Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

عرضت هنا أربعة بروتوكولات لبناء واستغلال الخميرة Saccharomyces cerevisiae سلالات مراسل لدراسة الإنسان P53 إمكانية التنشيط، والآثار من الطفرات المرتبطة بالسرطان المختلفة، والبروتينات المتفاعلة التي أعرب عنها، و آثار جزيئات صغيرة محددة.

Abstract

وقد سمح الاستنتاج بأن بروتين P53 الثدييات المعروفة بمثابة عامل النسخ (TF) في الخميرة S. سيريفيسياي لتطوير تجارب وظيفية مختلفة لدراسة آثار 1) موقع ملزم [أي عنصر الاستجابة (RE)] المتغيرات تسلسل على P53 خصوصية التنشيط أو 2) الطفرات TP53، العوامل المساعدة التي أعرب عنها، أو جزيئات صغيرة على نشاط التعطيل P53. وقد تم تطوير مختلف التطبيقات البحثية الأساسية والترجمة. تجريبيا، هذه النهج استغلال اثنين من المزايا الرئيسية لنموذج الخميرة. فمن ناحية، تتيح سهولة تحرير الجينوم البناء السريع لأنظمة المراسلين النوعية أو الكمية من خلال استغلال السلالات المسببة للسرطان التي لا تختلف إلا على مستوى P53-RE محدد للتحقيق في خصوصية التسلسل للاعتماد على P53 التفعيل. من ناحية أخرى، فإن توافر أنظمة منظمة للتعبير خارج الرحم P53 يسمح بتقييم التنشيط في مجموعة واسعة من التعبير البروتين. يتم مراجعة هذا التقرير على نطاق واسع النظم التي تستند إلى الجينات مراسل اللون، لوسيفيراز، ونمو الخميرة لتوضيح خطواتها المنهجية الرئيسية وتقييم قوة التنبؤ ية. وعلاوة على ذلك، يمكن استغلال التنوع الشديد لهذه النهج بسهولة لدراسة مختلف TFs بما في ذلك P63 و P73، وهما عضوان آخران في عائلة الجينات TP53.

Introduction

النسخ هو عملية معقدة للغاية تنطوي على تنظيم ديناميكي ومكاني وزمني لعوامل النسخ (TFs) والعوامل المساعدة لتوظيف وتعديل بوليميراز الحمض النووي الريبي في مناطق الكروماتين استجابة لمحفزات محددة1 . معظم TFs، بما في ذلك الإنسان P53 قمع الورم، تعترف عناصر محددة cis-acting في شكل تسلسل الحمض النووي تسمى عناصر الاستجابة (REs)، والتي تتكون من زخارف فريدة من نوعها واحدة (أو متعددة) ~ 6-10 النيوكليوتيدات طويلة. ضمن هذه الزخارف، قد تظهر المواقفالفردية درجات مختلفة من التباين 2، وعادة ما تلخصها مصفوفات وزن الموقف (PWM) أو الشعارات3،4.

الخميرة S. cerevisiae هو نظام نموذج مناسب لدراسة جوانب مختلفة من البروتينات البشرية من خلال الاختبارات المكملة، والتعبير خارج الرحم، والاختبارات الوظيفية، حتى عندما يكون جين الخميرة التقويمية غير موجود5، 6 , 7.نظرا للحفظ التطوري للمكونات القاعدية من نظام النسخ8، يمكن للعديد من TFs البشرية (عندما أعرب عن هافيموضعي في خلايا الخميرة) تعديل التعبير عن جين مراسل من خلال العمل من خلال المروجين هندسيا ل تحتوي على REs المناسبة. يتميز نظام نموذج النسخ المعروض هنا لP53 الإنسان بثلاثة متغيرات رئيسية يمكن تعديل آثارها: 1) طريقة التعبير ونوع P53، 2) تسلسل RE السيطرة على النسخ P53 تعتمد، و 3) نوع من [برسّري] مورثة (شكل[1ا]).

وفيما يتعلق بطريقة التعبير P53، يسمح S. cerevisiae باختيار المروجين اللاإمتزاقين أو الكبتأو التأسيسية9و10و11. على وجه الخصوص، المروج GAL1 inducible يسمح القاعدية (باستخدام raffinose كمصدر للكربون) أو متغير (عن طريق تغيير كمية الجالاكتوز في وسائل الإعلام) التعبير عن TF في الخميرة. في الواقع، يمثل التعبير القابل للضبط بدقة تطورا حاسما لدراسة ليس فقط P53 نفسها ولكن أيضا غيرها من البروتينات الأسرة P5312،13.

وفيما يتعلق بنوع REs التي تسيطر على التعبير المعتمد على P53، يسمح S. cerevisiae ببناء سلالات مراسل مختلفة تمتلك اختلافات فريدة في RE من الاهتمام في خلفية غير ذلك من السلالات المسببة للسرطان. يتم التوصل إلى هذا الهدف باستخدام التكيف مع نهج تحرير الجينوم تنوعا بشكل خاص وضعت في S. سيريفيسياي, ودعا ديليتو بيرفيتو12,14,15,16.

وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام جينات مراسل مختلفة (أي URA3، HIS3، وADE2) لتقييم نوعي او كمي للأنشطة النسخية للTFs البشرية في S. cerevisiae، ولكل منها ميزات محددة يمكن أن أن تكون مصممة لتلبية الاحتياجات التجريبية17،18،19،20،21. التعبير عن هذه الجينات مراسل يمنح uracil, الهستيدين, وprototrophy الادينين, على التوالي. مراسل URA3 لا يسمح بنمو الخلايا في وجود 5-FOA كذلك، وبالتالي يمكن أن يكون اختيار مضاد. نظام مراسل ADE2 لديه ميزة أنه، إلى جانب اختيار التغذية، فإنه يسمح بتحديد خلايا الخميرة التي تعبر عن نوع البرية (أي، وظيفية على التعبير ADE2) أو متحولة (أي، غير وظيفيةعلى ADE2 ) P53 من لون المستعمرة.

على سبيل المثال، خلايا الخميرة التي تعبر عن الجين ADE2 تولد مستعمرات بيضاء الحجم عادة على لوحات تحتوي على كميات محدودة من الأينيبين (2.5-5.0 ملغ / لتر)، في حين أن تلك التي سيئة أو لا تنسخ تظهر على نفس لوحة الأحمر الأصغر (أو الوردي) المستعمرات. ويرجع ذلك إلى تراكم وسيط ة في مسار الأدينين التركيبي الحيوي (أي P-ribosylamino-imidazole، الذي كان يسمى سابقا أمينو-إيميدازول ريبوتيد أو AIR)، والتي يتم تحويلها لتشكيل صبغة حمراء. وقد تم استبدال الجينات مراسل ADE2 على أساس اللون النوعي مع الكمية اليراعة Photinus pyralis (LUC1)12،22. في الآونة الأخيرة، تم الجمع بين مراسل ADE2 مع مراسل lacZ في سهلة لتسجيل، شبه كمية، واختراق مزدوج ة يمكن استغلالها لتصنيف المسوخ P53 وفقا لمستواهم المتبقي من الوظائف 23.

كما تم استخدام مراسلي الفلورسنت مثل EGFP (البروتين الفلورسنت الأخضر المعزز) أو DsRed (ديسكوسوما sp. بروتين الفلورسنت الأحمر) للتقييم الكمي لنشاط التنشيط المرتبط بجميع الطفرات الخاطئة المحتملة في TP53 تسلسل الترميز24. وأخيراً، أدت فرصة الجمع بين المروجين القابلة للضبط للتعبير الأليل P53 مع سلالات الخميرة المسببة للسرطان المختلفة لجين RE و/أو المراسل إلى تطوير مصفوفة بيانات تولد تصنيفاً منقحاً للربط بالسرطان وللجرثومة [ترجم جب53 قدم/الولايات-المتحدة2-و/ الولايات-المتحدة]

وتستخدم النهج المذكورة أعلاه لقياس النشاط النسخي للبروتين P53. ومع ذلك، فإن التعبير عن البرية من نوع P53 في الخميرة S. سيريفيسياي28 وSchizosaccharomyces pombe29 يمكن أن يسبب تأخر النمو، والتي ارتبطت مع خلية دورة اعتقال28،30 أو خلية الموت31. في كلتا الحالتين، يتم تشغيل تثبيط نمو الخميرة عن طريق التعبير P53 عالية، وقد تم ربط هادىر مع التشكيل النسخي المحتمل لجينات الخميرة الذاتية المشاركة في نمو الخلايا. دعم هذه الفرضية، وفقدان وظيفة متحولة P53 R273H لم تتداخل مع نمو خلية الخميرة عندما أعرب عنها في مستويات مماثلة كما البرية من نوع P5332. وعلى العكس من ذلك، تسبب التعبير في الخميرة من متحولة سامة P53 V122A (المعروف عن ارتفاع النشاط النسخي مقارنة مع البرية من نوع P53) تأثير مثبط النمو أقوى من البرية من نوع P5332.

بالإضافة إلى ذلك، ثبت أن MDM2 البشرية كانت قادرة على تثبيط النشاط النسخي P53 الإنسان في الخميرة، وتعزيز في كل مكان والتدهور اللاحق33. وبناء على ذلك، أظهرت قدرة الإنسان MDM2 وMDMX لمنع تثبيط نمو الخميرة الناجمة عن P5332،34. في دراسة إضافية، تم تحديد ارتباط بين النشاط النسخي P53 ومستويات التعبير الأكتين، مع تحديد P53 RE المفترضة في المنبع على جين ACT1 في الخميرة32. باستمرار، تم تعزيز التعبير الأكتين من قبل البرية من نوع P53 وحتى أكثر من ذلك من قبل P53 V122A، ولكن ليس من قبل متحولة P53 R273H. وعلى العكس من ذلك، انخفض تعبير الأكتين بواسطة P53 في الوجود المشترك لمثبطات P53 MDM2، MDMX، أو pifithrin-α (مثبط جزيء صغير من النشاط النسخي P53)، بما يتفق مع النتائج على أساس حقن الخميرة النمو. الأهم من ذلك، أنشأت هذه النتائج علاقة بين تثبيط النمو الناجم عن P53 ودرجة نشاطها في الخميرة، والتي تم استغلالها أيضا لتحديد ودراسة الجزيئات الصغيرة تحوير وظائف P5328،34 , 35.

