АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Представлены здесь четыре протокола для создания и эксплуатации дрожжей Saccharomyces cerevisiae репортер штаммов для изучения человека P53 трансактивации потенциал, последствия его различных связанных с раком мутаций, совместно выраженных взаимодействующих белков, и эффекты конкретных малых молекул.

Аннотация

Вывод о том, что известный белок P53 млекопитающих может выступать в качестве транскрипции фактор (TF) в дрожжах S. cerevisiae позволило для разработки различных функциональных анализов для изучения воздействия 1) связывающий сайт (т.е., элемент ответа (RE) варианты последовательности на P53 трансактивации специфичности или 2) TP53 мутации, совместно выраженные кофакторы, или небольшие молекулы на P53 трансактивации деятельности. Разработаны различные базовые и трансляционные исследовательские приложения. Экспериментально эти подходы используют два основных преимущества модели дрожжей. С одной стороны, простота редактирования генома позволяет быстро строить качественные или количественные системы репортера, используя изогенные штаммы, которые отличаются только на уровне конкретного P53-RE для изучения последовательности-специфическости P53-зависимых трансактивации. С другой стороны, наличие регулируемых систем эктопического выражения P53 позволяет оценивать трансактивацию в широком диапазоне экспрессии белка. Рассмотрены в этом докладе широко используются системы, которые основаны на генах цвет репортера, люциферазе и росте дрожжей, чтобы проиллюстрировать их основные методологические шаги и критически оценить их прогностической силы. Кроме того, крайняя универсальность этих подходов может быть легко использована для изучения различных TFs, включая P63 и P73, которые являются другими членами семейства генов TP53.

Введение

Транскрипция является чрезвычайно сложным процессом, включающим динамическую, пространственную и временную организацию транскрипционных факторов (ТФ) и кофакторов для набора и модуляции РНК-полимераз на хроматиновых регионах в ответ на специфические стимулы1 . Большинство TFs, в том числе человека P53 супрессор опухоли, признают конкретные цис-действующих элементов в виде последовательностей ДНК, называемых ответных элементов (REs), которые состоят из одного (или несколько) уникальных мотивов 6-10 нуклеотидов долго. В рамках этих мотивов, отдельные позиции могут показать различные степени изменчивости2, как правило, суммируется по позиции вес матрицы (PWM) или логотипы3,4.

Дрожжи S. cerevisiae является подходящей модельной системой для изучения различных аспектов человеческих белков через дополнения анализы, эктопические выражения, и функциональные анализы, даже если ортололожный дрожжевой ген не присутствует5, 6 , 7. Из-за эволюционного сохранения базальных компонентов транскрипционной системы8, многие человеческие TFs (когда эктопически выражается в дрожжевых клетках) может модулировать выражение гена репортера, действуя через промоутеров инженерии содержат соответствующие REs. Система транскрипционной модели, представленная здесь для человека P53, характеризуется тремя основными переменными, эффекты которых могут быть модулированы: 1) модальность выражения и тип P53, 2) re последовательность управления P53-зависимой транскрипции, и 3) тип ген репортера(рисунок 1A).

Что касается модальности выражения P53, S. cerevisiae позволяет выбирать индуцируемую, репрессивную или составную промоутеров9,10,11. В частности, индуцированный промоутер GAL1 позволяет базальный (используя раффиноз в качестве источника углерода) или переменной (путем изменения количества галактозы в средствах массовой информации) выражение TF в дрожжах. В самом деле, тонко настраиваемый выражение представляет собой критическое развитие для изучения не только P53 себя, но и другие белки семьи P5312,13.

Что касается типа REs, контролирующего P53-зависимое выражение, S. cerevisiae позволяет строить различные штаммы репортера, обладающие уникальными различиями в RE интереса в ином изогенном фоне. Эта цель достигается с помощью адаптации особенно универсальный подход к редактированию генома, разработанный в S. cerevisiae, называется delitto perfetto12,14,15,16.

Кроме того, различные гены репортеров (т.е. URA3, HIS3 и ADE2) могут быть использованы для качественной и количественной оценки транскрипционной деятельности человека TFs в S. cerevisiae, каждый с конкретными особенностями, которые могут быть адаптированы к экспериментальным потребностям17,18,19,20,21. Выражение этих генов репортера придает uracil, гистидин, и аденина прототрофии, соответственно. Репортер URA3 не позволяет рост клеток в присутствии 5-FOA, а также, и, таким образом, он может быть противопоставить. Система репортеров ADE2 имеет то преимущество, что, помимо выбора питательных веществ, она позволяет идентифицировать дрожжевые клетки, которые выражают дикий тип (т.е. функциональный на экспрессии ADE2) или мутант (т.е.не функциональный на ADE2 ) P53 из колонии цвета.

Например, дрожжевые клетки, выражающие ген ADE2, генерируют белые колонии нормального размера на пластинах, содержащих ограничивающие количества аденина (2,5-5,0 мг/л), в то время как те, которые плохо или не транскрибируют, появляются на той же пластине, что и меньший красный (или розовый) Колонии. Это связано с накоплением промежуточного в аденина биосинтетических пути (т.е. P-рибосиламино-имидазол, который ранее был назван амино-имидазол риботид или AIR), который преобразуется в форме красного пигмента. Качественный цвет на основе ADE2 репортер ген с тех пор был заменен на количественные Светлячок Photinus пиралис (LUC1)12,22. Совсем недавно репортер ADE2 был объединен с репортером лака в простой в оценке, полуколичественный, двойной репортер ассс, который может быть использован для подкласса класса P53 мутантов в соответствии с их остаточным уровнем функциональности 23.

Флуоресцентные репортеры, такие как EGFP (улучшенный зеленый флуоресцентный белок) или DsRed (Discosoma sp. red fluorescent protein), также использовались для количественной оценки трансактивационной активности, связанной со всеми возможными мутациями неправильности в TP53 последовательность кодирования24. Наконец, вероятность объединения настраиваемых промоутеров для экспрессии аллелей P53 с изогенными штаммами дрожжей, отличающимися для гена RE и/или репортера, привела к разработке матрицы данных, которая генерирует уточненную классификацию связанных с раком и зародышевых мутант P53 аллели25,26,27.

Описанные выше подходы используются для измерения транскрипционной активности белка P53. Тем не менее, выражение дикого типа P53 в дрожжах S. cerevisiae28 и Schizosaccharomyces pombe29 может вызвать замедление роста, которое было связано с арестом клеточного цикла28,30 или клеточная смерть31. В обоих случаях ингибирование роста дрожжей вызвано высоким выражением P53 и коррелирует с потенциальной транскрипционной модуляцией эндогенных дрожжевых генов, участвующих в росте клеток. Поддерживая эту гипотезу, потеря функции мутант P53 R273H не вмешиваться в рост дрожжевых клеток, когда выражается на аналогичных уровнях, как дикий тип P5332. И наоборот, выражение в дрожжах токсичного мутанта P53 V122A (известный более высокой транскрипционной активностью по сравнению с диким типом P53) вызвало более сильный тормозной эффект роста, чем дикий тип P5332.

Кроме того, было продемонстрировано, что человек MDM2 был в состоянии ингибировать человека P53 транскрипционной активности в дрожжах, способствуя его убиквиции и последующей деградации33. Соответственно, способность человека MDM2 и MDMX ингибировать P53-индуцированного ингибирования роста дрожжей было продемонстрировано32,34. В дополнительном исследовании, корреляция между P53 транскрипционной активности и уровней экспрессии актина была установлена, с определением предполагаемых P53 RE вверх по течению на гене ACT1 в дрожжах32. Последовательно, экспрессия актина была усилена диким типом P53 и тем более P53 V122A, но не мутантом P53 R273H. И наоборот, экспрессия действия P53 уменьшилась в со-присутствии ингибиторов P53 MDM2, MDMX, или пифитрин-З (маломолекулярный ингибитор транскрипционной активности P53), согласующиеся с результатами, основанными на оценке роста дрожжей. Важно отметить, что эти результаты установили корреляцию между P53-индуцированной ингибирования роста и степень его активности в дрожжах, который также был использован для выявления и изучения малых молекул, модулирующих Функции P5328,34 , 35.

протокол

1. Строительство ADE2 или LUC1 репортер дрожжей штаммов, содержащих конкретные RE (yAFM-RE или yLFM-RE)

  1. Полоса yAFM-ICORE или yLFM-ICORE штамм12,14 (ICORE I, ISce-I эндонуклеаз под GAL1 промоутер; CO - счетчик выбираемый URA3; RE - репортер KanMX4, дающий сопротивление канамицину; Таблица 1) из 15% глицерола, хранящегося при -80 градусах по Цельсию на агарной пластине YPDA(таблица 2). Дайте ему расти в течение 2-3 дней при 30 градусах Цельсия.
  2. Возьмите одну дрожжевую колонию из свежей тарелки (не более 3 недель) и поместите ее в небольшую колбу, содержащую 5 мл YPDA(Таблица 2). Инкубировать при 30 градусах Цельсия на ночь, встряхивая при 150-200 об/мин.
  3. На следующий день, чтобы удалить все следы декстроза, гранулы клетки в течение 2 мин на 3000 х г и отбросить супернатант путем инверсии трубки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все центрифугии в этом протоколе при комнатной температуре (RT).
  4. Приостановите действие клеточной гранулы в 30-50 мл предварительно разогретого СМ (полные носители), содержащего галактозу(таблица 2) и инкубировать 4 ч при 30 градусах Цельсия, встряхивая при 150-200 об/мин (необходимо для индукции I-SceI).
  5. Центрифуги клетки в течение 2 мин на 3000 х г и отбросить супернатант путем инверсии трубки.
  6. Приостановите действие клеточной гранулы в 30-50 мл стерильной воды. Повторите шаг 1.5.
  7. Отдохните ялку гранулы в 10 мл стерильной воды. Повторите шаг 1.5.
  8. Resuspend клеточной гранулы в 5 мл стерильных LiAcTE (Таблица 3), ионный раствор, который способствует поглощению ДНК. Повторите шаг 1.5.
  9. Приостановите действие клеточных гранул в 250 л стерильных LiAcTE и перенесите клетки в трубку 1,5 мл. Повторите шаг 1.5 и resuspend яблочная гранулы в 300-500 Л л стерильного LiAcTE.
  10. Во время стирает, денатурировать раствор 10 мг/мл лосося днк носителя спермы в течение 10 минут при 100 градусов по Цельсию и холод сразу на льду, чтобы сохранить его в качестве одноцепочечной ДНК.
  11. В отдельной трубке 1,5 мл добавьте 500 пикоолев желаемого олигонуклеотида(таблица 3), 5 л от вареного лосося, 300 л стерильной LiAcTE PEG (Таблица3), и 50 зл и суспензию дрожжевой клетки (от шага 1.9).
  12. Вихрь трубки для 10 с, чтобы смешать и инкубировать в течение 30 мин при 30 градусах Цельсия, встряхивая при 150-200 об/мин. Поместите 1,5 мл труб на стороне в пользу встряхивания.
  13. Тепло шокирует дрожжевые клетки в течение 15 мин при температуре 42 градусов по Цельсию в нагревательном блоке, затем центрифуги клетки на 20 с при 10000 х г. Удалите супернатант и resuspend клетки в 1 мл стерильной воды.
  14. Распространение 100 л клеточной подвески на агарной пластине YPDA и инкубировать (вверх ногами) в течение 1 дня при 30 градусах Цельсия. Для обеспечения хорошо разделенных колоний, а также распространение 100 зл 100 л 1:10 разбавления.
  15. На следующий день, реплики пластины с использованием стерильных бархатов на CM агар пластины, содержащие декстрозу и 5-FOA (Таблица 2). Рассмотрим вторую пластину реплики на новой пластине, если многие клетки передаются (т.е. некоторый рост URA3 клеток).
  16. Три дня спустя, реплики пластины на неселективных YPDA и YPDA, содержащий G418 (аминогликозид ный антибиотик похож на канамицин) агар пластины (Таблица 2), маркировка каждой пластины для облегчения их последующего сравнения. Инкубировать тарелки на ночь при 30 градусах Цельсия.
  17. На следующий день, определить кандидата репортер штаммов из колоний, которые G418 чувствительных, но растут на yPDA пластин (например, yLFM- или yAFM-RE колоний). Полоса выявленных колоний (3-6 колоний) на новой пластине YPDA, чтобы получить одну колонию изолятов и пусть они растут в течение 2 дней при 30 градусах Цельсия.
  18. Патч отдельных колоний дрожжей на пластине YPDA, чтобы изолировать колонии для дальнейшего анализа. После 24 ч при 30 градусах Цельсия, проверьте их, воспроизваясь на пластине агара YPGA(Таблица 2), которые предотвращают рост мелких мутантов (т.е. респираторно-дефицитных мутантов). В то же время, реплики пластины на новой пластине Агар YPDA.
  19. Проверьте правильные патчи (т.е. рост на агарных пластинах YPDA и YPGA; 1-3 колонии) со ступени 1.18 на наличие правильной интеграции олигонуклеотидов колонией ПЦР. Соберите реакционную смесь, добавив 5 qL 10x пЦР буфера (1,5 мМ MgCl2), 2 л из 10 пикомолей / Л праймеров (Таблица 3), 4 мЛ 2,5 мМ dNTPs, 0,25 л 5 U / L Taq полимеразы, и воды до окончательного объема 50 л. Умножьте реакционную смесь для количества дрожжевых колоний, которые должны быть проверены и aliquot 50 QL в каждой трубке ПЦР. Используя пипетку, добавьте очень небольшое количество дрожжевых клеток из агаровой пластины YPDA в единую реакционную смесь ПЦР.
  20. Выполните реакцию ПЦР со следующей программой: 94 кв. м в течение 8 мин, а затем 35 циклов денатурации в течение 1 мин при 94 градусах По Цельсию, грунтовки annealing в течение 1 мин при 55 градусах По Цельсию, и расширение в течение 2 мин при 72 градусах По Цельсию.
  21. После того, как реакция завершена, загрузите аликвот реакции ПЦР (около одной десятой объема) на гель агарозы, чтобы проверить правильный размер (500 bp) .
  22. Последовательность пЦР продукт после очистки с коммерческим комплектом, чтобы подтвердить интеграцию желаемой последовательности RE, используя те же грунтовки шаг 1.19.
  23. После проверки правильной последовательности, сделать 15% глицерол запас yAFM-RE или yLFM-RE деформации культуры (в YPDA) и хранить его при -80 градусов по Цельсию.

2. Оценка способности трансактивации белка P53 с использованием качественного анализа дрожжей ADE2 на основе цвета

  1. Повторите шаги 1.1 и 1.2 с помощью штамма yAFM-RE(таблица 1).
  2. На следующий день после, разбавить клеточной культуры (1:10) в 30-50 мл предварительно нагревается YPDA и продолжать инкубировать при 30 градусов по Цельсию, встряхивая до од600nm достигает 0,8-1,0 (2 ч).
  3. Повторите шаги 1.5-1.10.
  4. В отдельной трубке 1,5 мл добавьте 300-500 нг дрожжей P53 (или контроль) вектора экспрессии(Таблица 4), 5 л от вареного лосося, носителя ДНК спермы лосося, 300 л стерильной LiAcTE PEG, и 50 зл ел суспензии дрожжевых клеток.
  5. Повторите шаги 1.12 и 1.13, но resuspend клетки гранулы в 300 злител стерильной воды.
  6. Распространение 100 зл и суспензии клеток на синтетических селективных (для p53 выражения или контрольный вектор) пластин, содержащих декстрозу в качестве источника углерода и большое количество аденина(таблица 2), затем инкубировать (вверх ногами) при 30 градусов по Цельсию в течение 2-3 дней.
  7. Полоса одного дрожжей трансформаторов колоний (2-6 полос на тарелку) на новой селективной пластины и пусть они растут на ночь при 30 градусах Цельсия.
  8. На следующий день после, используя стерильные бархаты реплики пластины на новые селективные пластины, которые позволяют для оценки цвета фенотипа (т.е. пластины, содержащие декстрозу в качестве источника углерода, но ограничение количества аденина ; Таблица 2). Инкубировать тарелки вверх дном при 30 градусах по Цельсию в течение 3 дней. Дополнительно, чтобы оценить температурную чувствительность белка P53, инкубировать при трех различных температурах в течение 3 дней: 24 градуса по Цельсию, 30 градусов по Цельсию и 37 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Одна и та же полоса может быть реплики покрывало несколько раз.
  9. Чтобы оценить способность трансактивации белка P53, проверьте цветной фенотип дрожжевых колоний и сравните фенотип белка P53 по отношению к p53 дикого типа и пустых векторных фенотипов.

3. Оценка способности трансактивации белка P53 с использованием количественного люминесценции на основе LUC1 дрожжей анализ

  1. Преобразуйте дрожжевые клетки с помощью векторов экспрессии P53 (или управления)(Таблица4) с помощью метода, описанного в протоколе 2. Используйте штамм yLFM-RE(таблица 1).
  2. Патч одиночников трансформаторов на новой селективной пластины с большим количеством аденина, содержащего глюкозу в качестве источника углерода, и пусть они растут на 30 градусов по Цельсию в одночасье. Для каждого типа преобразования сделайте 5-7 различных патчей.
  3. После ночного роста, resuspend небольшое количество дрожжевых клеток, используя стерильные зубочистки или пипетки отзыв из пластины в синтетической селективной среде, содержащей декстрозу или раффинозу в качестве источника углерода (200 Л. окончательный объем в прозрачной пластине 96 хорошо, с круглым или плоское дно). Если эксперимент требует индуцируемого выражения P53, добавьте галактозу в раффинозу среды, чтобы модулировать уровень индукции(таблица 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти суспензии клетки должны иметь OD600nm около 0.4 и не выше 1.
  4. Измерьте абсорбцию каждой скважины при ОД600нм после индуцируемого выражения P53 (4-8 ч при 30 градусах Цельсия при 150-200 об/мин) с помощью многофункционального считывателя пластин. Убедитесь, что клеточные суспензии однородны, смешивая каждый колодец с многоканальной пипеткой.
  5. Перенесите 10-20 злиц яточной суспензии из прозрачной пластины 96 скважин в белую 384 (или 96) скважину и смешайте с равным объемом (10-20 л) буфера из лиза. Инкубировать в течение 10-15 мин на RT на шейкере (150-200 об/мин) для достижения пермяки клетки в субстрат люциферазы.
  6. Добавьте 10-20 л субстрата Светлячок люциферазы и измерьте световые единицы (LU) спомощьим пластины с несколькими этикетками.
  7. Чтобы определить способность трансактивации белка P53, нормализуем ЛЮ каждого колодца до соответствующего OD600nm (относительная световая единица, RLU). Рассчитайте средний RLU и стандартное отклонение от 3-4 участков дрожжевых колоний трансформаторов.
  8. Сравните данные трансактивации белка P53 по отношению к дикому типу P53 и пустому вектору, либо путем вычитания значений, полученных с пустым вектором, либо путем деления на значения, полученные с пустым вектором (т.е. вычислительной складкой индукции).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трансактивационная активность P53 может быть также оценена с помощью той же экспериментальной настройки в присутствии взаимодействующих С53 белков (т.е. MDM2 и MDMX) и/или включая медикаментозное лечение.

4. Оценка ингибирования роста белка P53 с использованием фенотипического анализа дрожжей

  1. Преобразуйте дрожжевые клетки с помощью векторов экспрессии P53/MDM2/MDMX (или управления)(таблица4) с помощью метода, описанного в разделе 2. Используйте штамм CG379 (Таблица 1) и распространение дрожжей трансформаторов на минимальных селективных пластин (Таблица2).
  2. Выращивайте преобразованные клетки в минимальной селективной среде(таблица 2) примерно до 1 OD600nm.
  3. Разбавлять дрожжевые клетки до 0,05 OD600nm в селективной индукционной среде(Таблица2), и дополнительно, добавить выбранную небольшую молекулу в соответствующую концентрацию (или только растворитель), чтобы проверить его эффективность в реактивации мутантА P53 или в ингибировании MDM2- /MDMX-P53 взаимодействий.
  4. Инкубировать клетки при 30 градусах Цельсия при непрерывной орбитальной встряхивания (200 об/мин) примерно 42 ч (время, требуемое отрицательными дрожжами управления, достигает средней фазы, около 0,45 OD600nm).
  5. Пятно 100 qL aliquots дрожжевых клеточных культур на минимальных селективных пластин(Таблица 2).
  6. Инкубировать в течение 2 дней при 30 градусах Цельсия.
  7. Измеряйте рост дрожжей, подсчитывая количество колоний, полученных в 100 сбросах культуры (подразделение по формированию колонии, cFU). Например, вычислить эффект реактивации мутантов соединений с учетом роста дикого типа P53, выражающих дрожжи как максимальновозможный эффект (установленный на 100%), в то время как рост клеток, выражающих мутант P53 (но подверженный контролю растворителя) представляет нулевой уровень реактивации.

Результаты

Строительство ADE2 или LUC1 репортер дрожжей штаммов

Delitto perfettoapproach12,14,15,16 был адаптирован для строительства ...

Обсуждение

Дрожжи на основе анализов оказались полезными для изучения различных аспектов функций белка P53. Эти анализы особенно чувствительны для оценки потенциала трансактивации P53 по отношению к вариантам целевых объектов RE, включая оценку функциональных полиморфизмов. Использование цветных ...

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Благодарности

Мы благодарим Европейский союз (FedER средств POCI/01/0145/FEDER/007728 через Programa Operacional Factores de Competitividade - COMPETE) и национальные фонды (FCT/MEC, Funda'o пара Ci'ncia e Tecnologia и Министерио да Эдукао э Ciincia) в соответствии с Соглашение о партнерстве PT2020 UID/Куи/50006/2019 и проекты (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014 - POCI-01-0145-FEDER-016581. Стипендии ФСТ: SFRH/BD/96189/2013 (С. Гомес). Эта работа была поддержана Компанией С. Паоло, Турин, Италия (проект 2017.0526) и Министерством здравоохранения (Проект 5x1000, 2015 и 2016; текущие исследования 2016). Мы глубоко благодарим д-ра Терезу Лопес-Ариас Черногорию (Университет Тренто, учебные лаборатории экспериментальных наук) за помощь в видеозаписи.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
L-Aspartic acidSIGMA11189
QIAquick PCR Purification KitQIAGEN28104
L-PhenylalanineSIGMA78019
PeptoneBD Bacto211677
Yeast ex+A2:C26tractBD Bacto212750
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium SulfateBDTM233520
Lithium Acetate DihydrateSIGMA517992
Bacteriological Agar Type ABiokar DiagnosticsA1010 HA
G418 disulfate saltSIGMAA1720
Ammonium SulfateSIGMAA2939
L-Arginine Monohydro-chlorideSIGMAA5131
Adenine Hemisulfate SaltSIGMAA9126
Passive Lysis Buffer 5xPROMEGAE1941
Bright-Glo Luciferase Assay System PROMEGAE2620
5-FOAZymo ResearchF9001
D-(+)-GalactoseSIGMAG0750
L-Glutamic acidSIGMAG1251
Dextrose SIGMAG7021
L-HistidineSIGMAH8125
L-IsoleucineSIGMAI2752
L-LysineSIGMAL1262
L-LeucineSIGMAL8000
L-MethionineSIGMAM2893
PEGSIGMAP3640
D-(+)-Raffinose PentahydrateSIGMAR0250
L-SerineSIGMAS4500
L-TryptophanSIGMAT0271
L-ThreonineSIGMAT8625
UracilSIGMAU0750
L-ValineSIGMAV0500

Ссылки

  1. Spitz, F., Furlong, E. E. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nature Reviews Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).
  2. Pan, Y., Tsai, C. J., Ma, B., Nussinov, R. Mechanisms of transcription factor selectivity. Trends in Genetics. 26 (2), 75-83 (2010).
  3. Das, M. K., Dai, H. K. A survey of DNA motif finding algorithms. BMC Bioinformatics. 8 Suppl 7, S21 (2007).
  4. Sebastian, A., Contreras-Moreira, B. The twilight zone of cis element alignments. Nucleic Acids Resesarch. 41 (3), 1438-1449 (2013).
  5. Iggo, R., et al. Validation of a yeast functional assay for p53 mutations using clonal sequencing. Journal of Pathology. 231 (4), 441-448 (2013).
  6. Kaeberlein, M., Burtner, C. R., Kennedy, B. K. Recent developments in yeast aging. PLoS Genetics. 3 (5), e84 (2007).
  7. Scharer, E., Iggo, R. Mammalian p53 can function as a transcription factor in yeast. Nucleic Acids Research. 20 (7), 1539-1545 (1992).
  8. Kennedy, B. K. Mammalian transcription factors in yeast: strangers in a familiar land. Nature Reviews Molecular Cellular Biology. 3 (1), 41-49 (2002).
  9. Belli, G., Gari, E., Piedrafita, L., Aldea, M., Herrero, E. An activator/repressor dual system allows tight tetracycline-regulated gene expression in budding yeast. Nucleic Acids Research. 26 (4), 942-947 (1998).
  10. Mumberg, D., Muller, R., Funk, M. Regulatable promoters of Saccharomyces cerevisiae: comparison of transcriptional activity and their use for heterologous expression. Nucleic Acids Research. 22 (25), 5767-5768 (1994).
  11. Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).
  12. Inga, A., Storici, F., Darden, T. A., Resnick, M. A. Differential transactivation by the p53 transcription factor is highly dependent on p53 level and promoter target sequence. Molelcular and Cellular Biology. 22 (24), 8612-8625 (2002).
  13. Resnick, M. A., Inga, A. Functional mutants of the sequence-specific transcription factor p53 and implications for master genes of diversity. Proceeding of the National Academy of Science USA. 100 (17), 9934-9939 (2003).
  14. Tomso, D. J., et al. Functionally distinct polymorphic sequences in the human genome that are targets for p53 transactivation. Proceeding of the National Academy of Science USA. 102 (18), 6431-6436 (2005).
  15. Storici, F., Lewis, L. K., Resnick, M. A. In vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides. Nature Biotechnology. 19 (8), 773-776 (2001).
  16. Storici, F., Resnick, M. A. The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast. Methods in Enzymology. 409, 329-345 (2006).
  17. Campomenosi, P., et al. p53 mutants can often transactivate promoters containing a p21 but not Bax or PIG3 responsive elements. Oncogene. 20 (27), 3573-3579 (2001).
  18. Flaman, J. M., et al. A simple p53 functional assay for screening cell lines, blood, and tumors. Proceedings of the National Academy of Science USA. 92 (9), 3963-3967 (1995).
  19. Kovvali, G. K., Mehta, B., Epstein, C. B., Lutzker, S. G. Identification of partial loss of function p53 gene mutations utilizing a yeast-based functional assay. Nucleic Acids Research. 29 (5), E28 (2001).
  20. Shimada, A., et al. The transcriptional activities of p53 and its homologue p51/p63: similarities and differences. Cancer Research. 59 (12), 2781-2786 (1999).
  21. Sunahara, M., et al. Mutational analysis of p51A/TAp63gamma, a p53 homolog, in non-small cell lung cancer and breast. Oncogene. 18 (25), 3761-3765 (1999).
  22. Andreotti, V., et al. p53 transactivation and the impact of mutations, cofactors and small molecules using a simplified yeast-based screening system. PLoS ONE. 6 (6), e20643 (2011).
  23. Hekmat-Scafe, D. S., et al. Using yeast to determine the functional consequences of mutations in the human p53 tumor suppressor gene: An introductory course-based undergraduate research experience in molecular and cell biology. Biochemistry Molecular Biology Educaction. 45 (2), 161-178 (2017).
  24. Kato, S., et al. Understanding the function-structure and function-mutation relationships of p53 tumor suppressor protein by high-resolution missense mutation analysis. Proceedings of the National Academy of Science USA. 100 (14), 8424-8429 (2003).
  25. Monti, P., et al. Transcriptional functionality of germ line p53 mutants influences cancer phenotype. Clinical Cancer Research. 13 (13), 3789-3795 (2007).
  26. Monti, P., et al. Dominant-negative features of mutant TP53 in germline carriers have limited impact on cancer outcomes. Molecular Cancer Research. 9 (3), 271-279 (2011).
  27. Leroy, B., et al. The TP53 website: an integrative resource centre for the TP53 mutation database and TP53 mutant analysis. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D962-D969 (2013).
  28. Nigro, J. M., Sikorski, R., Reed, S. I., Vogelstein, B. Human p53 and CDC2Hs genes combine to inhibit the proliferation of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 1357-1365 (1992).
  29. Bureik, M., Jungbluth, A., Drescher, R., Wagner, P. Human p53 restores DNA synthesis control in fission yeast. Biological Chemistry. 378 (11), 1361-1371 (1997).
  30. Leao, M., et al. Alpha-mangostin and gambogic acid as potential inhibitors of the p53-MDM2 interaction revealed by a yeast approach. Journal of Natural Products. 76 (4), 774-778 (2013).
  31. Hadj Amor, I. Y., et al. Human p53 induces cell death and downregulates thioredoxin expression in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Research. 8 (8), 1254-1262 (2008).
  32. Leao, M., et al. Novel simplified yeast-based assays of regulators of p53-MDMX interaction and p53 transcriptional activity. FEBS J. 280 (24), 6498-6507 (2013).
  33. Di Ventura, B., Funaya, C., Antony, C., Knop, M., Serrano, L. Reconstitution of Mdm2-dependent post-translational modifications of p53 in yeast. PLoS ONE. 3 (1), e1507 (2008).
  34. Leao, M., et al. Discovery of a new small-molecule inhibitor of p53-MDM2 interaction using a yeast-based approach. Biochemichal Pharmacology. 85 (9), 1234-1245 (2013).
  35. Billant, O., Blondel, M., Voisset, C. p53, p63 and p73 in the wonderland of S. cerevisiae. Oncotarget. 8 (34), 57855-57869 (2017).
  36. Cho, Y., Gorina, S., Jeffrey, P. D., Pavletich, N. P. Crystal structure of a p53 tumor suppressor-DNA complex: understanding tumorigenic mutations. Science. 265 (5170), 346-355 (1994).
  37. Muller, P. A., Vousden, K. H., Norman, J. C. p53 and its mutants in tumor cell migration and invasion. Journal of Cellular Biology. 192 (2), 209-218 (2011).
  38. Oren, M., Rotter, V. Mutant p53 gain-of-function in cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), a001107 (2010).
  39. Walerych, D., Napoli, M., Collavin, L., Del Sal, G. The rebel angel: mutant p53 as the driving oncogene in breast cancer. Carcinogenesis. 33 (11), 2007-2017 (2012).
  40. Ciribilli, Y., et al. The coordinated p53 and estrogen receptor cis-regulation at an FLT1 promoter SNP is specific to genotoxic stress and estrogenic compound. PLoS ONE. 5 (4), e10236 (2010).
  41. Menendez, D., Inga, A., Resnick, M. A. Potentiating the p53 network. Discovery Medicine. 10 (50), 94-100 (2010).
  42. Monti, P., et al. Characterization of the p53 mutants ability to inhibit p73 beta transactivation using a yeast-based functional assay. Oncogene. 22 (34), 5252-5260 (2003).
  43. Monti, P., et al. Tumour p53 mutations exhibit promoter selective dominance over wild-type p53. Oncogene. 21 (11), 1641-1648 (2002).
  44. Shiraishi, K., et al. Isolation of temperature-sensitive p53 mutations from a comprehensive missense mutation library. Journal of Biological Chemistry. 279 (1), 348-355 (2004).
  45. Soussi, T. TP53 mutations in human cancer: database reassessment and prospects for the next decade. Advances in Cancer Research. 110, 107-139 (2011).
  46. Malkin, D. Li-Fraumeni Syndrome. Genes and Cancer. 2, 474-484 (2001).
  47. el-Deiry, W. S., Kern, S. E., Pietenpol, J. A., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Definition of a consensus binding site for p53. Nature Genetics. 1 (1), 45-49 (1992).
  48. Menendez, D., Inga, A., Resnick, M. A. The expanding universe of p53 targets. Nature Reviews in Cancer. 9, 724-737 (2009).
  49. Ciribilli, Y., et al. Transactivation specificity is conserved among p53 family proteins and depends on a response element sequence code. Nucleic Acids Research. 41 (18), 8637-8653 (2013).
  50. Smeenk, L., et al. Characterization of genome-wide p53-binding sites upon stress response. Nucleic Acids Research. 36, 3639-3654 (2008).
  51. Vyas, P., et al. Diverse p53/DNA binding modes expand the repertoire of p53 response elements. Proceeding of the National Academy of Science USA. 114 (40), 10624-10629 (2017).
  52. Tebaldi, T., et al. Whole-genome cartography of p53 response elements ranked on transactivation potential. BMC Genomics. 16, 464 (2015).
  53. Wang, T., et al. Species-specific endogenous retroviruses shape the transcriptional network of the human tumor suppressor protein p53. Proceedings of the National Academy of Science USA. 104, 18613-18618 (2007).
  54. Bond, G. L., et al. A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans. Cell. 119 (5), 591-602 (2004).
  55. Zeron-Medina, J., et al. A polymorphic p53 response element in KIT ligand influences cancer risk and has undergone natural selection. Cell. 155 (2), 410-422 (2013).
  56. Lion, M., et al. Evolution of p53 transactivation specificity through the lens of a yeast-based functional assay. PLoS ONE. 10 (2), e0116177 (2015).
  57. Schumacher, B., et al. C. elegans ced-13 can promote apoptosis and is induced in response to DNA damage. Cell Death and Differentiation. 12 (2), 153-161 (2005).
  58. Jordan, J. J., et al. Low-level p53 expression changes transactivation rules and reveals superactivating sequences. Proceeding of the National Academy of Science USA. 109 (36), 14387-14392 (2012).
  59. Soares, J., et al. Oxazoloisoindolinones with in vitro antitumor activity selectively activate a p53-pathway through potential inhibition of the p53-MDM2 interaction. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 66, 138-147 (2015).
  60. Leao, M., et al. Enhanced cytotoxicity of prenylated chalcone against tumour cells via disruption of the p53-MDM2 interaction. Life Sciences. 142, 60-65 (2015).
  61. Soares, J., et al. A tryptophanol-derived oxazolopiperidone lactam is cytotoxic against tumors via inhibition of p53 interaction with murine double minute proteins. Pharmacol Research. 95-96, 42-52 (2015).
  62. Soares, J., et al. DIMP53-1: a novel small-molecule dual inhibitor of p53-MDM2/X interactions with multifunctional p53-dependent anticancer properties. Molecular Oncology. 11 (6), 612-627 (2017).
  63. Soares, J., et al. Reactivation of wild-type and mutant p53 by tryptophanolderived oxazoloisoindolinone SLMP53-1, a novel anticancer small-molecule. Oncotarget. 7 (4), 4326-4343 (2016).
  64. Sharma, V., Monti, P., Fronza, G., Inga, A. Human transcription factors in yeast: the fruitful examples of P53 and NF-small ka, CyrillicB. FEMS Yeast Research. 16 (7), (2016).
  65. Stepanov, A., Nitiss, K. C., Neale, G., Nitiss, J. L. Enhancing drug accumulation in Saccharomyces cerevisiae by repression of pleiotropic drug resistance genes with chimeric transcription repressors. Molecular Pharmacology. 74 (2), 423-431 (2008).
  66. Sharma, V., et al. Quantitative Analysis of NF-kappaB Transactivation Specificity Using a Yeast-Based Functional Assay. PLoS ONE. 10 (7), e0130170 (2015).
  67. Epinat, J. C., et al. Reconstitution of the NF-kappa B system in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 13 (7), 599-612 (1997).
  68. Inga, A., Reamon-Buettner, S. M., Borlak, J., Resnick, M. A. Functional dissection of sequence-specific NKX2-5 DNA binding domain mutations associated with human heart septation defects using a yeast-based system. Human Molecular Genetics. 14 (14), 1965-1975 (2005).
  69. Reamon-Buettner, S. M., Ciribilli, Y., Inga, A., Borlak, J. A loss-of-function mutation in the binding domain of HAND1 predicts hypoplasia of the human hearts. Human Molecular Genetics. 17 (10), 1397-1405 (2008).
  70. Balmelli-Gallacchi, P., et al. A yeast-based bioassay for the determination of functional and non-functional estrogen receptors. Nucleic Acids Research. 27 (8), 1875-1881 (1999).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

150P53

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены