمكن أن كريهة أو تفقد الطلاء على قنوات microfluidics، مما يؤدي إلى مزيد من الضوضاء، ووجود قمم شبح، والمزيد من عينة إلى عينة الاختلاف. ولتحديد هذا الحدوث، تم تحليل الفراغات ومعيار ملاءمة النظام (أي NISTmAb) في نفس الوقت مع العينات على فترات منتظمة. عندما تنشأ مشاكل رقاقة، يمكن غسلها رقائق مع حل التخزين أو استبدالها.

الأساليب المستخدمة لتحليل الجليكان من البروتينات السكرية العلاجية تنطوي في المقام الأول على الكروماتوغرافيا السائلة (LC) و / أو قياس الطيف الكتلي (MS)، مع تحليل الكليكة الدقيقة تكتسب شعبية كخيار ثالث25. تستخدم الطريقة الموضحة في هذه الورقة كل من LC وMS، والتي لها فوائد وعيوب. الأساليب الطيفية الكتلية لها ميزة التحقق الشامل من الغليكانات التي تم تحليلها، وهو أمر غير ممكن باستخدام الأساليب المستندة إلى LC باستخدام إخراج الكشف الفلورسنت أو الكتين microarrays. يستخدم هذا الأسلوب LC والكشف عن الفلورة لتعيين هويات الغليكان باستخدام مقارنة وقت الاحتفاظ إلى معيار سلم dextran. ويتيح رصد الفلورة زيادة الحساسية والتحديد الكمي بسبب سهولة اكتشافه، حيث قد لا تتمكن التصلب المتعدد وحدها من تحديد كمية الأنواع ذات الوفرة المنخفضة بسبب ضعف كفاءة التأين في القلة. يتم استخدام المعلومات الجماعية من MS لتأكيد هويات الغليكان، ولكن برنامج المعالجة لا يستخدم المعلومات الجماعية كمعايير التعيين الأساسية. وبالتالي، دون الكروماتوغرافيا القابلة للاستنساخ والقمم القابلة للحل بسهولة، يمكن أن تعاني هذه الطريقة فيما يتعلق بمهام الغليكان. لحسن الحظ، يمكن أن تساعد المعلومات الجماعية في تخصيصات الغليكان حتى في الحالات التي يكون فيها التصوير اللوني دون المستوى، مثل التحولات في وقت الاحتفاظ التي تعوق تعيينات الغليكان القابلة للاستنساخ. إذا تم استخدام هذه الطريقة دون مرض التصلب العصبي المتعدد، يجب أن يكون اللوني على أعلى مستوى حيث لا يمكن استخدام المعلومات الجماعية لتصحيح الانجراف وقت الإقامة.

طريقة تحليل الأحماض الأمينية الموصوفة هنا يستخدم LC-MS لكمية سريعة من الأحماض الأمينية المنكفية في وسائل الإعلام ثقافة الخلية الخام. تتطلب طرق تحليل الأحماض الأمينية البديلة عوامل اشتقاق الأحماض الأمينية لتمكين الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية26. طريقة LC-MS تقدم مزايا هامة على طريقة LC-UV: فهو يسمح لتحديد على أساس كل من وقت الاحتفاظ وكتلة أيون بدلا من طريقة LC-UV، والتي تقتصر على عدم وجود توصيف الكتلة. وعلاوة على ذلك، فإن طريقة LC-MS توفر مزايا الوقت والتكرار، لأن طريقة LC-UV تتطلب تفاعل اشتقاق يستغرق وقتا طويلا، مما قد يضفي على عينة من التغير27. ومع ذلك، فإن حقن وسائل الإعلام ثقافة الخلية الخام في طريقة LC-MS يمكن أن يسبب آثار ضارة على إشارة MS بسبب المقشدة أيون قاذورات. يتم حقن سلم المعايرة بشكل متكرر كفحص ملاءمة للنظام، ويتم عشوائية ترتيب العينة لمنع التحيز في البيانات.

وقد سبق وصف عملية زراعة الخلايا لإنتاج الأجسام المضادة باستخدام المفاعلات المجهرية9. في هذه الدراسة، يتم تعريف البروتوكولات التفصيلية لطرق توصيف الأجسام المضادة أحادية النسيلة التي تزيد من البيانات التي تم الحصول عليها من أحجام العينة المحدودة بشكل جيد. كميات محدودة من السائل زراعة الخلايا التي تم حصادها يمكن أن تقيد في بعض الأحيان معلومات المنتج المكتسبة واختيار الإجراءات التحليلية الصحيحة للحصول على بيانات جودة المنتج أمر ضروري. التحليلات مهمة لربط معلمات العملية التمهيدية مع التغيرات في جودة المنتج. هنا، يتم توفير مبدأ توجيهي للمستخدمين لتوصيف mAbs عند العمل مع المفاعلات الدقيقة.

Disclosures

ويعكس هذا المنشور آراء المؤلف ولا ينبغي تفسيره على أنه يمثل آراء أو سياسات هيئة التنمية الحرجية.

Acknowledgements

ويود المؤلفان أن يشكرا سكوت لوت على الدعم التحليلي الذي قدمه. ويقدم برنامج المسار الحرج CDER (CA #1-13) التمويل والدعم الداخليين الجزئيين لهذا العمل. ويدعم هذا المشروع جزئيا تعيين في برنامج المشاركة في التدريب الداخلي / البحوث في مكتب منتجات التكنولوجيا الحيوية، وإدارة الغذاء والدواء في الولايات المتحدة، التي يديرها معهد أوك ريدج للعلوم والتعليم من خلال اتفاق بين الوكالات بين وزارة الطاقة الأميركية وادارة الاغذية والعقاقير.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
CHO DG44 Cell LineInvitrogenA1100001
Akta Avant 25General Electric Life Sciences28930842
Pro Sep vA Ultra Chromatography ResinMillipore Sigma115115830Purification Stationary Phase
Omnifit 10cm ColumnDiba Fluid Intelligence006EZ-06-10-AAHousing for Stationary Phase
Tris BaseFisher ScientificBP154-1
Superloop 10 mLGE Healthcare18-1113-81
µDawn Multi Angle Light Scattering DetectorWyattWUDAWN-01
0.22 µm Millex GV Filter Unit PVDF MembraneMerck MilliporeSLGV033RB
10X Phosphate Buffered SalineCorning46-013-CM
12 mL SyringeCovidien8881512878
1290 Infinity Binary PumpAgilent TechnologiesG4220A
1290 Infinity DAD Agilent TechnologiesG4212A
1290 Infinity SamplerAgilent TechnologiesG4226A
1290 Infinity ThermostatAgilent TechnologiesG1330B
1290 Infinity Thermostatted Column CompartmentAgilent TechnologiesG1316C
15 mL Falcon tubeCorning Inc.352097
150 uL Glass Inserts with Polymer Feet Agilent Technologies5183-2088
50 mL Falcon tubeCorning Inc.352070
96-Well PlateBio-Rad127737
Acetic AcidSigma-Aldrich695072
AcetonitrileFisher ChemicalBPA996-4
ACQUITY I-Class UPLC BSMWaters Corporation18601504612
ACQUITY I-Class UPLC Sample ManagerWaters Corporation186015000
ACQUITY UPLC FLR DetectorWaters Corporation176015029
Amicon Ultra-4 100 kDa centrifugal filtersMerck MilliporeUFC810096
Amino Acid Standard, 1 nmol/µL Agilent Technologies5061-3330
Amino Acid SupplementAgilent Technologies5062-2478
Ammonium Formate Solution - Glycan AnalysisWaters Corporation186007081
Blue Screw Caps with SeptaAgilent Technologies5182-0717
CD OptiCHO AGT MediumThermo Fisher ScientificA1122205
Centrifuge TubesEppendorf22363352
Charge Variant ChipPerkin Elmer760435
Charge Variant Reagent KitPerkin ElmerCLS760670
Chromatography Water (MS Grade)Fisher ChemicalW6-4
DimethylformamideThermo Scientific20673
Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well PlatesWaters Corporation186001831
Formic AcidFisher ChemicalA117-50
GlycoWorks RapiFlour-MS N-Glycan Starter Kit - 24 SampleWaters Corporation176003712
GXII Buffer TubesE&K Scientific697075- NC
GXII Detection Window Cleaning ClothVWR21912-046
GXII HT TouchPerkin ElmerCLS138160
GXII Ladder TubesGenemateC-3258-1
GXII Lint-Free SwabITW TexwipeTX758B
Hydrochloric AcidFisher ScientificA144-500
Intact mAb Mass Check StandardWaters Corporation186006552
Intrada Amino Acid Column 150 x 2 mmImtaktWAA25
NanoDrop One Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermo Fisher Scientific840274100
Optilab UT-rEX Differential Refractive Index DetectorWyattWTREX-11
Perchloric acidAldrich Chemistry311421
Pipet Tips with Microcapillary for Loading GelsLabcon1034-960-008
Polypropylene 96-Well Microplate, F-bottom, Chimney-style, BlackGreiner Bio-One655209
RapiFlour-MS Dextran Calibration LadderWaters Corporation186007982
Screw Top Clear Vial 2mLAgilent Technologies5182-0715
Sodium ChlorideFisher ScientificS271-1
Sodium IodideSigma Aldrich383112
TSKgel UP-SW3000 4.6mm ID x 30 cm LTosoh Biosciences003449
UNIFI Scientific Information SystemWaters Corporation667005138
Vacuum Manifold ShimsWaters Corporation186007986
Vacuum PumpWaters Corporation725000604
Xevo G2 Q-ToFWaters Corporation186005597
Zeba Spin Desalting Column, 0.5 mLThermo Scientific89883

References

  1. . . Pharmaceutical cGMPs for the 21st Century: A Risk-Based Approach. , (2004).
  2. New Molecular Entity (NME) Drug and New Biologic Approvals. FDA Available from: https://www.dfa.gov/Drugs/DevelopmentApprovalProcess/HowDrugsareDevelopedandApproved/DrugandBiologicAprrovalReports/NDAandBLAApprovalReports/ucm373420.htm (2015)
  3. Foltz, I. N., Karow, M., Wasserman, S. M. Evolution and Emergence of Therapeutic Monoclonal Antibodies. Circulation. 127, 2222-2230 (2013).
  4. Kondragunta, B., Drew, J. L., Brorson, K. A., Moreira, A. R., Rao, G. Advances in clone selection using high-throughput bioreactors. Biotechnology Progress. 26 (4), 1095-1103 (2010).
  5. Hmiel, L., Brorson, K., Boyne, M. Post-translational structural modifications of immunoglobulin G and their effect on biological activity. Analytical & Bioanalytical Chemistry. 407 (1), 79-94 (2015).
  6. Rathore, A. S. Roadmap for implementation of quality by design (QbD) for biotechnology products. Trends in Biotechnology. 27 (9), 546-553 (2009).
  7. . International Council for Harminisation of Techinical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use. ICH. , (1999).
  8. Berkowitz, S. A., Engen, J. R., Mazzeo, J. R., Jones, G. B. Analytical tools for characterizing biopharmaceuticals and the implications for biosimilars. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (7), 527-540 (2012).
  9. Velugula-Yellela, S. R., et al. Use of high-throughput automated microbioreactor system for production of model IgG1 in CHO cells. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
  10. Largy, E., Cantais, F., Van Vyncht, G., Beck, A., Delobel, A. Orthogonal liquid chromatography-mass spectrometry methods for the comprehensive characterization of therapeutic glycoproteins, from released glycans to intact protein level. Journal of Chromatography A. 1498, 128-146 (2017).
  11. Yang, J. -. M., et al. Investigation of the correlation between charge and glycosylation of IgG1 variants by liquid chromatography-mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 448, 82-91 (2014).
  12. Agarabi, C. D., et al. Bioreactor Process Parameter Screening Utilizing a Plackett-Burman Design for a Model Monoclonal Antibody. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (6), 1919-1928 (2015).
  13. Wen, J., Arakawa, T., Philo, J. S. Size-Exclusion Chromatography with On-Line Light-Scattering, Absorbance, and Refractive Index Detectors for Studying Proteins and Their Interactions. Analytical Biochemistry. 240 (2), 155-166 (1996).
  14. Veurink, M., Stella, C., Tabatabay, C., Pournaras, C. J., Gurny, R. Association of ranibizumab (Lucentis) or bevacizumab (Avastin) with dexamethasone and triamcinolone acetonide: An in vitro stability assessment. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 78 (2), 271-277 (2011).
  15. Li, Y., Weiss, W. F., Roberts, C. J. Characterization of high-molecular-weight nonnative aggregates and aggregation kinetics by size exclusion chromatography with inline multi-angle laser light scattering. Journal of Pharmaceutical Sciences. 98 (11), 3997-4016 (2009).
  16. Espinosa-de la Garza, C. E., et al. Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis. Electrophoresis. 34 (8), 1133-1140 (2013).
  17. Han, H., Livingston, E., Chen, X. High throughput profiling of charge heterogeneity in antibodies by microchip electrophoresis. Analytical Chemistry. 83 (21), 8184-8191 (2011).
  18. Wheeler, T. D., et al. Microchip zone electrophoresis for high-throughput analysis of monoclonal antibody charge variants. Analytical Chemistry. 86 (11), 5416-5424 (2014).
  19. Carrillo-Cocom, L., et al. Amino acid consumption in naive and recombinant CHO cell cultures: producers of a monoclonal antibody. Cytotechnology. 67 (5), 809-820 (2015).
  20. Chen, P., Harcum, S. W. Effects of amino acid additions on ammonium stressed CHO cells. Journal of Biotechnology. 117 (3), 277-286 (2005).
  21. Xing, Z., et al. Optimizing amino acid composition of CHO cell culture media for a fusion protein production. Process Biochemistry. 46 (7), 1423-1429 (2011).
  22. Fan, Y., et al. Amino acid and glucose metabolism in fed-batch CHO cell culture affects antibody production and glycosylation. Biotechnology and Bioengineering. 112 (3), 521-535 (2015).
  23. Read, E. K., et al. Fermentanomics informed amino acid supplementation of an antibody producing mammalian cell culture. Biotechnology Progress. 29 (3), 745-753 (2013).
  24. Mazzer, A. R., Perraud, X., Halley, J., O'Hara, J., Bracewell, D. G. Protein A chromatography increases monoclonal antibody aggregation rate during subsequent low pH virus inactivation hold. Journal of Chromatography. A. 1415, 83-90 (2015).
  25. Zhang, L., Luo, S., Zhang, B. Glycan analysis of therapeutic glycoproteins. MAbs. 8 (2), 205-215 (2016).
  26. Wahl, O., Holzgrabe, U. Amino acid analysis for pharmacopoeial purposes. Talanta. 154, 150-163 (2016).
  27. Le, A., Ng, A., Kwan, T., Cusmano-Ozog, K., Cowan, T. M. A rapid, sensitive method for quantitative analysis of underivatized amino acids by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Journal of Chromatography B. 944, 166-174 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

147

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved