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Resumen

Aquí se presentan cuatro protocolos para construir y explotar cepas de reporteros de Saccharomyces cerevisiae para estudiar el potencial de transactivación P53 humano, los impactos de sus diversas mutaciones asociadas al cáncer, las proteínas interexpresas que interactúan y las proteínas interexpresas que interactúan, y los efectos de moléculas pequeñas específicas.

Resumen

La constatación de que la conocida proteína P53 de mamíferopuede actuar como un factor de transcripción (TF) en la levadura S. cerevisiae ha permitido el desarrollo de diferentes ensayos funcionales para estudiar los impactos de 1) sitio de unión [es decir, elemento de respuesta (RE)] variantes de secuencia en la especificidad de la transactivación P53 o 2) mutaciones TP53, cofactores co-expresados o moléculas pequeñas en la actividad de transactivación P53. Se han desarrollado diferentes aplicaciones de investigación básica straslacional. Experimentalmente, estos enfoques aprovechan dos grandes ventajas del modelo de levadura. Por un lado, la facilidad de edición del genoma permite la construcción rápida de sistemas de reporteros cualitativos o cuantitativos mediante la explotación de cepas isogénicas que difieren sólo a nivel de un P53-RE específico para investigar la especificidad de la secuencia de P53 dependiente transactivación. Por otro lado, la disponibilidad de sistemas regulados para la expresión ectópica P53 permite la evaluación de la transactivación en una amplia gama de expresión proteica. En este informe se revisan sistemas ampliamente utilizados que se basan en genes de reporteros de color, luciferasa, y el crecimiento de la levadura para ilustrar sus principales pasos metodológicos y evaluar críticamente su poder predictivo. Además, la versatilidad extrema de estos enfoques se puede explotar fácilmente para estudiar diferentes TF, incluyendo P63 y P73, que son otros miembros de la familia de genes TP53.

Introducción

La transcripción es un proceso extremadamente complejo que implica la organización dinámica, espacial y temporal de factores de transcripción (TF) y cofactores para el reclutamiento y modulación de arnmerasas en regiones de cromatina en respuesta a estímulos específicos1 . La mayoría de los TF, incluido el supresor de tumores P53 humano, reconocen elementos específicos de acción cis en forma de secuencias de ADN llamadas elementos de respuesta (RE), que consisten en motivos únicos (o múltiples) únicos de 6-10 de largo. Dentro de estos motivos, las posicionesindividuales pueden mostrar varios grados de variabilidad 2, generalmente resumidos por matrices de peso de posición (PWM) o logotipos3,4.

La levadura S. cerevisiae es un sistema modelo adecuado para el estudio de diferentes aspectos de las proteínas humanas a través de ensayos de complementación, expresión ectópica y ensayos funcionales, incluso cuando un gen de levadura ortopélogono no está presente5, 6 , 7. Debido a la conservación evolutivade los componentes basales del sistema transcripcional 8, muchos TF humanos (cuando se expresan ectopticamente en células de levadura) pueden modular la expresión de un gen reportero actuando a través de promotores contienen REE apropiados. El sistema de modelo de transcripción presentado aquí para P53 humano se caracteriza por tres variables principales cuyos efectos pueden ser modulados: 1) la modalidad de expresión y el tipo de P53, 2) la secuencia RE que controla la transcripción dependiente de P53, y 3) el tipo de gen del reportero (Figura1A).

En cuanto a la modalidad de expresión P53, S. cerevisiae permite la elección de promotores inducibles, represibles o constitutivos9,10,11. En particular, el promotor inducible GAL1 permite la expresión basal (usando la rafinosa como fuente de carbono) o variable (cambiando la cantidad de galactosa en los medios) de un TF en la levadura. De hecho, la expresión finamente ajustable representa un desarrollo crítico para el estudio no sólo P53 sí mismo, sino también otras proteínas de la familia P5312,13.

En cuanto al tipo de RE que controlan la expresión dependiente de P53, S. cerevisiae permite la construcción de diferentes cepas de reportero que poseen diferencias únicas en el RE de interés en un fondo isogénico. Este objetivo se alcanza mediante una adaptación de un enfoque de edición del genoma particularmente versátil desarrollado en S. cerevisiae,llamado delitto perfetto12,14,15,16.

Además, se pueden utilizar diferentes genes de reportero (es decir, URA3, HIS3 y ADE2) para evaluar cualitativa y cuantitativamente las actividades transcripcionales de los FE humanos en S. cerevisiae,cada uno con características específicas que pueden adaptarse a las necesidades experimentales17,18,19,20,21. La expresión de estos genes reportero confiere uracilo, histidina y protrotrofia de adenina, respectivamente. El reportero de URA3 no permite el crecimiento de células en presencia de 5-FOA también, y por lo tanto puede ser contraseleccionado. El sistema de reporteros ADE2 tiene la ventaja de que, además de la selección nutricional, permite la identificación de células de levadura que expresan tipo salvaje (es decir, funcional en expresión ADE2) o mutantes (es decir,no funcionales en ADE2 ) P53 del color de la colonia.

Por ejemplo, las células de levadura que expresan el gen ADE2 generan colonias blancas de tamaño normal en placas que contienen cantidades limitantes de adenina (2,5-5,0 mg/L), mientras que las que pobremente o no transcriben aparecen en la misma placa que el rojo más pequeño (o rosa) Colonias. Esto se debe a la acumulación de un intermedio en la vía biosintética de adenina (es decir, P-ribosylamino-imidazol, que anteriormente se ha llamado amino-imidazol ribotida o AIR), que se convierte para formar un pigmento rojo. El gen cualitativo reportero ADE2 basado en color ha sido reemplazado por el cuantitativo Firefly Photinus pyralis (LUC1)12,22. Más recientemente, el reportero de ADE2 se ha combinado con el reportero de lacZ en un ensayo de reportero doble, semicuantitativo y fácil de obtener que puede ser explotado para subclasificar mutantes P53 de acuerdo con su nivel residual de funcionalidad 23.

También se han utilizado reporteros fluorescentes como EGFP (proteína fluorescente verde mejorada) o DsRed (Discosoma sp. proteína fluorescente roja) para la evaluación cuantitativa de la actividad de transactivación asociada con todas las posibles mutaciones de SECUENCIA de codificación TP5324. Por último, la posibilidad de combinar promotores ajustables para la expresión de alelo P53 con cepas de levadura isogénicas diferentes para el gen RE y/o reportero ha llevado al desarrollo de una matriz de datos que genera una clasificación refinada de las cepas de mutantes P53 alelos25,26,27.

Los enfoques descritos anteriormente se utilizan para medir la actividad transcripcional de la proteína P53. Sin embargo, la expresión de tipo salvaje P53 en la levadura S. cerevisiae28 y Schizosaccharomyces pombe29 puede causar retraso en el crecimiento, que se ha asociado con la detención del ciclo celular28,30 o muerte celular31. En ambos casos, la inhibición del crecimiento de la levadura se desencadena por una alta expresión de P53 y se ha correlacionado con la posible modulación transcripcional de genes de levadura endógenos implicados en el crecimiento celular. Apoyando esta hipótesis, el mutante de pérdida de función P53 R273H no interfirió con el crecimiento de las células de levadura cuando se expresa en niveles similares a P5332de tipo salvaje. Por el contrario, la expresión en levadura del mutante tóxico P53 V122A (conocido por una mayor actividad transcripcional en comparación con el tipo salvaje P53) causó un efecto inhibidor del crecimiento más fuerte que el tipo salvaje P5332.

Además, se demostró que el MDM2 humano fue capaz de inhibir la actividad transcripcional humana P53 en la levadura, promoviendo su ubiquitinación y posterior degradación33. En consecuencia, se demostró la capacidad de MDM2 humano y MDMX para inhibir la inhibición del crecimiento de levadura inducida por P5332,34. En un estudio adicional, se estableció una correlación entre la actividad transcripcional P53 y los niveles de expresión de actina, con la identificación de un putativo P53 RE aguas arriba en el gen ACT1 en la levadura32. Consistentemente, la expresión de actina fue mejorada por P53 de tipo salvaje y aún más por P53 V122A, pero no por el mutante P53 R273H. Por el contrario, la expresión de actina por P53 disminuyó en la copresencia de inhibidores de P53 MDM2, MDMX o pifithrin-o (un inhibidor de molécula pequeña de la actividad transcripcional P53), consistente con resultados basados en el ensayo de crecimiento de levadura. Es importante destacar que estos resultados establecieron una correlación entre la inhibición del crecimiento inducida por P53 y el grado de su actividad en la levadura, que también ha sido explotada para identificar y estudiar moléculas pequeñas que modulan las funciones P5328,34 , 35.

Protocolo

1. Construcción de cepas de levadura de reportero ADE2 o LUC1 que contengan un RE específico (yAFM-RE o yLFM-RE)

  1. Racha una cepa yAFM-ICORE o yLFM-ICORE12,14 (ICORE - I, ISce-I endonucleasa bajo el promotor GAL1; CO - contador seleccionable URA3; RE - reportero KanMX4 que confiere resistencia a la kanamicina; Tabla 1) de un stock de glicerol del 15% almacenado a -80 oC en una placa de agar YPDA (Tabla 2). Dejar crecer durante 2-3 días a 30oC.
  2. Tome una colonia de levaduras de la placa fresca (no más de 3 semanas de edad) y colóquela en un pequeño matraz que contenga 5 ml de YPDA (Tabla2). Incubar a 30oC durante la noche, agitando a 150-200 rpm.
  3. Al día siguiente, para eliminar todos los restos de dextrosa, pellet las células durante 2 min a 3.000 x g y desechar el sobrenadante por inversión del tubo.
    NOTA: Realice todas las centrifugaciones de este protocolo a temperatura ambiente (RT).
  4. Resuspender el pellet celular en 30-50 ml de CM precalentado (medios completos) que contenga galactosa (Tabla 2) e incubar durante 4 h a 30 oC, agitando a 150-200 rpm (necesario para la inducción de I-SceI).
  5. Centrifugar las células durante 2 min a 3.000 x g y desechar el sobrenadante por inversión del tubo.
  6. Resuspenda el pellet celular en 30-50 ml de agua estéril. Repita el paso 1.5.
  7. Resuspenda el pellet celular en 10 ml de agua estéril. Repita el paso 1.5.
  8. Resuspender el pellet celular en 5 mlde LiAcTE estéril (Tabla 3), una solución iónica que favorece la admisión de ADN. Repita el paso 1.5.
  9. Resuspenda el gránulo celular en 250 ml de LiAcTE estéril y transfiera las células a un tubo de 1,5 ml. Repita el paso 1.5 y resuspenda el pellet celular en 300-500 l de LiAcTE estéril.
  10. Durante los lavados, desnaturalice una solución de 10 mg/ml de portador de ADN de esperma de salmón durante 10 minutos a 100 oC y enfríe inmediatamente en hielo para mantenerlo como ADN de una sola cadena.
  11. En un tubo separado de 1,5 ml, añadir 500 picomolas del oligonucleótido deseado (Tabla3), 5 l del ADN portador de espermatozoides de salmón hervido, 300 ml de LiAcTE PEG estéril (Tabla3) y 50 ml de la suspensión de la célula de levadura (del paso 1.9).
  12. Vortex los tubos durante 10 s para mezclar e incubar durante 30 min a 30 oC, agitando a 150-200 rpm. Coloque los tubos de 1,5 ml en el lateral para favorecer el temblor.
  13. Choque por calor de las células de levadura durante 15 min a 42 oC en un bloque de calentamiento, luego centrifugar las células durante 20 s a 10.000 xg. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 1 ml de agua estéril.
  14. Esparza 100 s de la suspensión celular en la placa de agar YPDA e incuba (al revés) durante 1 día a 30oC. Para asegurar que se obtengan colonias bien separadas, también se extienden 100 l de una dilución de 1:10.
  15. Al día siguiente, placa réplica utilizando terciopelos estériles en placa de agar CM que contiene dextrosa y 5-FOA (Tabla2). Considere una segunda placa de réplica en una placa nueva si se transfieren muchas celdas (es decir, algún crecimiento de células URA3).
  16. Tres días más tarde, placa de réplica en YPDA no selectivo y YPDA que contiene placas de agar G418 (un antibiótico aminoglucósido similar a la kanamicina) (Tabla2), marcando cada placa para facilitar su posterior comparación. Incubar las placas durante la noche a 30oC.
  17. Al día siguiente, identifique las cepas de reporteros candidatos de colonias que son sensibles al G418 pero crecen en placas YPDA (por ejemplo, colonias yLFM- o yAFM-RE). Rayar las colonias identificadas (3-6 colonias) en una nueva placa YPDA para obtener aislados de una sola colonia y dejarlas crecer durante 2 días a 30 oC.
  18. Parche las colonias de levadura única en una placa YPDA para aislar las colonias para análisis posteriores. Después de 24 h a 30 oC, pruébelos replicando en una placa de agar YPGA (Tabla 2) que impiden el crecimiento de pequeños mutantes (es decir, mutantes con deficiencia respiratoria). Al mismo tiempo, placa de réplica en una nueva placa de agar YPDA.
  19. Pruebe los parches correctos (es decir, el crecimiento en placas de agar YPDA e YPGA; 1-3 colonias) del paso 1.18 para la presencia de la integración correcta de oligonucleótidos por la PCR de colonia. Ensamble una mezcla de reacción añadiendo 5 ml de tampón de PCR de 10x (1,5 mM MgCl2), 2 ml de 10 picomoles/imprimaciones de L (Tabla3),4 ml de dNTPs de 2,5 ml, 0,25 ml de 5 U/L de polimerasa Taq y agua a un volumen final de 50 ml. Multiplique la mezcla de reacción para el número de colonias de levadura que necesitan ser examinadas y alícuota s50 l en cada tubo de PCR. Usando una pipeta, agregue una cantidad muy pequeña de células de levadura de la placa de agar YPDA en una sola mezcla de reacción de PCR.
  20. Realizar la reacción de PCR con el siguiente programa: 94 oC durante 8 min seguido de 35 ciclos de desnaturalización durante 1 min a 94 oC, recocido de imprimaciones durante 1 min a 55 oC y extensión de 2 min a 72 oC.
  21. Una vez completada la reacción, cargue una alícuota de la reacción de PCR (aproximadamente una décima parte del volumen) en un gel de agarosa para comprobar el tamaño correcto (500 bp).
  22. Secuenciar el producto PCR después de la purificación con un kit comercial para confirmar la integración de la secuencia RE deseada utilizando las mismas imprimaciones del paso 1.19.
  23. Después de la validación de la secuencia correcta, haga un stock de glicerol del 15% de cultivo de cepas yAFM-RE o yLFM-RE (en YPDA) y guárdelo a -80 oC.

2. Evaluación de la capacidad de transactivación de proteínas P53 utilizando el ensayo cualitativo de levadura ADE2 basado en color

  1. Repita los pasos 1.1 y 1.2 utilizando la cepa yAFM-RE (Tabla1).
  2. Al día siguiente, diluir el cultivo celular (1:10) en 30-50 mL de YPDA precalentado y continuar incubando a 30 oC agitando hasta que el OD600nm alcance 0.8-1.0 (2 h).
  3. Repita los pasos 1.5-1.10.
  4. En un tubo separado de 1,5 ml, añadir 300-500 ng de vector de expresión de levadura P53 (o control) (Tabla4), 5 l del portador de ADN espermino de salmón hervido, 300 ml de LIAcTE PEG estéril y 50 ml de suspensión de células de levadura.
  5. Repita los pasos 1.12 y 1.13, pero resuspenda el gránulo celular en 300 ml de agua estéril.
  6. Esparza 100 sde la suspensión celular en placas sintéticas selectivas (para expresión P53 ovector de control) que contengan dextrosa como fuente de carbono y alta cantidad de adenina (Tabla 2), luego incubar (al revés) a 30 oC durante 2-3 días.
  7. Las colonias transformadoras de levadura única de racha (2-6 rayas por plato) en una nueva placa selectiva y las dejan crecer durante la noche a 30 oC.
  8. Al día siguiente, utilizando la placa de réplica de terciopelos estériles en nuevas placas selectivas que permiten la evaluación del fenotipo de color (es decir, placas que contienen dextrosa como fuente de carbono pero limitando la cantidad de adenina; Tabla 2). Incubar las placas boca abajo a 30oC durante 3 días. Opcionalmente, para evaluar la sensibilidad a la temperatura de la proteína P53, incubar a tres temperaturas diferentes durante 3 días: 24 oC, 30 oC y 37 oC.
    NOTA: La misma raya se puede replicar varias veces.
  9. Para evaluar la capacidad de transactivación de proteínas P53, compruebe el fenotipo basado en color de las colonias de levadura y compare el fenotipo de proteína P53 con respecto a los fenotipos vectoriales vacíos y de tipo salvaje P53.

3. Evaluación de la capacidad de transactivación de proteínas P53 utilizando el ensayo cuantitativo de levadura LUC1 basado en luminiscencia

  1. Transforme las células de levadura con vectores de expresión P53 (o de control) (Tabla 4) utilizando el método basado en LiAc descrito en el protocolo 2. Utilice la cepa yLFM-RE (Tabla 1).
  2. Parche los transformadores individuales en una nueva placa selectiva con la alta cantidad de adenina que contiene glucosa como fuente de carbono y los deja crecer a 30 oC durante la noche. Para cada tipo de transformación, haga 5-7 parches diferentes.
  3. Después del crecimiento nocturno, resuspenda una pequeña cantidad de células de levadura usando un palillo estéril o una punta de pipeta de la placa en un medio selectivo sintético que contenga dextrosa o rafinosa como fuente de carbono (200 oL de volumen final en una placa transparente de 96 pocillos, con una placa de pozo redonda de 96, con una placa redonda de 96 pocillos, con una placa redonda de 96 pocillos, con una placa de pozo redonda, con una o fondo plano). Si el experimento requiere una expresión P53 inductible, añada galactosa al medio de la rafinosa para modular el nivel de inducción (Tabla 2).
    NOTA: Estas suspensiones celulares deben tener un OD de600 nm de aproximadamente 0,4 y no superior a 1.
  4. Mida la absorbancia de cada pocal a OD600nm después de la expresión P53 inducible (4-8 h a 30oC con agitación de 150-200 rpm) utilizando un lector de placas multietiqueta. Asegúrese de que las suspensiones celulares sean homogéneas mezclando cada una de ellas con una pipeta multicanal.
  5. Transfiera 10-20 l de suspensión celular de la placa transparente 96 well a una placa blanca de 384 (o 96) y mezcle con un volumen igual (10-20 l) de tampón de lisis. Incubar durante 10-15 minutos a RT en una coctelera (150-200 rpm) para lograr la permeabilización de la célula al sustrato de luciferasa.
  6. Añadir 10-20 l de sustrato de Luciferasa de Luciérnaga y medir las unidades de luz (LU) por un lector de placas multi-etiqueta.
  7. Para determinar la capacidad de transactivación de proteínas P53, normalice las LU de cada pocal a la OD correspondientede 600 nm (unidad de luz relativa, RLU). Calcular la RLU promedio y la desviación estándar de 3-4 parches de colonias transformadoras de levadura.
  8. Compare los datos de transactivación de proteínas P53 con respecto al tipo salvaje P53 y al vector vacío, ya sea restando los valores obtenidos con el vector vacío o dividiendo entre los valores obtenidos con el vector vacío (es decir, el pliegue informático de inducción).
    NOTA: La actividad de transactivación de P53 también se puede evaluar utilizando la misma configuración experimental en presencia de proteínas que interactúan con P53 (es decir, MDM2 y MDMX) y/o incluido el tratamiento farmacológico.

4. Evaluación de la inhibición del crecimiento de proteínas P53 utilizando el ensayo fenotípico de levadura

  1. Transforme las células de levadura con vectores de expresión P53/MDM2/MDMX (o control) (Tabla4) utilizando el método basado en LiAc descrito en la sección 2. Utilice la cepa CG379 (Tabla 1) y extienda los transformadores de levadura en placas selectivas mínimas (Tabla 2).
  2. Cultivar células transformadas en un medio selectivo mínimo (Tabla2) a aproximadamente 1 OD600nm.
  3. Diluir las células de levadura a 0,05 OD600 nm en el medio de inducción selectiva (Tabla2), y, opcionalmente, añadir una molécula pequeña elegida a la concentración adecuada (o solo disolvente) para probar su eficacia en la reactivación del mutante P53 o en la inhibición de MDM2- /MDMX-P53 interacciones.
  4. Incubar células a 30 oC bajo agitación orbital continua (200 rpm) durante aproximadamente 42 h (tiempo requerido por la levadura de control negativo para alcanzar la fase de registro medio, aproximadamente 0,45 OD600nm).
  5. Detectar alícuotas de 100 ol de cultivos de células de levadura en placas selectivas mínimas (Tabla 2).
  6. Incubar durante 2 días a 30oC.
  7. Mida el crecimiento de la levadura contando el número de colonias obtenidas en las gotas de cultivo de 100 l (unidad formadoras de colonias, recuento de UFC). Por ejemplo, calcular el efecto de reactivación mutante de los compuestos teniendo en cuenta el crecimiento de la levadura de tipo salvaje P53 que expresa como el efecto máximo posible (establecido en 100%), mientras que el crecimiento de células que expresan mutante P53 (pero expuesto al control de disolvente) representa el nivel cero de reactivación.

Resultados

Construcción de ADE2 o LUC1 reportero tensións de levadura

Eldelitto perfettoapproach12,14,15,16 ha sido adaptado para permitir la construcción de cepas de levadura de reportero P53 (Figur...

Discusión

Los ensayos a base de levadura han demostrado ser útiles para investigar varios aspectos de las funciones de la proteína P53. Estos ensayos son particularmente sensibles para evaluar el potencial de transactivación De53 hacia variantes de sitios objetivo RE, incluida la evaluación de polimorfismos funcionales. El uso de reporteros de color, así como la miniaturización del ensayo de luciferasa resultan en ensayos rentables y relativamente escalables. Además, la prueba de inhibición del crecimiento es potencialment...

Divulgaciones

Los autores no declaran conflicto de intereses.

Agradecimientos

Agradecemos a la Unión Europea (Fondos FEDER POCI/01/0145/FEDER/007728 a través del Programa Operacion Factores de Competitividade - COMPETE) y fondos nacionales (FCT/MEC, Fundación para la Ciencia y la Tecnología y El Ministério de la Educación y la Ciencia) en el marco de la Fundación para la Ciencia y la Tecnología y el Ministério de la Educación y la Ciencia) en el marco de la Fundación para la Ciencia y la Tecnología y el Ministério da Educación y La Ciéncia) en el marco de la Fundación para la Ciencia y la Tecnología y el Ministério de la Educación y la Ciencia) en el marco de la Fundación para la Ciencia y la Tecnología y el Ministério de la Educación y la Ciencia) en el marco de la Acuerdo de Asociación PT2020 UID/QUI/50006/2019 y los proyectos (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014 - POCI-01-0145-FEDER-016581. Becas FCT: SFRH/BD/96189/2013 (S. Gomes). Este trabajo fue apoyado por la Compagnia S. Paolo, Turín, Italia (Proyecto 2017.0526) y el Ministerio de Salud, (Proyecto 5x1000, 2015 y 2016; investigación actual 2016). Agradecemos profundamente a la Dra. Teresa López-Arias Montenegro (Universidad de Trento, laboratorios de enseñanza de ciencias experimentales) por su ayuda con la grabación de vídeo.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
L-Aspartic acidSIGMA11189
QIAquick PCR Purification KitQIAGEN28104
L-PhenylalanineSIGMA78019
PeptoneBD Bacto211677
Yeast ex+A2:C26tractBD Bacto212750
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium SulfateBDTM233520
Lithium Acetate DihydrateSIGMA517992
Bacteriological Agar Type ABiokar DiagnosticsA1010 HA
G418 disulfate saltSIGMAA1720
Ammonium SulfateSIGMAA2939
L-Arginine Monohydro-chlorideSIGMAA5131
Adenine Hemisulfate SaltSIGMAA9126
Passive Lysis Buffer 5xPROMEGAE1941
Bright-Glo Luciferase Assay System PROMEGAE2620
5-FOAZymo ResearchF9001
D-(+)-GalactoseSIGMAG0750
L-Glutamic acidSIGMAG1251
Dextrose SIGMAG7021
L-HistidineSIGMAH8125
L-IsoleucineSIGMAI2752
L-LysineSIGMAL1262
L-LeucineSIGMAL8000
L-MethionineSIGMAM2893
PEGSIGMAP3640
D-(+)-Raffinose PentahydrateSIGMAR0250
L-SerineSIGMAS4500
L-TryptophanSIGMAT0271
L-ThreonineSIGMAT8625
UracilSIGMAU0750
L-ValineSIGMAV0500

Referencias

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