Autores
Entre em contato

Entrar

É necessária uma assinatura da JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou comece sua avaliação gratuita.

Neste Artigo

  • Resumo
  • Resumo
  • Introdução
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discussão
  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Aqui apresentamos quatro protocolos para construir e explorar cepas de levedura Saccharomyces cerevisiae reporter para estudar o potencial de transativação do p53 humano, impactos de suas várias mutações associadas ao câncer, proteínas interagindo coexpressas e os efeitos de moléculas pequenas específicas.

Resumo

A constatação de que a conhecida proteína p53 de mamíferos pode atuar como fator de transcrição (TF) na levedura S. cerevisiae permitiu o desenvolvimento de diferentes ensaios funcionais para estudar os impactos de 1) local de ligação [i.e., elemento de resposta (re)] variantes da seqüência na especificidade da transativação p53 ou 2) mutações TP53 , cofactores co-expressados, ou moléculas pequenas na atividade da transativação p53. Diferentes aplicações de pesquisa de base e translacional foram desenvolvidas. Experimentalmente, essas abordagens exploram duas grandes vantagens do modelo de levedura. Por um lado, a facilidade de edição do genoma permite a construção rápida de sistemas de repórter qualitativos ou quantitativos, explorando cepas isogênicas que diferem apenas ao nível de um específico p53-RE para investigar a especificidade da seqüência de p53-dependente transactivacao. Por outro lado, a disponibilidade de sistemas regulamentados para a expressão ectópica do p53 permite a avaliação da transativação em uma ampla gama de expressão protéica. Revisados neste relatório são amplamente utilizados sistemas que são baseados em genes de repórter de cor, luciferase, e o crescimento de levedura para ilustrar suas principais etapas metodológicas e para avaliar criticamente o seu poder preditivo. Além disso, a extrema versatilidade dessas abordagens pode ser facilmente explorada para estudar diferentes TFs, incluindo P63 e p73, que são outros membros da família gene TP53 .

Introdução

A transcrição é um processo extremamente complexo envolvendo a organização dinâmica, espacial e temporal de fatores de transcrição (TFs) e cofatores para o recrutamento e modulação de polimerases de RNA em regiões de cromatina em resposta a estímulos específicos1 . A maioria dos TFs, incluindo o supressor do tumor p53 humano, reconhecem elementos específicos de ação cis na forma de seqüências de DNA chamados elementos de resposta (REs), que consistem em únicos (ou múltiplos) motivos únicos ~ 6-10 nucleotídeos longos. Dentro desses motivos, posições individuais podem mostrar vários graus de variabilidade2, geralmente resumidos por matrizes de peso de posição (PWM) ou logotipos3,4.

O fermento S. cerevisiae é um sistema modelo adequado para o estudo de diferentes aspectos das proteínas humanas através de ensaios de complementação, expressão ectópica e ensaios funcionais, mesmo quando um gene de levedura ortologica não está presente5, 6 anos de , 7. devido à conservação evolutiva dos componentes basais do sistema transcricional8, muitos TFs humanos (quando ectopicamente expressos em células de levedura) pode modular a expressão de um gene repórter, agindo através de promotores projetados para contêm REs apropriados. O sistema de modelo de transcrição aqui apresentado para a p53 humana é caracterizado por três grandes variáveis cujos efeitos podem ser modulados: 1) a modalidade de expressão e tipo de p53,2) a seqüência RE controlando a transcrição dependente do p53, e 3) o tipo de gene repórter (Figura 1a).

Em relação à modalidade de expressão da p53, S. cerevisiae possibilita a escolha de promotores indutivos, represáveis ou constituintes9,10,11. Em particular, o promotor GAL1 induzível permite basal (usando rafinose como uma fonte de carbono) ou variável (alterando a quantidade de galactose na mídia) expressão de um TF em levedura. De fato, a expressão finamente sintonável representa um desenvolvimento crítico para estudar não apenas o p53 propriamente dito, mas também outras proteínas da família p5312,13.

Em relação ao tipo de REs que controla a expressão dependente do p53, S. cerevisiae permite a construção de diferentes cepas de repórter possuindo diferenças únicas no re de interesse em um fundo isogênico de outra forma. Esse objetivo é atingido por meio de uma adaptação de uma abordagem de edição de genoma particularmente versátil desenvolvida em S. cerevisiae, denominada Delitto Perfetto12,14,15,16.

Além disso, diferentes genes de repórter (i.e., URA3, HIS3 e ADE2) podem ser usados para avaliar qualitativamente e quantitativamente as atividades transcricional do TFs humano em S. cerevisiae, cada uma com características específicas que podem ser adaptados às necessidades experimentais17,18,19,20,21. A expressão destes genes do repórter confere o uracil, o histidine, e o prototrophy do adenina, respectivamente. O URA3 reporter não permite o crescimento de células na presença de 5-Foa também, e, portanto, pode ser contraselecionado. O sistema ADE2 reporter tem a vantagem de que, além da seleção nutricional, permite a identificação de células de levedura que expressam Wild-Type (ou seja, funcional na expressão ADE2 ) ou mutante (ou seja,não funcional em ADE2 ) P53 da cor da colônia.

Por exemplo, as células de levedura que expressam o gene ADE2 geram colônias brancas normalmente dimensionadas em placas contendo quantidades limitantes de adenina (2,5-5,0 mg/L), enquanto aquelas que mal ou não transtranscriam aparecem na mesma placa que o vermelho menor (ou rosa) Colônias. Isto é devido ao acúmulo de um intermediário na via de adenina biossintética (i.e., P-ribosylamino-imidazol, que tem sido anteriormente chamado de amino-imidazol aminoimidazole ou ar), que é convertido para formar um pigmento vermelho. A cor qualitativa baseada ADE2 gene do repórter foi substituída já com o Firefly quantitativo Photinus Tânia (LUC1)12,22. Mais recentemente, o repórter ADE2 foi combinado com o repórter de lacZ em um fácil-à-contagem, semi-quantitativo, ensaio dobro do repórter que pode ser explorado para subclassificar os mutantes p53 de acordo com seu nível residual de funcionalidade a 23.

Os repórteres fluorescentes tais como EGFP (proteína fluorescente verde aumentada) ou dsred (proteína fluorescente vermelha de discosoma SP.) foram usados igualmente para a avaliação quantitativa da atividade do transactivacao associada com todas as mutações missense possíveis no TP53 seqüência de codificação24. Por fim, a chance de combinar promotores sintonáveis para a expressão do alelo p53 com cepas de levedura isogênicas diferindo para o gene RE e/ou repórter levou ao desenvolvimento de uma matriz de dados que gera uma classificação refinada de câncer associado e germline alelos p53 do mutante25,26,27.

As abordagens descritas acima são usadas para medir a atividade transcricional da proteína p53. No entanto, a expressão de p53 do tipo Wild no fermento S. cerevisiae28 e Schizosaccharomyces pombe29 pode causar retardo de crescimento, que tem sido associado à parada do ciclo celular28,30 ou morte celular31. Em ambos os casos, a inibição do crescimento do fermento é desencadeada pela expressão p53 elevada e foi correlacionada com a modulação transcricional potencial de genes endógenos do fermento envolvidos no crescimento da pilha. Suportando esta hipótese, o mutante da perda--função p53 R273H não interferiu com crescimento da pilha do fermento quando expressado em níveis similares como selvagem-tipo p5332. Inversamente, a expressão no fermento do mutante tóxico p53 V122A (sabido para uma atividade transcricional mais elevada comparada ao selvagem-tipo p53) causou um efeito inibitório do crescimento mais forte do que o selvagem-tipo p5332.

Adicionalmente, demonstrou-se que a MDM2 humana foi capaz de inibir a atividade transcricional p53 humana em levedura, promovendo sua ubiquitinação e subsequente degradação33. Conformemente, a habilidade do Mdm2 humano e do MDMX de inibir a inibição p53-induzida do crescimento do fermento foi demonstrada32,34. Em um estudo adicional, estabeleceu-se uma correlação entre a atividade transcricional p53 e os níveis de expressão de actina, com a identificação de uma putativa p53 RE upstream no gene Act1 em levedura32. Consistentemente, a expressão do actínio foi aumentada pelo selvagem-tipo p53 e ainda mais por p53 V122A, mas não pelo mutante p53 R273H. Inversamente, a expressão do actina pelo p53 diminuiu na copresença de inibidores p53 Mdm2, MDMX, ou pifithrin-α (um inibidor da pequeno-molécula da atividade transcricional p53), consistente com os resultados baseados no ensaio do fermento-crescimento. É importante ressaltar que esses resultados estabeleceram uma correlação entre a inibição do crescimento induzida pela p53 e o grau de sua atividade na levedura, que também foi explorada para identificar e estudar pequenas moléculas modulando as funções p5328,34 , 35.

Protocolo

1. construção de cepas de levedura ADE2 ou LUC1 repórter contendo um re específico (Yafm-re ou ylfm-re)

  1. Raia uma estirpe yafm-iCore ou ylfm-iCore12,14 (iCore = i, ISCe-i endonuclease GAL1 promotor; CO = contador selecionável URA3; RE = repórter KanMX4 conferindo resistência à kanamicina; Tabela 1) de um estoque de glicerol a 15% armazenado em-80 ° c em uma placa de agar YPDA (tabela 2). Deixe crescer por 2-3 dias a 30 ° c.
  2. Tomar uma colônia de levedura a partir da placa fresca (não mais de 3 semanas de idade) e colocá-lo em um pequeno frasco contendo 5 mL de YPDA (tabela 2). Incubar a 30 ° c durante a noite, agitando em 150-200 rpm.
  3. No dia seguinte, para remover todos os vestígios de dextrose, pellet as células por 2 min em 3.000 x g e descartar o sobrenadante por inversão do tubo.
    Nota: realize todas as centrifugações neste protocolo à temperatura ambiente (RT).
  4. Ressuscite a pelota da pilha em 30-50 mL de CM pre-aquecido (meios completos) que contêm o galactose (tabela 2) e incubar para 4 h em 30 ° c, agitando em 150-200 rpm (necessário para a indução de I-SCEI).
  5. Centrifugue as células durante 2 min a 3.000 x g e descarte o sobrenadante por inversão do tubo.
  6. Resuspend a pelota da pilha em 30-50 mL da água estéril. Repita o passo 1,5.
  7. Ressuscitem o pellet celular em 10 mL de água estéril. Repita o passo 1,5.
  8. Ressuscitar o pellet celular em 5 mL de LiAcTE estéril (tabela 3), uma solução iónica que favorece a captação de DNA. Repita o passo 1,5.
  9. Ressuscitar o pellet celular em 250 μL de LiAcTE estéril e transferir as células para um tubo de 1,5 mL. Repita o passo 1,5 e ressuscite o pellet celular em 300-500 μL de Liacta estéril.
  10. Durante as lavas, desnaturam uma solução de 10 mg/mL de portador de DNA de esperma de salmão por 10 min a 100 ° c e resfrie imediatamente no gelo para mantê-lo como DNA de uma única fita.
  11. Num tubo separado de 1,5 mL, adicione 500 picomoles do oligonucleotídeo pretendido (tabela 3), 5 ΜL do ADN do portador de esperma de salmão cozido, 300 ΜL de Peg LiAcTE estéril (tabela 3) e 50 μL da suspensão da célula de levedura (a partir do passo 1,9).
  12. Vórtice dos tubos para 10 s para misturar e incubar por 30 min a 30 ° c, agitando a 150-200 rpm. Coloque os tubos de 1,5 mL no lado para favorecer a agitação.
  13. Choque térmico as células de levedura para 15 min a 42 ° c em um bloco de aquecimento, em seguida, Centrifugar as células para 20 s em 10.000 x g. Retire o sobrenadante e ressuscitem as células em 1 mL de água estéril.
  14. Distribuir 100 μL da suspensão da célula na placa de agar YPDA e incubar (de cabeça para baixo) durante 1 dia a 30 ° c. Para garantir colônias bem separadas são obtidos, também espalhar 100 μL de uma diluição 1:10.
  15. No dia seguinte, placa de réplica usando veludos estéreis na placa de agar CM contendo dextrose e 5-FOA (tabela 2). Considere uma segunda placa da réplica em uma placa nova se muitas pilhas são transferidas (isto é, algum crescimento de URA3 pilhas).
  16. Três dias depois, placa de réplica em YPDA não seletivo e YPDA contendo placas de ágar G418 (um antibiótico aminoglicídeo semelhante ao canamicina) (tabela 2), marcando cada placa para facilitar sua comparação subsequente. Incubar as placas durante a noite a 30 ° c.
  17. No dia seguinte, identifique as cepas de repórter candidatas de colônias que são G418 sensíveis, mas crescem em placas YPDA (por exemplo, colônias de yLFM ou yAFM-RE). Raia as colônias identificadas (3-6 colônias) em uma nova placa YPDA para obter isolados de colônia única e deixá-los crescer por 2 dias a 30 ° c.
  18. Remendo únicas colônias do fermento em uma placa de YPDA para isolar as colônias para umas análises mais adicionais. Após 24 h a 30 ° c, teste-os pelo chapeamento da réplica em uma placa de agar YPGA (tabela 2) que impedem o crescimento de mutantes Petite (isto é, mutantes respiratório-deficientes). Ao mesmo tempo, placa da réplica em uma placa nova do agar de YPDA.
  19. Teste os remendos corretos (isto é, crescimento em placas do agar de YPDA e de YPGA; 1-3 colônias) da etapa 1,18 para a presença de integração correta do oligonucleotide pelo PCR da colônia. Monte uma mistura de reacção adicionando 5 μL de tampão de 10x PCR (1,5 mM MgCl2), 2 μL de 10 primers de picomoles/ΜL (tabela 3), 4 μL de dntps de 2,5 mm, 0,25 μL de 5 U/μL de polimerase de Taq e água até um volume final de 50 μL. Multiplique a mistura de reação para o número de colônias de levedura que precisam ser rastreadas e alíquota 50 μL em cada tubo de PCR. Usando uma pipeta, adicione uma quantidade muito pequena de células de levedura da placa de agar YPDA em uma única mistura de reação de PCR.
  20. Realize a reação de PCR com o seguinte programa: 94 ° c por 8 min seguidos por 35 ciclos de desnaturação por 1 min a 94 ° c, primers recozimento por 1 min a 55 ° c e extensão por 2 min a 72 ° c.
  21. Depois que a reação é terminada, carregue uma alíquota da reação do PCR (aproximadamente um décimo do volume) em um gel do agarose para verific o tamanho correto (~ 500 BP).
  22. Sequencia o produto do PCR após a purificação com um jogo comercial para confirmar a integração da seqüência desejada do RE usando os mesmos primers da etapa 1,19.
  23. Após a validação da seqüência correta, faça um estoque de glicerol de 15% da cultura de estirpe yAFM-RE ou yLFM-RE (em YPDA) e armazene-o em-80 ° c.

2. avaliação da capacidade de transativação da proteína p53 usando o ensaio de levedura ADE2 com base em cores qualitativa

  1. Repita os passos 1,1 e 1,2 utilizando a estirpe yAFM-RE (tabela 1).
  2. No dia a seguir, diluir a cultura celular (1:10) em 30-50 mL de YPDA pré-aquecido e continuar a incubar a 30 ° c agitando até que o OD600Nm atinja 0,8-1,0 (~ 2 h).
  3. Repita os passos 1.5-1.10.
  4. Em um tubo separado de 1,5 mL, adicione 300-500 ng de vetor de expressão de levedura p53 (ou controle) (tabela 4), 5 μl do portador de DNA de esperma de salmão cozido, 300 ΜL de Peg LiAcTE estéril e 50 μL de suspensão de células de levedura.
  5. Repita os passos 1,12 e 1,13, mas ressuscitem o pellet celular em 300 μL de água estéril.
  6. Espalhe 100 μL da suspensão celular em placas seletivas sintéticas (para a expressão ou controle do p53) contendo dextrose como fonte de carbono e alta quantidade de adenina (tabela 2), em seguida, incubar (de cabeça para baixo) a 30 ° c por 2-3 dias.
  7. Streak única levedura transformante colônias (2-6 estrias por placa) em uma nova placa seletiva e deixá-los crescer durante a noite a 30 ° c.
  8. O dia após, usando a placa estéril da réplica dos veludos em placas seletivas novas que permitem a avaliação do phenotype da cor (isto é, as placas que contêm a dextrose como a fonte do carbono mas limitando a quantidade de adenina; Tabela 2). Incubar as chapas de cabeça para baixo a 30 ° c durante 3 dias. Opcionalmente, para avaliar a sensibilidade à temperatura da proteína p53, incubar em três temperaturas diferentes por 3 dias: 24 ° c, 30 ° c e 37 ° c.
    Nota: a mesma raia pode ser revestida de réplica várias vezes.
  9. Para avaliar a habilidade da transativação da proteína p53, verific o phenotype cor-baseado de colônias do fermento e compare o phenotype da proteína p53 com respeito ao selvagem-tipo p53 e aos phenotypes vazios do vetor.

3. avaliação da capacidade de transativação da proteína p53 utilizando a luminescência quantitativa baseada no ensaio de levedura LUC1

  1. Transforme células de levedura com vetores de expressão p53 (ou controle) (tabela 4) usando o método baseado em Liac descrito no protocolo 2. Use a estirpe de yLFM-RE (tabela 1).
  2. Remende únicos transformantes em uma placa seletiva nova com a quantidade elevada de adenina que contem a glicose como a fonte do carbono e deixe-as crescer em 30 ° c durante a noite. Para cada tipo de transformação, faça 5-7 patches diferentes.
  3. Após o crescimento durante a noite, ressuscitem uma pequena quantidade de células de levedura usando uma ponta de palito ou pipeta estéril da placa em meio seletivo sintético contendo dextrose ou rafinose como a fonte de carbono (200 μL de volume final em uma placa de poço transparente 96, com uma rodada ou fundo plano). Se o experimento necessitar de expressão p53 induzível, acrescente galactose ao meio de rafinose para modular o nível de indução (tabela 2).
    Nota: estas suspensões da pilha devem ter um OD600Nm de aproximadamente 0,4 e não mais altamente do que 1.
  4. Meça a absorvência de cada poço em OD600Nm após a expressão p53 induzível (4-8 h em 30 ° c com agitação de 150-200 rpm) usando um leitor de placa Multilabel. Certifique-se de que as suspensões celulares são homogêneas misturando cada poço com uma pipeta multicanal.
  5. Transferir 10-20 μL de suspensão celular da placa de poço transparente 96 para uma placa branca de 384 (ou 96) e misturar com um volume igual (10-20 μL) de tampão de Lise. Incubar por 10-15 min em RT em uma coqueteleira (150-200 rpm) para atingir a permeabilização da célula ao substrato da luciferase.
  6. Adicionar 10-20 μL de substrato de luciferase de Firefly e medir as unidades de luz (LU) por um leitor de placas com vários rótulos.
  7. Para determinar a capacidade da transativação da proteína p53, normalizar os Lus de cada poço ao OD correspondente600Nm (unidade clara relativa, RLU). Calcule a média de RLU e desvio padrão de 3-4 patches de colônias transformante levedura.
  8. Comparar os dados de transativação da proteína p53 com relação ao tipo selvagem p53 e vetor vazio, subtraindo os valores obtidos com o vetor vazio ou dividindo-se pelos valores obtidos com o vetor vazio (i.e., dobra computacional de indução).
    Nota: a atividade de transativação do p53 também pode ser avaliada usando a mesma set-up experimental na presença de proteínas que interagem com p53 (i.e., MDM2 e MDMX) e/ou incluindo tratamento medicamentoso.

4. avaliação da inibição do crescimento da proteína p53 utilizando o ensaio fenotípico de levedura

  1. Transforme células de levedura com vetores de expressão p53/MDM2/MDMX (ou controle) (tabela 4) usando o método baseado em Liac descrito na seção 2. Use a cepa CG379 (tabela 1) e espalhe os transformantes de levedura em placas seletivas mínimas (tabela 2).
  2. Cresça pilhas transformadas no meio seletivo mínimo (tabela 2) a aproximadamente 1 OD600Nm.
  3. Diluir as células de levedura para 0, 5 OD600Nm no meio de indução seletiva (tabela 2) e, opcionalmente, adicionar uma pequena molécula escolhida à concentração apropriada (ou somente solvente) para testar sua eficácia na reativação do mutante p53 ou na inibição da Mdm2- /MDMX-P53 interações.
  4. Incubar as células a 30 ° c agitação orbital contínua (200 rpm) por aproximadamente 42 h (tempo exigido pela levedura de controle negativo para atingir a fase mid-log, cerca de 0,45 OD600Nm).
  5. Spot 100 μL de alíquotas de culturas de células de levedura em placas seletivas mínimas (tabela 2).
  6. Incubar durante 2 dias a 30 ° c.
  7. Meça o crescimento do fermento contando o número de colônias obtidas nas gotas da cultura 100 μL (unidade de formação de colônia, contagens de CFU). Por exemplo, calcule o efeito de reativação mutante de compostos Considerando o crescimento do tipo selvagem p53 expressando levedura como o efeito máximo possível (definido para 100%), enquanto o crescimento de células que expressam o mutante p53 (mas expostos ao controle de solvente) representa o nível zero de reativação.

Resultados

Construção de ADE2 ou LUC1 cepas de levedura repórter

ODelitto perfettoapproach12,14,15,16 foi adaptado para possibilitar a construção de cepas de levedura de repórter p53 (

Discussão

Os ensaios baseados em leveduras provaram ser úteis para investigar vários aspectos das funções da proteína p53. Esses ensaios são particularmente sensíveis para avaliar o potencial de transativação do p53 em relação a variantes de sítios alvo de RE, incluindo a avaliação de polimorfismos funcionais. O uso de repórteres de cor, bem como a miniaturização do resultado do ensaio luciferase em ensaios de custo-benefício e relativamente escalável. Além disso, o teste de inibição do crescimento é potenci...

Divulgações

Os autores não declaram conflito de interesses.

Agradecimentos

Agradecemos à União Europeia (FEDER funds POCI/01/0145/FEDER/007728 através do programa operacional factores de competitividade-competir) e fundos nacionais (FCT/MEC, Fundação para a ciência e tecnologia e Ministério da educação e ciência) a Acordo de parceria PT2020 UID/QUI/50006/2019 e os projetos (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014-POCI-01-0145-FEDER-016581. Bolsas FCT: SFRH/BD/96189/2013 (S. Gomes). Este trabalho foi apoiado pela Compagnia S. Paolo, Turim, Itália (projeto 2017, 526) e Ministério da saúde, (projeto 5X1000, 2015 e 2016; pesquisa atual 2016). Agradecemos profundamente ao Dr. Teresa López-Arias Montenegro (Universidade de Trento, laboratórios de ensino de ciências experimentais) para assistência com gravação de vídeo.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
L-Aspartic acidSIGMA11189
QIAquick PCR Purification KitQIAGEN28104
L-PhenylalanineSIGMA78019
PeptoneBD Bacto211677
Yeast ex+A2:C26tractBD Bacto212750
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium SulfateBDTM233520
Lithium Acetate DihydrateSIGMA517992
Bacteriological Agar Type ABiokar DiagnosticsA1010 HA
G418 disulfate saltSIGMAA1720
Ammonium SulfateSIGMAA2939
L-Arginine Monohydro-chlorideSIGMAA5131
Adenine Hemisulfate SaltSIGMAA9126
Passive Lysis Buffer 5xPROMEGAE1941
Bright-Glo Luciferase Assay System PROMEGAE2620
5-FOAZymo ResearchF9001
D-(+)-GalactoseSIGMAG0750
L-Glutamic acidSIGMAG1251
Dextrose SIGMAG7021
L-HistidineSIGMAH8125
L-IsoleucineSIGMAI2752
L-LysineSIGMAL1262
L-LeucineSIGMAL8000
L-MethionineSIGMAM2893
PEGSIGMAP3640
D-(+)-Raffinose PentahydrateSIGMAR0250
L-SerineSIGMAS4500
L-TryptophanSIGMAT0271
L-ThreonineSIGMAT8625
UracilSIGMAU0750
L-ValineSIGMAV0500

Referências

  1. Spitz, F., Furlong, E. E. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nature Reviews Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).
  2. Pan, Y., Tsai, C. J., Ma, B., Nussinov, R. Mechanisms of transcription factor selectivity. Trends in Genetics. 26 (2), 75-83 (2010).
  3. Das, M. K., Dai, H. K. A survey of DNA motif finding algorithms. BMC Bioinformatics. 8 Suppl 7, S21 (2007).
  4. Sebastian, A., Contreras-Moreira, B. The twilight zone of cis element alignments. Nucleic Acids Resesarch. 41 (3), 1438-1449 (2013).
  5. Iggo, R., et al. Validation of a yeast functional assay for p53 mutations using clonal sequencing. Journal of Pathology. 231 (4), 441-448 (2013).
  6. Kaeberlein, M., Burtner, C. R., Kennedy, B. K. Recent developments in yeast aging. PLoS Genetics. 3 (5), e84 (2007).
  7. Scharer, E., Iggo, R. Mammalian p53 can function as a transcription factor in yeast. Nucleic Acids Research. 20 (7), 1539-1545 (1992).
  8. Kennedy, B. K. Mammalian transcription factors in yeast: strangers in a familiar land. Nature Reviews Molecular Cellular Biology. 3 (1), 41-49 (2002).
  9. Belli, G., Gari, E., Piedrafita, L., Aldea, M., Herrero, E. An activator/repressor dual system allows tight tetracycline-regulated gene expression in budding yeast. Nucleic Acids Research. 26 (4), 942-947 (1998).
  10. Mumberg, D., Muller, R., Funk, M. Regulatable promoters of Saccharomyces cerevisiae: comparison of transcriptional activity and their use for heterologous expression. Nucleic Acids Research. 22 (25), 5767-5768 (1994).
  11. Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).
  12. Inga, A., Storici, F., Darden, T. A., Resnick, M. A. Differential transactivation by the p53 transcription factor is highly dependent on p53 level and promoter target sequence. Molelcular and Cellular Biology. 22 (24), 8612-8625 (2002).
  13. Resnick, M. A., Inga, A. Functional mutants of the sequence-specific transcription factor p53 and implications for master genes of diversity. Proceeding of the National Academy of Science USA. 100 (17), 9934-9939 (2003).
  14. Tomso, D. J., et al. Functionally distinct polymorphic sequences in the human genome that are targets for p53 transactivation. Proceeding of the National Academy of Science USA. 102 (18), 6431-6436 (2005).
  15. Storici, F., Lewis, L. K., Resnick, M. A. In vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides. Nature Biotechnology. 19 (8), 773-776 (2001).
  16. Storici, F., Resnick, M. A. The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast. Methods in Enzymology. 409, 329-345 (2006).
  17. Campomenosi, P., et al. p53 mutants can often transactivate promoters containing a p21 but not Bax or PIG3 responsive elements. Oncogene. 20 (27), 3573-3579 (2001).
  18. Flaman, J. M., et al. A simple p53 functional assay for screening cell lines, blood, and tumors. Proceedings of the National Academy of Science USA. 92 (9), 3963-3967 (1995).
  19. Kovvali, G. K., Mehta, B., Epstein, C. B., Lutzker, S. G. Identification of partial loss of function p53 gene mutations utilizing a yeast-based functional assay. Nucleic Acids Research. 29 (5), E28 (2001).
  20. Shimada, A., et al. The transcriptional activities of p53 and its homologue p51/p63: similarities and differences. Cancer Research. 59 (12), 2781-2786 (1999).
  21. Sunahara, M., et al. Mutational analysis of p51A/TAp63gamma, a p53 homolog, in non-small cell lung cancer and breast. Oncogene. 18 (25), 3761-3765 (1999).
  22. Andreotti, V., et al. p53 transactivation and the impact of mutations, cofactors and small molecules using a simplified yeast-based screening system. PLoS ONE. 6 (6), e20643 (2011).
  23. Hekmat-Scafe, D. S., et al. Using yeast to determine the functional consequences of mutations in the human p53 tumor suppressor gene: An introductory course-based undergraduate research experience in molecular and cell biology. Biochemistry Molecular Biology Educaction. 45 (2), 161-178 (2017).
  24. Kato, S., et al. Understanding the function-structure and function-mutation relationships of p53 tumor suppressor protein by high-resolution missense mutation analysis. Proceedings of the National Academy of Science USA. 100 (14), 8424-8429 (2003).
  25. Monti, P., et al. Transcriptional functionality of germ line p53 mutants influences cancer phenotype. Clinical Cancer Research. 13 (13), 3789-3795 (2007).
  26. Monti, P., et al. Dominant-negative features of mutant TP53 in germline carriers have limited impact on cancer outcomes. Molecular Cancer Research. 9 (3), 271-279 (2011).
  27. Leroy, B., et al. The TP53 website: an integrative resource centre for the TP53 mutation database and TP53 mutant analysis. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D962-D969 (2013).
  28. Nigro, J. M., Sikorski, R., Reed, S. I., Vogelstein, B. Human p53 and CDC2Hs genes combine to inhibit the proliferation of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 1357-1365 (1992).
  29. Bureik, M., Jungbluth, A., Drescher, R., Wagner, P. Human p53 restores DNA synthesis control in fission yeast. Biological Chemistry. 378 (11), 1361-1371 (1997).
  30. Leao, M., et al. Alpha-mangostin and gambogic acid as potential inhibitors of the p53-MDM2 interaction revealed by a yeast approach. Journal of Natural Products. 76 (4), 774-778 (2013).
  31. Hadj Amor, I. Y., et al. Human p53 induces cell death and downregulates thioredoxin expression in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Research. 8 (8), 1254-1262 (2008).
  32. Leao, M., et al. Novel simplified yeast-based assays of regulators of p53-MDMX interaction and p53 transcriptional activity. FEBS J. 280 (24), 6498-6507 (2013).
  33. Di Ventura, B., Funaya, C., Antony, C., Knop, M., Serrano, L. Reconstitution of Mdm2-dependent post-translational modifications of p53 in yeast. PLoS ONE. 3 (1), e1507 (2008).
  34. Leao, M., et al. Discovery of a new small-molecule inhibitor of p53-MDM2 interaction using a yeast-based approach. Biochemichal Pharmacology. 85 (9), 1234-1245 (2013).
  35. Billant, O., Blondel, M., Voisset, C. p53, p63 and p73 in the wonderland of S. cerevisiae. Oncotarget. 8 (34), 57855-57869 (2017).
  36. Cho, Y., Gorina, S., Jeffrey, P. D., Pavletich, N. P. Crystal structure of a p53 tumor suppressor-DNA complex: understanding tumorigenic mutations. Science. 265 (5170), 346-355 (1994).
  37. Muller, P. A., Vousden, K. H., Norman, J. C. p53 and its mutants in tumor cell migration and invasion. Journal of Cellular Biology. 192 (2), 209-218 (2011).
  38. Oren, M., Rotter, V. Mutant p53 gain-of-function in cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), a001107 (2010).
  39. Walerych, D., Napoli, M., Collavin, L., Del Sal, G. The rebel angel: mutant p53 as the driving oncogene in breast cancer. Carcinogenesis. 33 (11), 2007-2017 (2012).
  40. Ciribilli, Y., et al. The coordinated p53 and estrogen receptor cis-regulation at an FLT1 promoter SNP is specific to genotoxic stress and estrogenic compound. PLoS ONE. 5 (4), e10236 (2010).
  41. Menendez, D., Inga, A., Resnick, M. A. Potentiating the p53 network. Discovery Medicine. 10 (50), 94-100 (2010).
  42. Monti, P., et al. Characterization of the p53 mutants ability to inhibit p73 beta transactivation using a yeast-based functional assay. Oncogene. 22 (34), 5252-5260 (2003).
  43. Monti, P., et al. Tumour p53 mutations exhibit promoter selective dominance over wild-type p53. Oncogene. 21 (11), 1641-1648 (2002).
  44. Shiraishi, K., et al. Isolation of temperature-sensitive p53 mutations from a comprehensive missense mutation library. Journal of Biological Chemistry. 279 (1), 348-355 (2004).
  45. Soussi, T. TP53 mutations in human cancer: database reassessment and prospects for the next decade. Advances in Cancer Research. 110, 107-139 (2011).
  46. Malkin, D. Li-Fraumeni Syndrome. Genes and Cancer. 2, 474-484 (2001).
  47. el-Deiry, W. S., Kern, S. E., Pietenpol, J. A., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Definition of a consensus binding site for p53. Nature Genetics. 1 (1), 45-49 (1992).
  48. Menendez, D., Inga, A., Resnick, M. A. The expanding universe of p53 targets. Nature Reviews in Cancer. 9, 724-737 (2009).
  49. Ciribilli, Y., et al. Transactivation specificity is conserved among p53 family proteins and depends on a response element sequence code. Nucleic Acids Research. 41 (18), 8637-8653 (2013).
  50. Smeenk, L., et al. Characterization of genome-wide p53-binding sites upon stress response. Nucleic Acids Research. 36, 3639-3654 (2008).
  51. Vyas, P., et al. Diverse p53/DNA binding modes expand the repertoire of p53 response elements. Proceeding of the National Academy of Science USA. 114 (40), 10624-10629 (2017).
  52. Tebaldi, T., et al. Whole-genome cartography of p53 response elements ranked on transactivation potential. BMC Genomics. 16, 464 (2015).
  53. Wang, T., et al. Species-specific endogenous retroviruses shape the transcriptional network of the human tumor suppressor protein p53. Proceedings of the National Academy of Science USA. 104, 18613-18618 (2007).
  54. Bond, G. L., et al. A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans. Cell. 119 (5), 591-602 (2004).
  55. Zeron-Medina, J., et al. A polymorphic p53 response element in KIT ligand influences cancer risk and has undergone natural selection. Cell. 155 (2), 410-422 (2013).
  56. Lion, M., et al. Evolution of p53 transactivation specificity through the lens of a yeast-based functional assay. PLoS ONE. 10 (2), e0116177 (2015).
  57. Schumacher, B., et al. C. elegans ced-13 can promote apoptosis and is induced in response to DNA damage. Cell Death and Differentiation. 12 (2), 153-161 (2005).
  58. Jordan, J. J., et al. Low-level p53 expression changes transactivation rules and reveals superactivating sequences. Proceeding of the National Academy of Science USA. 109 (36), 14387-14392 (2012).
  59. Soares, J., et al. Oxazoloisoindolinones with in vitro antitumor activity selectively activate a p53-pathway through potential inhibition of the p53-MDM2 interaction. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 66, 138-147 (2015).
  60. Leao, M., et al. Enhanced cytotoxicity of prenylated chalcone against tumour cells via disruption of the p53-MDM2 interaction. Life Sciences. 142, 60-65 (2015).
  61. Soares, J., et al. A tryptophanol-derived oxazolopiperidone lactam is cytotoxic against tumors via inhibition of p53 interaction with murine double minute proteins. Pharmacol Research. 95-96, 42-52 (2015).
  62. Soares, J., et al. DIMP53-1: a novel small-molecule dual inhibitor of p53-MDM2/X interactions with multifunctional p53-dependent anticancer properties. Molecular Oncology. 11 (6), 612-627 (2017).
  63. Soares, J., et al. Reactivation of wild-type and mutant p53 by tryptophanolderived oxazoloisoindolinone SLMP53-1, a novel anticancer small-molecule. Oncotarget. 7 (4), 4326-4343 (2016).
  64. Sharma, V., Monti, P., Fronza, G., Inga, A. Human transcription factors in yeast: the fruitful examples of P53 and NF-small ka, CyrillicB. FEMS Yeast Research. 16 (7), (2016).
  65. Stepanov, A., Nitiss, K. C., Neale, G., Nitiss, J. L. Enhancing drug accumulation in Saccharomyces cerevisiae by repression of pleiotropic drug resistance genes with chimeric transcription repressors. Molecular Pharmacology. 74 (2), 423-431 (2008).
  66. Sharma, V., et al. Quantitative Analysis of NF-kappaB Transactivation Specificity Using a Yeast-Based Functional Assay. PLoS ONE. 10 (7), e0130170 (2015).
  67. Epinat, J. C., et al. Reconstitution of the NF-kappa B system in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 13 (7), 599-612 (1997).
  68. Inga, A., Reamon-Buettner, S. M., Borlak, J., Resnick, M. A. Functional dissection of sequence-specific NKX2-5 DNA binding domain mutations associated with human heart septation defects using a yeast-based system. Human Molecular Genetics. 14 (14), 1965-1975 (2005).
  69. Reamon-Buettner, S. M., Ciribilli, Y., Inga, A., Borlak, J. A loss-of-function mutation in the binding domain of HAND1 predicts hypoplasia of the human hearts. Human Molecular Genetics. 17 (10), 1397-1405 (2008).
  70. Balmelli-Gallacchi, P., et al. A yeast-based bioassay for the determination of functional and non-functional estrogen receptors. Nucleic Acids Research. 27 (8), 1875-1881 (1999).

Reimpressões e Permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE

Solicitar Permissão

Explore Mais Artigos

Pesquisa do cancroedi o 150p53fermentoelemento da respostaensaio funcionaltranscri oinibi o do crescimento

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Entre em contato

recomende à biblioteca

Newsletter

Pesquisa

Educação

Autores

Bibliotecários

SOBRE A JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados