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摘要

这里提出的四个协议,以构造和利用酵母糖糖酶报告菌株,以研究人类P53转活化潜力,其各种癌症相关突变的影响,共同表达的相互作用蛋白,和特定小分子的影响。

摘要

发现著名的哺乳动物P53蛋白可以作为酵母S.cerevisae的转录因子(TF),使得开发不同的功能测定来研究1结合位点的影响[即反应元素(RE)]。P53转活特异性或2)TP53突变、共表达辅助因子或P53转活活性小分子的序列变异。开发了不同的基础研究和翻译研究应用。在实验中,这些方法利用了酵母模型的两个主要优点。一方面,基因组编辑的简便性,通过利用仅在特定P53-RE水平上不同的同源菌株来调查P53依赖性的序列特异性,从而快速构建定性或定量报告系统转换。另一方面,对于异位P53表达的调节系统的可用性,可以评估各种蛋白质表达的转能。本报告综述了基于色重报告基因、荧光素酶和酵母生长的广泛使用的系统,以说明其主要方法步骤,并批判性地评估其预测能力。此外,这些方法的极端多功能性可以很容易地用于研究不同的TF,包括P63和P73,它们是TP53基因家族的其他成员。

引言

转录是一个极其复杂的过程,涉及对染色质区域RNA聚合量的招募和调制的转录因子(TF)和辅助因子的动态、空间和时间组织,以响应特定的刺激1.大多数TF,包括人类P53肿瘤抑制剂,以称为反应元素(REs)的DNA序列的形式识别特定的cis-行为元素,这些元素由单(或多种)独特的图案+6-10核苷酸长组成。在这些主题中,个别位置可能显示不同程度的变异性2,通常用位置权重矩阵 (PWM) 或徽标 3、4 汇总。

酵母S.cerevisiae是一个合适的模型系统,通过补充测定、异位表达和功能测定来研究人类蛋白质的不同方面,即使不存在正交酵母基因56,7.由于转录系统8的基础成分的进化保存,许多人类TF(当在酵母细胞中异位表达时)可以通过工程的启动子来调节报告基因的表达。包含适当的 R。此处为人类 P53 提供的转录模型系统具有三个主要变量的特征,其效果可以调制:1) P53 的表达方式和类型,2) RE 序列控制 P53 依赖转录,3) 类型记者基因 (图 1A).

关于P53表达的方式,S.cerevisae允许选择诱导的、可抑制的或构成的促进者9,10,11。特别是,诱导的GAL1启动子允许酵母中的TF的基底(使用拉菲诺作为碳源)或变量(通过改变介质中的乳糖量)表达TF。事实上,精细可调的表达代表了一个关键的发展,不仅P53本身,但也研究其他P53家族蛋白质12,13。

关于控制P53依赖性表达的RE类型,S.cerevisae允许构建不同的报告器菌株,这些菌株在其它异源背景中具有感兴趣的RE的独特差异。这一目标是通过适应一种特别通用的基因组编辑方法,在S.cerevisiae开发,称为delitto perfetto 12,14,15,16。

此外,不同的报告基因(即URA3、HIS3和ADE2)可用于定性和定量评估S.cerevisae中人类TF的转录活动,每个基因具有特定特征, 应以适应实验需要17,18,19,20,21。这些报告基因的表达分别赋予了尿原体、组氨酸和阿丁原体。URA3报告器不允许在存在5-FOA的情况下细胞生长,因此可以反选择。ADE2报告器系统的优点是,除了营养选择外,它还允许识别表达野生型(即ADE2表达功能)或突变体(即ADE2上不起作用)的酵母细胞) P53 来自殖民地颜色。

例如,表达ADE2基因的酵母细胞在含有限制定量的阿丁鱼(2.5-5.0mg/L)的板上产生正常大小的白色菌落,而那些质量差或没有转录的细胞则在同一块板上出现较小的红色(或粉红色)殖民地。这是由于在脱胶生物合成通路(即P-ribosylamino-imidazole,以前称为氨基-依米达索核糖酸或AIR)中积累的中间体,该中间体被转换成红色颜料。基于定性颜色的ADE2报告基因已被用定量的萤火虫Photinuspyralis(LUC1)12、22所取代。最近,ADE2记者与lacZ记者进行了一个易于评分、半定量、双报机分析的合并,可以根据P53突变体的残余功能水平对其进行子分类。23.

荧光报告机,如EGFP(增强的绿色荧光蛋白)或DsRed(迪斯科索玛sp.红色荧光蛋白)也被用于定量评估与所有可能的误感突变相关的变活活性。TP53编码序列24.最后,P53等位基因表达的可调启动子与RE和/或报告基因的异源酵母菌株相结合的机会,导致开发一个数据矩阵,生成癌症相关和生殖系的精细分类突变P53等位电25,26,27 。

上述方法用于测量P53蛋白的转录活性。然而,在酵母S.cerevisiae28和Schizosaccharis pombe29中野生型P53的表达可能导致生长迟缓,这与细胞周期阻滞28、30或细胞死亡31。在这两种情况下,酵母生长抑制由高P53表达触发,并与参与细胞生长的内源酵母基因的潜在转录调制相关。支持这一假设,功能丧失突变体P53 R273H在以与野生型P5332相似的水平表示时,不会干扰酵母细胞的生长。相反,在酵母中表达的有毒突变体P53 V122A(已知比野生型P53的转录活性更高)比野生型P533产生更强的生长抑制作用。

此外,证明人类MDM2能够抑制人类P53转录活性在酵母,促进其普及和随后的降解33。因此,人类MDM2和MDMX抑制P53诱导酵母生长抑制的能力被证明为32,34。在另外一项研究中,建立了P53转录活性与反应性表达水平之间的相关性,在酵母32中的ACT1基因上鉴定了假定的P53 RE上游。始终,行为蛋白表达由野生型P53增强,P53 V122A更增强,但突变P53 R273H更增强。相反,P53的活性素表达在P53抑制剂MDM2、MDMX或pifithrin-α(P53转录活性的小分子抑制剂)的共存在中减少,与基于酵母生长测定的结果一致。重要的是,这些结果建立了P53诱导的生长抑制与其在酵母中的活性程度之间的相关性,也用于识别和研究调节P53功能的小分子28,34,35.

研究方案

1. 构建含有特定RE(yAFM-RE或yLFM-RE)的ADE2或LUC1报告酵母菌株

  1. 在GAL1促进剂下,可分得 yAFM-ICORE 或 yLFM-ICORE 菌株 12、14(ICORE = I,ISce-I 内分糖;CO = 计数器可选URA3;RE = 记者KanMX4授予卡那霉素耐药性;表 1)从15%甘油储存在-80°C在YPDA琼脂板上(表2)。让它在30°C下生长2-3天。
  2. 从新鲜板(不超过3周)取一个酵母菌群,并将其放入含有5 mL YPDA的小瓶中(表2)。在 30°C 孵育过夜,在 150-200 rpm 下摇动。
  3. 第二天,为了去除所有脱胶的痕迹,在3,000 x g下粒细胞2分钟,并通过管的倒置丢弃上清液。
    注:在室温 (RT) 下执行此协议中的所有离心。
  4. 将细胞颗粒悬浮在含有角质酶的预加热CM(完整介质)的30-50 mL中,并在30°C下孵育4小时,在150-200rpm下摇动(对I-SceI的诱导是必要的)。
  5. 在 3,000 x g下将细胞离心 2 分钟,并通过管的反转丢弃上清液。
  6. 在30-50 mL的无菌水中重新悬浮细胞颗粒。重复步骤 1.5。
  7. 将细胞颗粒重新悬浮在10 mL的无菌水中。重复步骤 1.5。
  8. 将细胞颗粒重新悬浮在5 mL的无菌LiAcTE(表3),一种有利于脱氧核糖核酸的离子溶液。重复步骤 1.5。
  9. 在250μL无菌LiAcTE中重新悬浮细胞颗粒,并将细胞转移到1.5 mL管中。重复步骤1.5,在300-500μL无菌LiAcTE中重新悬浮细胞颗粒。
  10. 在哺乳期间,在100°C下变性鲑鱼精子DNA载体的10mg/mL溶液10分钟,并立即在冰上冷却,将其保持为单链DNA。
  11. 在单独的1.5 mL管中,加入所需的寡核苷酸(表3)、5 μL的煮鲑鱼精子载体DNA、300μL无菌LiAcTE PEG(表3)和酵母细胞悬浮液50μL(从步骤1.9开始)。
  12. 涡旋管10秒混合和孵育30分钟,在30°C,在150-200rpm下摇动。将 1.5 mL 管放在侧面,以有利于摇动。
  13. 热冲击酵母细胞在加热块42°C下15分钟,然后在10,000 x g下将细胞离心20秒。去除上清液,在1 mL无菌水中重新悬浮细胞。
  14. 在YPDA琼脂板上将细胞悬浮液100μL扩散,并在30°C下孵育(倒置)1天。为了确保获得分离良好的菌落,也传播100μL的1:10稀释。
  15. 第二天,复制板使用无菌天鹅绒到CM琼脂板含有德克斯罗斯和5-FOA(表2)。如果转移了许多细胞(即 URA3 细胞的某些生长),请考虑在新板上的第二个复制板。
  16. 三天后,复制板在非选择性YPDA和YPDA含有G418(一种类似于卡那霉素的氨基糖苷抗生素)琼脂板(表2),标记每个板,以方便其后续比较。在30°C下孵育板。
  17. 第二天,识别来自G418敏感但在YPDA板块(例如,yLFM-或yAFM-RE菌落)上生长的菌落的候选报告株。在新的YPDA板上对已识别的菌落(3-6个菌落)进行划线,以获得单菌落分离物,并在30°C下生长2天。
  18. 在YPDA板上修补单酵母菌落,分离菌落,以便进一步分析。在30°C下24小时后,通过在YPGA琼脂板上复制电镀(表2)进行测试,防止小突变体(即呼吸缺陷突变体)的生长。同时,复制板上新的YPDA琼脂板。
  19. 测试步骤1.18中的正确斑块(即YPDA和YPGA琼脂板上的生长;1-3个菌落),以检测菌落PCR是否存在正确的寡核苷酸整合。加入5 μL的10x PCR缓冲液(1.5 mM MgCl2),2 μL的10片皮莫洛/μL底漆(表3),4μL的2.5 mM dNTP,0.25 μL的5U/μL塔克聚合酶,水到50μL的最终体积。将需要筛选的酵母菌群的数量的反应混合物相乘,并将50μL等分成每个PCR管。使用移液器,从YPDA琼脂板中加入非常少量的酵母细胞到单个PCR反应混合物中。
  20. 使用以下程序执行 PCR 反应:94 °C 8 分钟,随后在 94°C 下进行 35 次变性 1 分钟,引水退火在 55°C 下退火 1 分钟,在 72°C 下延长 2 分钟。
  21. 反应完成后,在胶凝剂凝胶上加载PCR反应的等分(约体积的十分之一),以检查正确的尺寸(+500 bp)。
  22. 使用商业套件对纯化后的 PCR 产品进行序列化,以使用步骤 1.19 的相同引物确认所需 RE 序列的集成。
  23. 验证正确序列后,制作 15% 的甘油,储存 yAFM-RE 或 yLFM-RE 菌株培养(在 YPDA 中),并将其储存在 -80°C。

2. 使用基于定性的ADE2酵母测定评估P53蛋白转活能力

  1. 使用 yAFM-RE 应变(表 1) 重复步骤 1.1 和 1.2。
  2. 后天,在预加热YPDA的30-50 mL中稀释细胞培养(1:10),通过摇动继续在30°C下孵育,直到OD600nm达到0.8-1.0(±2小时)。
  3. 重复步骤 1.5-1.10。
  4. 在单独的1.5 mL管中,加入300-500纳克的酵母P53(或对照)表达载体(表4),5μL的煮鲑鱼精子DNA载体,300μL无菌LiAcTE PEG,和50μL的酵母细胞悬浮液。
  5. 重复步骤1.12和1.13,但将细胞颗粒重新悬浮在300μL无菌水中。
  6. 将细胞悬浮液的100μL扩散到含有德克斯罗作为碳源和高量阿地宁(表2)的合成选择性(P53表达或对照载体)板上,然后在30°C孵育(倒置)2-3天。
  7. 在新的选择性板上,在单酵母转化菌落(每板2-6条条纹)上,让它们在30°C下生长过夜。
  8. 第二天,使用无菌天鹅绒复制板到新的选择性板,允许评估颜色表型(即,含有德克斯罗斯的板作为碳源,但限制阿丁的量;表 2)。在30°C下倒置孵育板3天。可选,为了评估P53蛋白的温度敏感性,在三种不同的温度下孵育3天:24°C、30°C和37°C。
    注: 相同的条纹可以多次复制。
  9. 要评价P53蛋白的转化能力,请检查酵母菌落的基于颜色的表型,比较P53蛋白表型与P53野生型和空载体表型。

3. 使用基于定量发光的LUC1酵母测定评估P53蛋白转活能力

  1. 使用协议2中描述的基于LiAc的方法,使用P53(或对照)表达载体(表4)转换酵母细胞。使用 yLFM-RE 应变 (表 1.
  2. 在新的选择性板上修补单转化剂,以含有高含量的葡萄糖作为碳源,让它们在30°C生长过夜。对于每种转换类型,制作 5-7 个不同的修补程序。
  3. 在一夜的生长后,使用无菌牙签或移液器尖端从板中重新悬浮少量酵母细胞,其中含有德克斯罗斯或拉菲诺丝作为碳源(透明96孔板中的200μL最终体积,带圆形或平底)。如果实验需要诱导的P53表达,在拉菲诺西中加入加乳糖以调节感应水平(表2)。
    注:这些细胞悬浮液的OD600nm应为约0.4,且不得高于1。
  4. 使用多标签板读片器在可诱导的 P53 表达式(30°C 时 4-8 小时,150-200 rpm 晃动)后,在 OD600nm下测量每个孔的吸光度。通过将每个孔与多通道移液器混合,确保电池悬架均匀。
  5. 将10-20 μL的细胞悬浮液从透明96孔板转移到白色384(或96)孔板中,并与相同体积(10-20 μL)的液化缓冲液混合。在摇床(150-200 rpm)上在RT下孵育10-15分钟,实现细胞向荧光素酶基底的渗透。
  6. 加入 10-20 μL 的萤火素荧光素基板,并通过多标签板读取器测量光单元 (LU)。
  7. 要确定 P53 蛋白质转换能力,请将每口井的 LU 标准化到相应的 OD600nm(相对光单位,RLU)。计算3-4个酵母转化菌落块的平均RLU和标准偏差。
  8. 比较 P53 蛋白质与 P53 野生型和空矢量的换活化数据,方法是减去使用空矢量获得的值,或者除以使用空矢量获得的值(即计算感应折叠)。
    注:P53转活活性也可在存在P53相互作用蛋白(即MDM2和MDMX)和/或包括药物治疗的情况下使用相同的实验设置进行评估。

4. 使用酵母型皮测定评估P53蛋白生长抑制

  1. 使用第 2 节中描述的基于 LiAc 的方法,使用 P53/MDM2/MDMX(或对照)表达载体(表4) 转换酵母细胞。使用CG379菌株(表1),在最小选择性板上传播酵母转化剂(表2)。
  2. 在最小选择性培养基(表2)中生长转化细胞,约1个OD600nm。
  3. 在选择性诱导介质中将酵母细胞稀释至0.05 OD600nm(表2),并可选择将选定的小分子添加到适当的浓度(或仅溶剂),以测试其在重新激活突变P53或抑制MDM2方面的有效性。/MDMX-P53 交互。
  4. 在连续轨道晃动(200 rpm)下,在30°C下孵育细胞约42小时(负对照酵母达到中对数阶段所需的时间,约0.45 OD600nm)。
  5. 在最小选择性板上点100μL等分的酵母细胞培养物(表2)。
  6. 在30°C孵育2天。
  7. 通过计算在100μL培养液滴中获得的菌落数量(菌落形成单位,CFU计数)来测量酵母生长。例如,计算化合物的突变重新激活效果,考虑野生型P53表达酵母的生长作为最大可能效果(设置为100%),而表达突变P53(但暴露于溶剂控制)的细胞的生长表示零级别的重新激活。

结果

建造ADE2或LUC1记者 酵母菌株

Delitto perfetto 方法12、14、15、16已经过改造,可实现 P53 报告酵母菌株的构造 (图1B)。该方法采用?...

讨论

基于酵母的检测已被证明对研究P53蛋白功能的各个方面是有用的。这些测定对于评估P53对RE目标位点的变异性(包括功能多态性评价)特别敏感。彩色检测器的使用以及荧光酶测定的小型化,可产生成本效益和相对可扩展的测定。此外,生长抑制试验可能适用于化学库筛选,通过测量吸收性自动定量酵母细胞活力。虽然由于ABC运输机的细胞壁和作用而限制渗透性被认为是使用酵母进行药物筛选的一个限制...

披露声明

提交人声明没有利益冲突。

致谢

我们感谢欧洲联盟(FEDER基金POCI/01/0145/FEDER/007728通过竞争歌剧因素方案)和国家基金(FCT/MEC,发展基金和埃杜卡奥省)下伙伴关系协议 PT2020 UID/QUI/50006/2019 和项目 (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014 - POCI-01-0145-FEDER-016581。FCT研究金:SFRH/BD/96189/2013(S. Gomes)。这项工作得到了意大利都灵的Compagnia S. Paolo(项目 2017.0526)和卫生部的支持(项目 5x1000、2015 和 2016;2016 年当前研究)。我们深切感谢特雷莎·洛佩斯-阿里亚斯·黑山博士(特伦托大学实验科学教学实验室)协助进行录像。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
L-Aspartic acidSIGMA11189
QIAquick PCR Purification KitQIAGEN28104
L-PhenylalanineSIGMA78019
PeptoneBD Bacto211677
Yeast ex+A2:C26tractBD Bacto212750
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium SulfateBDTM233520
Lithium Acetate DihydrateSIGMA517992
Bacteriological Agar Type ABiokar DiagnosticsA1010 HA
G418 disulfate saltSIGMAA1720
Ammonium SulfateSIGMAA2939
L-Arginine Monohydro-chlorideSIGMAA5131
Adenine Hemisulfate SaltSIGMAA9126
Passive Lysis Buffer 5xPROMEGAE1941
Bright-Glo Luciferase Assay System PROMEGAE2620
5-FOAZymo ResearchF9001
D-(+)-GalactoseSIGMAG0750
L-Glutamic acidSIGMAG1251
Dextrose SIGMAG7021
L-HistidineSIGMAH8125
L-IsoleucineSIGMAI2752
L-LysineSIGMAL1262
L-LeucineSIGMAL8000
L-MethionineSIGMAM2893
PEGSIGMAP3640
D-(+)-Raffinose PentahydrateSIGMAR0250
L-SerineSIGMAS4500
L-TryptophanSIGMAT0271
L-ThreonineSIGMAT8625
UracilSIGMAU0750
L-ValineSIGMAV0500

参考文献

  1. Spitz, F., Furlong, E. E. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nature Reviews Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).
  2. Pan, Y., Tsai, C. J., Ma, B., Nussinov, R. Mechanisms of transcription factor selectivity. Trends in Genetics. 26 (2), 75-83 (2010).
  3. Das, M. K., Dai, H. K. A survey of DNA motif finding algorithms. BMC Bioinformatics. 8 Suppl 7, S21 (2007).
  4. Sebastian, A., Contreras-Moreira, B. The twilight zone of cis element alignments. Nucleic Acids Resesarch. 41 (3), 1438-1449 (2013).
  5. Iggo, R., et al. Validation of a yeast functional assay for p53 mutations using clonal sequencing. Journal of Pathology. 231 (4), 441-448 (2013).
  6. Kaeberlein, M., Burtner, C. R., Kennedy, B. K. Recent developments in yeast aging. PLoS Genetics. 3 (5), e84 (2007).
  7. Scharer, E., Iggo, R. Mammalian p53 can function as a transcription factor in yeast. Nucleic Acids Research. 20 (7), 1539-1545 (1992).
  8. Kennedy, B. K. Mammalian transcription factors in yeast: strangers in a familiar land. Nature Reviews Molecular Cellular Biology. 3 (1), 41-49 (2002).
  9. Belli, G., Gari, E., Piedrafita, L., Aldea, M., Herrero, E. An activator/repressor dual system allows tight tetracycline-regulated gene expression in budding yeast. Nucleic Acids Research. 26 (4), 942-947 (1998).
  10. Mumberg, D., Muller, R., Funk, M. Regulatable promoters of Saccharomyces cerevisiae: comparison of transcriptional activity and their use for heterologous expression. Nucleic Acids Research. 22 (25), 5767-5768 (1994).
  11. Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).
  12. Inga, A., Storici, F., Darden, T. A., Resnick, M. A. Differential transactivation by the p53 transcription factor is highly dependent on p53 level and promoter target sequence. Molelcular and Cellular Biology. 22 (24), 8612-8625 (2002).
  13. Resnick, M. A., Inga, A. Functional mutants of the sequence-specific transcription factor p53 and implications for master genes of diversity. Proceeding of the National Academy of Science USA. 100 (17), 9934-9939 (2003).
  14. Tomso, D. J., et al. Functionally distinct polymorphic sequences in the human genome that are targets for p53 transactivation. Proceeding of the National Academy of Science USA. 102 (18), 6431-6436 (2005).
  15. Storici, F., Lewis, L. K., Resnick, M. A. In vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides. Nature Biotechnology. 19 (8), 773-776 (2001).
  16. Storici, F., Resnick, M. A. The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast. Methods in Enzymology. 409, 329-345 (2006).
  17. Campomenosi, P., et al. p53 mutants can often transactivate promoters containing a p21 but not Bax or PIG3 responsive elements. Oncogene. 20 (27), 3573-3579 (2001).
  18. Flaman, J. M., et al. A simple p53 functional assay for screening cell lines, blood, and tumors. Proceedings of the National Academy of Science USA. 92 (9), 3963-3967 (1995).
  19. Kovvali, G. K., Mehta, B., Epstein, C. B., Lutzker, S. G. Identification of partial loss of function p53 gene mutations utilizing a yeast-based functional assay. Nucleic Acids Research. 29 (5), E28 (2001).
  20. Shimada, A., et al. The transcriptional activities of p53 and its homologue p51/p63: similarities and differences. Cancer Research. 59 (12), 2781-2786 (1999).
  21. Sunahara, M., et al. Mutational analysis of p51A/TAp63gamma, a p53 homolog, in non-small cell lung cancer and breast. Oncogene. 18 (25), 3761-3765 (1999).
  22. Andreotti, V., et al. p53 transactivation and the impact of mutations, cofactors and small molecules using a simplified yeast-based screening system. PLoS ONE. 6 (6), e20643 (2011).
  23. Hekmat-Scafe, D. S., et al. Using yeast to determine the functional consequences of mutations in the human p53 tumor suppressor gene: An introductory course-based undergraduate research experience in molecular and cell biology. Biochemistry Molecular Biology Educaction. 45 (2), 161-178 (2017).
  24. Kato, S., et al. Understanding the function-structure and function-mutation relationships of p53 tumor suppressor protein by high-resolution missense mutation analysis. Proceedings of the National Academy of Science USA. 100 (14), 8424-8429 (2003).
  25. Monti, P., et al. Transcriptional functionality of germ line p53 mutants influences cancer phenotype. Clinical Cancer Research. 13 (13), 3789-3795 (2007).
  26. Monti, P., et al. Dominant-negative features of mutant TP53 in germline carriers have limited impact on cancer outcomes. Molecular Cancer Research. 9 (3), 271-279 (2011).
  27. Leroy, B., et al. The TP53 website: an integrative resource centre for the TP53 mutation database and TP53 mutant analysis. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D962-D969 (2013).
  28. Nigro, J. M., Sikorski, R., Reed, S. I., Vogelstein, B. Human p53 and CDC2Hs genes combine to inhibit the proliferation of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 1357-1365 (1992).
  29. Bureik, M., Jungbluth, A., Drescher, R., Wagner, P. Human p53 restores DNA synthesis control in fission yeast. Biological Chemistry. 378 (11), 1361-1371 (1997).
  30. Leao, M., et al. Alpha-mangostin and gambogic acid as potential inhibitors of the p53-MDM2 interaction revealed by a yeast approach. Journal of Natural Products. 76 (4), 774-778 (2013).
  31. Hadj Amor, I. Y., et al. Human p53 induces cell death and downregulates thioredoxin expression in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Research. 8 (8), 1254-1262 (2008).
  32. Leao, M., et al. Novel simplified yeast-based assays of regulators of p53-MDMX interaction and p53 transcriptional activity. FEBS J. 280 (24), 6498-6507 (2013).
  33. Di Ventura, B., Funaya, C., Antony, C., Knop, M., Serrano, L. Reconstitution of Mdm2-dependent post-translational modifications of p53 in yeast. PLoS ONE. 3 (1), e1507 (2008).
  34. Leao, M., et al. Discovery of a new small-molecule inhibitor of p53-MDM2 interaction using a yeast-based approach. Biochemichal Pharmacology. 85 (9), 1234-1245 (2013).
  35. Billant, O., Blondel, M., Voisset, C. p53, p63 and p73 in the wonderland of S. cerevisiae. Oncotarget. 8 (34), 57855-57869 (2017).
  36. Cho, Y., Gorina, S., Jeffrey, P. D., Pavletich, N. P. Crystal structure of a p53 tumor suppressor-DNA complex: understanding tumorigenic mutations. Science. 265 (5170), 346-355 (1994).
  37. Muller, P. A., Vousden, K. H., Norman, J. C. p53 and its mutants in tumor cell migration and invasion. Journal of Cellular Biology. 192 (2), 209-218 (2011).
  38. Oren, M., Rotter, V. Mutant p53 gain-of-function in cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), a001107 (2010).
  39. Walerych, D., Napoli, M., Collavin, L., Del Sal, G. The rebel angel: mutant p53 as the driving oncogene in breast cancer. Carcinogenesis. 33 (11), 2007-2017 (2012).
  40. Ciribilli, Y., et al. The coordinated p53 and estrogen receptor cis-regulation at an FLT1 promoter SNP is specific to genotoxic stress and estrogenic compound. PLoS ONE. 5 (4), e10236 (2010).
  41. Menendez, D., Inga, A., Resnick, M. A. Potentiating the p53 network. Discovery Medicine. 10 (50), 94-100 (2010).
  42. Monti, P., et al. Characterization of the p53 mutants ability to inhibit p73 beta transactivation using a yeast-based functional assay. Oncogene. 22 (34), 5252-5260 (2003).
  43. Monti, P., et al. Tumour p53 mutations exhibit promoter selective dominance over wild-type p53. Oncogene. 21 (11), 1641-1648 (2002).
  44. Shiraishi, K., et al. Isolation of temperature-sensitive p53 mutations from a comprehensive missense mutation library. Journal of Biological Chemistry. 279 (1), 348-355 (2004).
  45. Soussi, T. TP53 mutations in human cancer: database reassessment and prospects for the next decade. Advances in Cancer Research. 110, 107-139 (2011).
  46. Malkin, D. Li-Fraumeni Syndrome. Genes and Cancer. 2, 474-484 (2001).
  47. el-Deiry, W. S., Kern, S. E., Pietenpol, J. A., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Definition of a consensus binding site for p53. Nature Genetics. 1 (1), 45-49 (1992).
  48. Menendez, D., Inga, A., Resnick, M. A. The expanding universe of p53 targets. Nature Reviews in Cancer. 9, 724-737 (2009).
  49. Ciribilli, Y., et al. Transactivation specificity is conserved among p53 family proteins and depends on a response element sequence code. Nucleic Acids Research. 41 (18), 8637-8653 (2013).
  50. Smeenk, L., et al. Characterization of genome-wide p53-binding sites upon stress response. Nucleic Acids Research. 36, 3639-3654 (2008).
  51. Vyas, P., et al. Diverse p53/DNA binding modes expand the repertoire of p53 response elements. Proceeding of the National Academy of Science USA. 114 (40), 10624-10629 (2017).
  52. Tebaldi, T., et al. Whole-genome cartography of p53 response elements ranked on transactivation potential. BMC Genomics. 16, 464 (2015).
  53. Wang, T., et al. Species-specific endogenous retroviruses shape the transcriptional network of the human tumor suppressor protein p53. Proceedings of the National Academy of Science USA. 104, 18613-18618 (2007).
  54. Bond, G. L., et al. A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans. Cell. 119 (5), 591-602 (2004).
  55. Zeron-Medina, J., et al. A polymorphic p53 response element in KIT ligand influences cancer risk and has undergone natural selection. Cell. 155 (2), 410-422 (2013).
  56. Lion, M., et al. Evolution of p53 transactivation specificity through the lens of a yeast-based functional assay. PLoS ONE. 10 (2), e0116177 (2015).
  57. Schumacher, B., et al. C. elegans ced-13 can promote apoptosis and is induced in response to DNA damage. Cell Death and Differentiation. 12 (2), 153-161 (2005).
  58. Jordan, J. J., et al. Low-level p53 expression changes transactivation rules and reveals superactivating sequences. Proceeding of the National Academy of Science USA. 109 (36), 14387-14392 (2012).
  59. Soares, J., et al. Oxazoloisoindolinones with in vitro antitumor activity selectively activate a p53-pathway through potential inhibition of the p53-MDM2 interaction. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 66, 138-147 (2015).
  60. Leao, M., et al. Enhanced cytotoxicity of prenylated chalcone against tumour cells via disruption of the p53-MDM2 interaction. Life Sciences. 142, 60-65 (2015).
  61. Soares, J., et al. A tryptophanol-derived oxazolopiperidone lactam is cytotoxic against tumors via inhibition of p53 interaction with murine double minute proteins. Pharmacol Research. 95-96, 42-52 (2015).
  62. Soares, J., et al. DIMP53-1: a novel small-molecule dual inhibitor of p53-MDM2/X interactions with multifunctional p53-dependent anticancer properties. Molecular Oncology. 11 (6), 612-627 (2017).
  63. Soares, J., et al. Reactivation of wild-type and mutant p53 by tryptophanolderived oxazoloisoindolinone SLMP53-1, a novel anticancer small-molecule. Oncotarget. 7 (4), 4326-4343 (2016).
  64. Sharma, V., Monti, P., Fronza, G., Inga, A. Human transcription factors in yeast: the fruitful examples of P53 and NF-small ka, CyrillicB. FEMS Yeast Research. 16 (7), (2016).
  65. Stepanov, A., Nitiss, K. C., Neale, G., Nitiss, J. L. Enhancing drug accumulation in Saccharomyces cerevisiae by repression of pleiotropic drug resistance genes with chimeric transcription repressors. Molecular Pharmacology. 74 (2), 423-431 (2008).
  66. Sharma, V., et al. Quantitative Analysis of NF-kappaB Transactivation Specificity Using a Yeast-Based Functional Assay. PLoS ONE. 10 (7), e0130170 (2015).
  67. Epinat, J. C., et al. Reconstitution of the NF-kappa B system in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 13 (7), 599-612 (1997).
  68. Inga, A., Reamon-Buettner, S. M., Borlak, J., Resnick, M. A. Functional dissection of sequence-specific NKX2-5 DNA binding domain mutations associated with human heart septation defects using a yeast-based system. Human Molecular Genetics. 14 (14), 1965-1975 (2005).
  69. Reamon-Buettner, S. M., Ciribilli, Y., Inga, A., Borlak, J. A loss-of-function mutation in the binding domain of HAND1 predicts hypoplasia of the human hearts. Human Molecular Genetics. 17 (10), 1397-1405 (2008).
  70. Balmelli-Gallacchi, P., et al. A yeast-based bioassay for the determination of functional and non-functional estrogen receptors. Nucleic Acids Research. 27 (8), 1875-1881 (1999).

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