Protocol

1. بناء سلالات الخميرة مراسل ADE2 أو LUC1 التي تحتوي على RE محددة (yAFM-RE أو yLFM-RE)

  1. خط yAFM-ICORE أو yLFM-ICORE سلالة12،14 (ICORE = I ، ISce-I endonuclease تحت GAL1 المروج؛ CO = العداد اختيار URA3؛ RE = مراسل KanMX4 منح مقاومة كانامايسين; الجدول1) من مخزون الجلسرين بنسبة 15٪ المخزنة في -80 درجةمئوية على لوحة أجار YPDA (الجدول 2). دعه ينمو لمدة 2-3 أيام عند 30 درجة مئوية.
  2. تأخذ مستعمرة الخميرة واحدة من لوحة جديدة (لا يزيد عمرها عن 3 أسابيع) ووضعها في قارورة صغيرة تحتوي على 5 مل من YPDA (الجدول2). حضانة في 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها، ويهز في 150-200 دورة في الدقيقة.
  3. في اليوم التالي، لإزالة جميع آثار سكر العنب، بيليه الخلايا لمدة 2 دقيقة في 3000 × ز وتجاهل supernatant عن طريق عكس الأنبوب.
    ملاحظة: تنفيذ كافة الطرد المركزي في هذا البروتوكول في درجة حرارة الغرفة (RT).
  4. إعادة تعليق بيليه الخلية في 30-50 مل من قبل الاحماءسم (وسائل الإعلام الكاملة) التي تحتوي على الجالاكتوز (الجدول 2) وحضانة لمدة 4 ح في 30 درجة مئوية، ويهز في 150-200 دورة في الدقيقة (اللازمة للحث من I-SceI).
  5. طرد مركزي الخلايا لمدة 2 دقيقة في 3000 × ز وتجاهل supernatant عن طريق عكس الأنبوب.
  6. إعادة تعليق بيليه الخلية في 30-50 مل من الماء المعقم. كرر الخطوة 1.5.
  7. إعادة تعليق بيليه الخلية في 10 مل من الماء المعقم. كرر الخطوة 1.5.
  8. إعادة تعليق بيليه الخلية في 5 ملمن LiAcTE معقمة (الجدول 3)، وهو حل الأيونية التي تفضل تناول الحمض النووي. كرر الخطوة 1.5.
  9. إعادة تعليق بيليه الخلية في 250 درجة مئوية من LiAcTE المعقمة ونقل الخلايا إلى أنبوب 1.5 مل. كرر الخطوة 1.5 وتعليق بيليه الخلية في 300-500 درجة مئوية من LiAcTE المعقمة.
  10. خلال الغسل، تشويه حل 10 ملغ / مل من سمك السلمون الحيوانات المنوية الحمض النووي الناقل لمدة 10 دقيقة في 100 درجة مئوية والبرد على الفور على الجليد للحفاظ عليه كالحمض النووي واحد الذين تقطعت بهم السبل.
  11. في أنبوب منفصل 1.5 مل، إضافة 500 بيكومولمن oligonucleotide المطلوب (الجدول3)،5 ميكرولتر من الحمض النووي الناقل الحيوانات المنوية السلمون المسلوق، 300 ميكرولتر من PEG LiAcTE معقمة (الجدول3)،و 50 ميكرولتر من تعليق خلية الخميرة (من الخطوة 1.9).
  12. دوامة أنابيب لمدة 10 ق لخلط وحضانة لمدة 30 دقيقة في 30 درجة مئوية، ويهز في 150-200 دورة في الدقيقة. وضع أنابيب 1.5 مل على الجانب لصالح الهز.
  13. صدمة الحرارة خلايا الخميرة لمدة 15 دقيقة في 42 درجة مئوية في كتلة التدفئة، ثم الطرد المركزي الخلايا لمدة 20 s في 10،000 ×ز. إزالة supernatant وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من الماء المعقم.
  14. نشر 100 درجة مئوية من تعليق الخلية على لوحة أجار YPDA وحضانة (رأسا على عقب) لمدة يوم واحد عند 30 درجة مئوية. لضمان الحصول على مستعمرات منفصلة جيدا، وتنتشر أيضا 100 درجة مئوية من تخفيف 1:10.
  15. في اليوم التالي، لوحة النسخة المتماثلة باستخدام المخمل المعقمة على لوحةأجار CM التي تحتوي على سكر العنب و 5-FOA (الجدول 2). النظر في لوحة النسخة المتماثلة الثانية على لوحة جديدة إذا تم نقل العديد من الخلايا (أي بعض نمو خلايا URA3).
  16. بعد ثلاثة أيام، لوحة طبق الأصل على YPDA غير انتقائية وYPDA تحتوي على G418 (مضادحيوي أمينوغليكوزيمماثل مماثلة لكانامايسين) لوحات أجار (الجدول 2)، بمناسبة كل لوحة لتسهيل المقارنة اللاحقة. احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية.
  17. في اليوم التالي، حدد سلالات المراسل المرشح من المستعمرات التي هي حساسة G418 ولكن تنمو على لوحات YPDA (على سبيل المثال، yLFM- أو yAFM-RE المستعمرات). خط المستعمرات المحددة (3-6 مستعمرات) على لوحة YPDA جديدة للحصول على عزل مستعمرة واحدة والسماح لهم بالنمو لمدة 2 أيام في 30 درجة مئوية.
  18. تصحيح مستعمرات الخميرة واحدة على لوحة YPDA لعزل المستعمرات لمزيد من التحليلات. بعد 24 ساعة عند 30 درجة مئوية، قم باختبارها عنطريق الطلاء المقلد على لوحة أجار YPGA (الجدول 2) التي تمنع نمو المتحولين صغير (أي، المسوخ التي تعاني من نقص في الجهاز التنفسي). في نفس الوقت، لوحة النسخة المتماثلة على لوحة أجار YPDA جديدة.
  19. اختبار البقع الصحيحة (أي النمو على لوحات أجار YPDA وYPGA؛ 1-3 مستعمرات) من الخطوة 1.18 لوجود التكامل القلة الصحيح من قبل PCR مستعمرة. تجميع مزيج التفاعل عن طريق إضافة 5 ميكرولتر من 10X PCR العازلة (1.5 مل ملغ كل2)،2 ميكرولتر من 10 بيكومول / ميكرولتر التمهيديات (الجدول3)،4 ميكرولتر من 2.5 مليون dNTPs، 0.25 ميكرولتر من 5 U / ميكروL طاقة بولميراز، والماء إلى حجم نهائي من 50 ميكرولتر. مضاعفة مزيج رد الفعل لعدد من مستعمرات الخميرة التي تحتاج إلى فحص وaliquot 50 ميكرولتر في كل أنبوب PCR. باستخدام ماصة، إضافة كمية صغيرة جدا من خلايا الخميرة من لوحة أجار YPDA في مزيج واحد من رد فعل PCR.
  20. أداء رد فعل PCR مع البرنامج التالي: 94 درجة مئوية لمدة 8 دقائق تليها 35 دورات من denaturation لمدة 1 دقيقة في 94 درجة مئوية، التمهيديات الصلب لمدة 1 دقيقة في 55 درجة مئوية، وتمديد لمدة 2 دقيقة في 72 درجة مئوية.
  21. بعد الانتهاء من رد الفعل، تحميل aliquot من رد فعل PCR (حوالي عشر حجم) على هلام أغاروز للتحقق من الحجم الصحيح (~ 500 bp).
  22. تسلسل المنتج PCR بعد تنقية مع مجموعة تجارية لتأكيد تكامل تسلسل RE المطلوب باستخدام نفس التمهيديات من الخطوة 1.19.
  23. بعد التحقق من صحة التسلسل الصحيح، وجعل 15٪ الجلسرين الأسهم من yAFM-RE أو yLFM-RE ثقافة سلالة (في YPDA) وتخزينها في -80 درجة مئوية.

2. تقييم قدرة P53 تبديل البروتين باستخدام نوعية اللون القائم على تحليل الخميرة ADE2

  1. كرر الخطوتين 1.1 و1.2 باستخدام سلالةyAFM-RE (الجدول 1).
  2. في اليوم التالي، تمييع ثقافة الخلية (1:10) في 30-50 مل من YPDA الدافئة مسبقا والاستمرار في احتضان في 30 درجة مئوية عن طريق هز حتى OD600nm يصل 0.8-1.0 (~ 2 ح).
  3. كرر الخطوات 1.5 إلى 1.10.
  4. في أنبوب منفصل 1.5 مل، إضافة 300-500 نانوغرام من الخميرةP53 (أو السيطرة) ناقلات التعبير (الجدول 4)، 5 ميكرولتر من سلمون مسلوق الحيوانات المنوية الحمض النووي الناقل، 300 درجة مئوية من PEG LiAcTE معقمة، و 50 ميكرولتر من تعليق خلية الخميرة.
  5. كرر الخطوتين 1.12 و 1.13 ولكن إعادة تعليق بيليه الخلية في 300 درجة مئوية من الماء المعقمة.
  6. نشر 100 درجة مئوية من تعليق الخلية على انتقائية الاصطناعية (للتعبير P53 أو ناقلات التحكم) لوحاتتحتوي على سكر العنب كمصدر للكربون وكمية عالية من الأيدينين (الجدول 2)، ثم حضانة (رأسا على عقب) في 30 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام.
  7. سلسلة واحدة الخميرة تحويل المستعمرات (2-6 الشرائط لكل لوحة) على لوحة انتقائية جديدة والسماح لهم تنمو بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية.
  8. في اليوم التالي، باستخدام المخملية المعقمة طبق النسخة المتماثلة على لوحات انتقائية جديدة تسمح لتقييم النمط الظاهري اللون (أي، لوحات تحتوي على سكر العنب كمصدر للكربون ولكن الحد من كمية الأيسينين ؛ الجدول2). احتضان لوحات رأسا على عقب في 30 درجة مئوية لمدة 3 أيام. اختياريا، لتقييم حساسية درجة الحرارة من البروتين P53، وحضانة في ثلاث درجات حرارة مختلفة لمدة 3 أيام: 24 درجة مئوية، 30 درجة مئوية، و 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: نفس الخط يمكن أن تكون النسخة المتماثلة مطلي عدة مرات.
  9. لتقييم قدرة P53 على نقل البروتين، تحقق من النمط الظاهري القائم على اللون لمستعمرات الخميرة وقارن النمط الظاهري للبروتين P53 فيما يتعلق بالنمط الظاهري P53 والأنماط الظاهرية الفارغة للناقلات.

3. تقييم قدرة P53 على نقل البروتين باستخدام الإنارة الكمية القائمة على تحليل الخميرة LUC1

  1. تحويل خلايا الخميرة مع P53 (أوالتحكم) ناقلات التعبير (الجدول 4) باستخدام الطريقة المستندة إلى LiAc الموصوفة في البروتوكول 2. استخدام سلالة yLFM-RE (الجدول1).
  2. تصحيح تحويلات واحدة على لوحة انتقائية جديدة مع كمية عالية من الأيجنين التي تحتوي على الجلوكوز كمصدر للكربون والسماح لهم بالنمو في 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها. لكل نوع تحويل، قم بإجراء تصحيحات مختلفة 5-7.
  3. بعد النمو بين عشية وضحاها، وإعادة تعليق كمية صغيرة من خلايا الخميرة باستخدام مسواك معقمة أو تلميح ماصة من لوحة في المتوسطة الانتقائية الاصطناعية التي تحتوي على سكر العنب أو raffinose كمصدر للكربون (200 حجم نهائي ميكرولتر في لوحة شفافة 96 جيدا، مع جولة أو أسفل مسطحة). إذا كانت التجربة تتطلب تعبير P53 غير قابل للقهر، أضف جالاكتوز إلىالمتوسطة الرافينوس لتعديل مستوى الحث (الجدول 2).
    ملاحظة: يجب أن يكون تعليق الخلية هذهOD 600nm حوالي 0.4 وليس أعلى من 1.
  4. قياس امتصاص كل بئر في OD600nm بعد التعبير P53 inducible (4-8 ح في 30 درجة مئوية مع 150-200 دورة في الدقيقة يهز) باستخدام قارئ لوحة متعددة التسمية. تأكد من أن تعليق الخلايا متجانس عن طريق خلط كل بئر مع ماصة متعددة القنوات.
  5. نقل 10-20 درجة مئوية من تعليق الخلية من لوحة 96 جيدا شفافة في لوحة بيضاء 384 (أو 96) لوحة جيدة ومزيج مع حجم متساو (10-20 درجة مئوية) من العازلة lysis. حضانة لمدة 10-15 دقيقة في RT على شاكر (150-200 دورة في الدقيقة) لتحقيق نفاذية الخلية إلى الركيزة لوسيفيراز.
  6. إضافة 10-20 درجة مئوية من الركيزة لوسيفيراز اليراعة وقياس وحدات الضوء (LU) من قبل قارئ لوحة متعددة التسمية.
  7. لتحديد قدرة P53 تبديل البروتين، تطبيع LUs من كل بئر إلى OD600nm المقابلة (وحدة الضوء النسبي، RLU). حساب متوسط RLU والانحراف المعياري من 3-4 بقع من مستعمرات الخميرة التحويلية.
  8. قارن بيانات نقل البروتين P53 فيما يتعلق بالمتجه البري والفارغ من النوع P53، إما عن طريق طرح القيم التي تم الحصول عليها مع المتجه الفارغ أو بالقسمة على القيم التي تم الحصول عليها مع المتجه الفارغ (أي أضعاف الحوسبة من الحث).
    ملاحظة: يمكن أيضاتقييم نشاط التعطيل P53 باستخدام نفس الإعداد التجريبي في وجود البروتينات المتفاعلة P53 (أي MDM2 وMDMX) و / أو بما في ذلك العلاج من المخدرات.

4. تقييم تثبيط نمو البروتين P53 باستخدام تحليل الخميرة الفينوتيبيك

  1. تحويل خلايا الخميرة باستخدام متجهات التعبير P53/MDM2/MDMX (أو التحكم) (الجدول4)باستخدام الطريقة المستندة إلى LiAc الموضحة في القسم 2. استخدام سلالة CG379 (الجدول1)ونشر الخميرة التحويلية على لوحات انتقائية الحد الأدنى (الجدول2).
  2. تنمو الخلايا المحولة فيالحد الأدنى من المتوسطة الانتقائية (الجدول 2) إلى ما يقرب من 1 OD600nm.
  3. تمييع خلايا الخميرة إلى 0.05 OD600nm في وسيط الحث الانتقائي (الجدول2)،واختياريا، إضافة جزيء صغير مختار إلى التركيز المناسب (أو المذيبات فقط) لاختبار فعاليته في إعادة تنشيط متحولة P53 أو في تثبيط MDM2- /MDMX-P53 التفاعلات.
  4. حضانة الخلايا في 30 درجة مئوية تحت اهتزاز المداري المستمر (200 دورة في الدقيقة) لمدة 42 ساعة تقريبا (الوقت المطلوب من الخميرة التحكم السلبي للوصول إلى مرحلة منتصف السجل، حوالي 0.45 OD600nm).
  5. بقعة 100 ميكرولتر aliquots من الثقافات خليةالخميرة على لوحات انتقائية الحد الأدنى (الجدول 2).
  6. حضانة لمدة 2 أيام عند 30 درجة مئوية.
  7. قياس نمو الخميرة عن طريق عد عدد المستعمرات التي تم الحصول عليها في قطرات الثقافة 100 درجة مئوية (وحدة تشكيل مستعمرة، التهم CFU). على سبيل المثال، حساب تأثير إعادة تنشيط متحولة من المركبات النظر في نمو البرية من نوع P53 التعبير عن الخميرة كأقصى تأثير ممكن (تعيين إلى 100٪)، في حين أن نمو الخلايا التي تعبر عن متحولة P53 (ولكن تتعرض للسيطرة المذيبات) يمثل مستوى الصفر من إعادة التنشيط.

النتائج

تشييد فى الرّهة الثانية أو LUC1 مراسل سلالات الخميرة

وقد تم تكييفdelitto perfettoapproach12،14،15،16 لتمكين بناء سلالات ا...

Discussion

وقد أثبتت الاختبارات القائمة على الخميرة مفيدة للتحقيق في مختلف جوانب وظائف البروتين P53. وهذه الاختبارات حساسة بشكل خاص لتقييم إمكانية نقل P53 نحو المتغيرات من المواقع المستهدفة RE، بما في ذلك تقييم تعدد الأشكال الوظيفية. استخدام الصحفيين اللون، فضلا عن تصغير من اللوسيفيراز التصاق يؤدي إلى...

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نشكر الاتحاد الأوروبي (صندوق الاتحاد الأوروبي POCI/01/0145/FEDER/007728 من خلال Programa Operacional Factores de Competitividade - COMPETE) والصناديق الوطنية (FCT/MEC, Fundação para a Ciência e Tecnologia and Ministério da Edção e Ciência) under the اتفاقية الشراكة PT2020 UID/QUI/50006/2019 والمشاريع (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014 - POCI-01-0145-FEDER-016581. زمالات FCT: SFRH/BD/96189/2013 (S. Gomes). وقد تم دعم هذا العمل من قبل Compagnia S. Paolo, Turin, Italy (Project 2017.0526) ووزارة الصحة (المشروع 5x1000 و 2015 و 2016; البحث الحالي 2016). ونشكر بشدة الدكتورة تيريزا لوبيز - أرياس الجبل الأسود (جامعة ترينتو، مختبرات تدريس العلوم التجريبية) على مساعدتها في تسجيل الفيديو.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
L-Aspartic acidSIGMA11189
QIAquick PCR Purification KitQIAGEN28104
L-PhenylalanineSIGMA78019
PeptoneBD Bacto211677
Yeast ex+A2:C26tractBD Bacto212750
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium SulfateBDTM233520
Lithium Acetate DihydrateSIGMA517992
Bacteriological Agar Type ABiokar DiagnosticsA1010 HA
G418 disulfate saltSIGMAA1720
Ammonium SulfateSIGMAA2939
L-Arginine Monohydro-chlorideSIGMAA5131
Adenine Hemisulfate SaltSIGMAA9126
Passive Lysis Buffer 5xPROMEGAE1941
Bright-Glo Luciferase Assay System PROMEGAE2620
5-FOAZymo ResearchF9001
D-(+)-GalactoseSIGMAG0750
L-Glutamic acidSIGMAG1251
Dextrose SIGMAG7021
L-HistidineSIGMAH8125
L-IsoleucineSIGMAI2752
L-LysineSIGMAL1262
L-LeucineSIGMAL8000
L-MethionineSIGMAM2893
PEGSIGMAP3640
D-(+)-Raffinose PentahydrateSIGMAR0250
L-SerineSIGMAS4500
L-TryptophanSIGMAT0271
L-ThreonineSIGMAT8625
UracilSIGMAU0750
L-ValineSIGMAV0500

References

  1. Spitz, F., Furlong, E. E. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nature Reviews Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).
  2. Pan, Y., Tsai, C. J., Ma, B., Nussinov, R. Mechanisms of transcription factor selectivity. Trends in Genetics. 26 (2), 75-83 (2010).
  3. Das, M. K., Dai, H. K. A survey of DNA motif finding algorithms. BMC Bioinformatics. 8 Suppl 7, S21 (2007).
  4. Sebastian, A., Contreras-Moreira, B. The twilight zone of cis element alignments. Nucleic Acids Resesarch. 41 (3), 1438-1449 (2013).
  5. Iggo, R., et al. Validation of a yeast functional assay for p53 mutations using clonal sequencing. Journal of Pathology. 231 (4), 441-448 (2013).
  6. Kaeberlein, M., Burtner, C. R., Kennedy, B. K. Recent developments in yeast aging. PLoS Genetics. 3 (5), e84 (2007).
  7. Scharer, E., Iggo, R. Mammalian p53 can function as a transcription factor in yeast. Nucleic Acids Research. 20 (7), 1539-1545 (1992).
  8. Kennedy, B. K. Mammalian transcription factors in yeast: strangers in a familiar land. Nature Reviews Molecular Cellular Biology. 3 (1), 41-49 (2002).
  9. Belli, G., Gari, E., Piedrafita, L., Aldea, M., Herrero, E. An activator/repressor dual system allows tight tetracycline-regulated gene expression in budding yeast. Nucleic Acids Research. 26 (4), 942-947 (1998).
  10. Mumberg, D., Muller, R., Funk, M. Regulatable promoters of Saccharomyces cerevisiae: comparison of transcriptional activity and their use for heterologous expression. Nucleic Acids Research. 22 (25), 5767-5768 (1994).
  11. Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).
  12. Inga, A., Storici, F., Darden, T. A., Resnick, M. A. Differential transactivation by the p53 transcription factor is highly dependent on p53 level and promoter target sequence. Molelcular and Cellular Biology. 22 (24), 8612-8625 (2002).
  13. Resnick, M. A., Inga, A. Functional mutants of the sequence-specific transcription factor p53 and implications for master genes of diversity. Proceeding of the National Academy of Science USA. 100 (17), 9934-9939 (2003).
  14. Tomso, D. J., et al. Functionally distinct polymorphic sequences in the human genome that are targets for p53 transactivation. Proceeding of the National Academy of Science USA. 102 (18), 6431-6436 (2005).
  15. Storici, F., Lewis, L. K., Resnick, M. A. In vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides. Nature Biotechnology. 19 (8), 773-776 (2001).
  16. Storici, F., Resnick, M. A. The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast. Methods in Enzymology. 409, 329-345 (2006).
  17. Campomenosi, P., et al. p53 mutants can often transactivate promoters containing a p21 but not Bax or PIG3 responsive elements. Oncogene. 20 (27), 3573-3579 (2001).
  18. Flaman, J. M., et al. A simple p53 functional assay for screening cell lines, blood, and tumors. Proceedings of the National Academy of Science USA. 92 (9), 3963-3967 (1995).
  19. Kovvali, G. K., Mehta, B., Epstein, C. B., Lutzker, S. G. Identification of partial loss of function p53 gene mutations utilizing a yeast-based functional assay. Nucleic Acids Research. 29 (5), E28 (2001).
  20. Shimada, A., et al. The transcriptional activities of p53 and its homologue p51/p63: similarities and differences. Cancer Research. 59 (12), 2781-2786 (1999).
  21. Sunahara, M., et al. Mutational analysis of p51A/TAp63gamma, a p53 homolog, in non-small cell lung cancer and breast. Oncogene. 18 (25), 3761-3765 (1999).
  22. Andreotti, V., et al. p53 transactivation and the impact of mutations, cofactors and small molecules using a simplified yeast-based screening system. PLoS ONE. 6 (6), e20643 (2011).
  23. Hekmat-Scafe, D. S., et al. Using yeast to determine the functional consequences of mutations in the human p53 tumor suppressor gene: An introductory course-based undergraduate research experience in molecular and cell biology. Biochemistry Molecular Biology Educaction. 45 (2), 161-178 (2017).
  24. Kato, S., et al. Understanding the function-structure and function-mutation relationships of p53 tumor suppressor protein by high-resolution missense mutation analysis. Proceedings of the National Academy of Science USA. 100 (14), 8424-8429 (2003).
  25. Monti, P., et al. Transcriptional functionality of germ line p53 mutants influences cancer phenotype. Clinical Cancer Research. 13 (13), 3789-3795 (2007).
  26. Monti, P., et al. Dominant-negative features of mutant TP53 in germline carriers have limited impact on cancer outcomes. Molecular Cancer Research. 9 (3), 271-279 (2011).
  27. Leroy, B., et al. The TP53 website: an integrative resource centre for the TP53 mutation database and TP53 mutant analysis. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D962-D969 (2013).
  28. Nigro, J. M., Sikorski, R., Reed, S. I., Vogelstein, B. Human p53 and CDC2Hs genes combine to inhibit the proliferation of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 1357-1365 (1992).
  29. Bureik, M., Jungbluth, A., Drescher, R., Wagner, P. Human p53 restores DNA synthesis control in fission yeast. Biological Chemistry. 378 (11), 1361-1371 (1997).
  30. Leao, M., et al. Alpha-mangostin and gambogic acid as potential inhibitors of the p53-MDM2 interaction revealed by a yeast approach. Journal of Natural Products. 76 (4), 774-778 (2013).
  31. Hadj Amor, I. Y., et al. Human p53 induces cell death and downregulates thioredoxin expression in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Research. 8 (8), 1254-1262 (2008).
  32. Leao, M., et al. Novel simplified yeast-based assays of regulators of p53-MDMX interaction and p53 transcriptional activity. FEBS J. 280 (24), 6498-6507 (2013).
  33. Di Ventura, B., Funaya, C., Antony, C., Knop, M., Serrano, L. Reconstitution of Mdm2-dependent post-translational modifications of p53 in yeast. PLoS ONE. 3 (1), e1507 (2008).
  34. Leao, M., et al. Discovery of a new small-molecule inhibitor of p53-MDM2 interaction using a yeast-based approach. Biochemichal Pharmacology. 85 (9), 1234-1245 (2013).
  35. Billant, O., Blondel, M., Voisset, C. p53, p63 and p73 in the wonderland of S. cerevisiae. Oncotarget. 8 (34), 57855-57869 (2017).
  36. Cho, Y., Gorina, S., Jeffrey, P. D., Pavletich, N. P. Crystal structure of a p53 tumor suppressor-DNA complex: understanding tumorigenic mutations. Science. 265 (5170), 346-355 (1994).
  37. Muller, P. A., Vousden, K. H., Norman, J. C. p53 and its mutants in tumor cell migration and invasion. Journal of Cellular Biology. 192 (2), 209-218 (2011).
  38. Oren, M., Rotter, V. Mutant p53 gain-of-function in cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), a001107 (2010).
  39. Walerych, D., Napoli, M., Collavin, L., Del Sal, G. The rebel angel: mutant p53 as the driving oncogene in breast cancer. Carcinogenesis. 33 (11), 2007-2017 (2012).
  40. Ciribilli, Y., et al. The coordinated p53 and estrogen receptor cis-regulation at an FLT1 promoter SNP is specific to genotoxic stress and estrogenic compound. PLoS ONE. 5 (4), e10236 (2010).
  41. Menendez, D., Inga, A., Resnick, M. A. Potentiating the p53 network. Discovery Medicine. 10 (50), 94-100 (2010).
  42. Monti, P., et al. Characterization of the p53 mutants ability to inhibit p73 beta transactivation using a yeast-based functional assay. Oncogene. 22 (34), 5252-5260 (2003).
  43. Monti, P., et al. Tumour p53 mutations exhibit promoter selective dominance over wild-type p53. Oncogene. 21 (11), 1641-1648 (2002).
  44. Shiraishi, K., et al. Isolation of temperature-sensitive p53 mutations from a comprehensive missense mutation library. Journal of Biological Chemistry. 279 (1), 348-355 (2004).
  45. Soussi, T. TP53 mutations in human cancer: database reassessment and prospects for the next decade. Advances in Cancer Research. 110, 107-139 (2011).
  46. Malkin, D. Li-Fraumeni Syndrome. Genes and Cancer. 2, 474-484 (2001).
  47. el-Deiry, W. S., Kern, S. E., Pietenpol, J. A., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Definition of a consensus binding site for p53. Nature Genetics. 1 (1), 45-49 (1992).
  48. Menendez, D., Inga, A., Resnick, M. A. The expanding universe of p53 targets. Nature Reviews in Cancer. 9, 724-737 (2009).
  49. Ciribilli, Y., et al. Transactivation specificity is conserved among p53 family proteins and depends on a response element sequence code. Nucleic Acids Research. 41 (18), 8637-8653 (2013).
  50. Smeenk, L., et al. Characterization of genome-wide p53-binding sites upon stress response. Nucleic Acids Research. 36, 3639-3654 (2008).
  51. Vyas, P., et al. Diverse p53/DNA binding modes expand the repertoire of p53 response elements. Proceeding of the National Academy of Science USA. 114 (40), 10624-10629 (2017).
  52. Tebaldi, T., et al. Whole-genome cartography of p53 response elements ranked on transactivation potential. BMC Genomics. 16, 464 (2015).
  53. Wang, T., et al. Species-specific endogenous retroviruses shape the transcriptional network of the human tumor suppressor protein p53. Proceedings of the National Academy of Science USA. 104, 18613-18618 (2007).
  54. Bond, G. L., et al. A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans. Cell. 119 (5), 591-602 (2004).
  55. Zeron-Medina, J., et al. A polymorphic p53 response element in KIT ligand influences cancer risk and has undergone natural selection. Cell. 155 (2), 410-422 (2013).
  56. Lion, M., et al. Evolution of p53 transactivation specificity through the lens of a yeast-based functional assay. PLoS ONE. 10 (2), e0116177 (2015).
  57. Schumacher, B., et al. C. elegans ced-13 can promote apoptosis and is induced in response to DNA damage. Cell Death and Differentiation. 12 (2), 153-161 (2005).
  58. Jordan, J. J., et al. Low-level p53 expression changes transactivation rules and reveals superactivating sequences. Proceeding of the National Academy of Science USA. 109 (36), 14387-14392 (2012).
  59. Soares, J., et al. Oxazoloisoindolinones with in vitro antitumor activity selectively activate a p53-pathway through potential inhibition of the p53-MDM2 interaction. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 66, 138-147 (2015).
  60. Leao, M., et al. Enhanced cytotoxicity of prenylated chalcone against tumour cells via disruption of the p53-MDM2 interaction. Life Sciences. 142, 60-65 (2015).
  61. Soares, J., et al. A tryptophanol-derived oxazolopiperidone lactam is cytotoxic against tumors via inhibition of p53 interaction with murine double minute proteins. Pharmacol Research. 95-96, 42-52 (2015).
  62. Soares, J., et al. DIMP53-1: a novel small-molecule dual inhibitor of p53-MDM2/X interactions with multifunctional p53-dependent anticancer properties. Molecular Oncology. 11 (6), 612-627 (2017).
  63. Soares, J., et al. Reactivation of wild-type and mutant p53 by tryptophanolderived oxazoloisoindolinone SLMP53-1, a novel anticancer small-molecule. Oncotarget. 7 (4), 4326-4343 (2016).
  64. Sharma, V., Monti, P., Fronza, G., Inga, A. Human transcription factors in yeast: the fruitful examples of P53 and NF-small ka, CyrillicB. FEMS Yeast Research. 16 (7), (2016).
  65. Stepanov, A., Nitiss, K. C., Neale, G., Nitiss, J. L. Enhancing drug accumulation in Saccharomyces cerevisiae by repression of pleiotropic drug resistance genes with chimeric transcription repressors. Molecular Pharmacology. 74 (2), 423-431 (2008).
  66. Sharma, V., et al. Quantitative Analysis of NF-kappaB Transactivation Specificity Using a Yeast-Based Functional Assay. PLoS ONE. 10 (7), e0130170 (2015).
  67. Epinat, J. C., et al. Reconstitution of the NF-kappa B system in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 13 (7), 599-612 (1997).
  68. Inga, A., Reamon-Buettner, S. M., Borlak, J., Resnick, M. A. Functional dissection of sequence-specific NKX2-5 DNA binding domain mutations associated with human heart septation defects using a yeast-based system. Human Molecular Genetics. 14 (14), 1965-1975 (2005).
  69. Reamon-Buettner, S. M., Ciribilli, Y., Inga, A., Borlak, J. A loss-of-function mutation in the binding domain of HAND1 predicts hypoplasia of the human hearts. Human Molecular Genetics. 17 (10), 1397-1405 (2008).
  70. Balmelli-Gallacchi, P., et al. A yeast-based bioassay for the determination of functional and non-functional estrogen receptors. Nucleic Acids Research. 27 (8), 1875-1881 (1999).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

150P53

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved