인간 P53을 연구하기 위한 기능성 어세이 개발을 위한 섀시로 효모

요약

여기에 제시된 효모 Saccharomyces 세레비시아에 종족을 건설하고 악용하는 네 가지 프로토콜은 인간 P53 의 일시 활성화 잠재력, 다양한 암 관련 돌연변이의 영향, 공동 발현 된 상호 작용 단백질, 및 특정 작은 분자의 효과.

초록

잘 알려진 포유류 P53 단백질이 효모 S. 세레비시아에서 전사 인자(TF)로서 작용할 수 있다는 사실은 1) 결합 부위의 영향을 연구하기 위해 상이한 기능성 검사의 개발을 허용하였다[즉, 반응 요소(RE)] P53 환동성 특이성 또는 2) TP53 돌연변이, 공동 발현 보조 인자, 또는 P53 환활성화 활성에 대한 소분자에 대한 서열 변이체. 다른 기본 및 번역 연구 응용 프로그램이 개발되었습니다. 실험적으로, 이러한 접근법은 효모 모델의 두 가지 주요 장점을 이용한다. 한편으로는, 게놈 편집의 용이성은 P53 의존의 서열 특이성을 조사하기 위하여 특정 P53-RE의 수준에서만 다른 이소제닉 긴장을 이용해서 정성적 또는 정량적인 리포터 시스템의 빠른 건설을 가능하게 합니다 트랜스 활성화. 한편, 이소성 P53 발현에 대한 조절 시스템의 가용성은 광범위한 단백질 발현에서 의 역활성화의 평가를 허용한다. 이 보고서에서 검토된 것은 컬러 리포터 유전자, luciferase 및 효모의 성장을 기반으로 하는 시스템을 광범위하게 사용하여 주요 방법론 단계를 설명하고 예측 능력을 비판적으로 평가합니다. 더욱이, 이러한 접근법의 극단적인 다양성은 TP53 유전자 가족의 다른 구성원인 P63 및 P73을 포함하여 다른 F를 연구하기 위하여 쉽게 이용될 수 있습니다.

서문

전사는 특정 자극에 응하여 염색질 지구에 RNA 중합효소의 모집 그리고 변조를 위한 전사 인자 (TFs) 및 공동 인자의 동적, 공간 및 시간적 조직을 관련시키는 매우 복잡한 프로세스입니다¹ . 인간 P53 종양 억제제를 포함하는 대부분의 TFs는, 단일 (또는 다중) 독특한 모티브로 구성된 응답 요소 (REs)에게 불린 DNA 서열의 형태로 특정 시스 작용 요소를 인식합니다 ~6-10 뉴클레오티드 긴. 이러한 모티브 내에서, 개별 위치는 다양한정도의 가변성 2를 나타낼 수 있으며, 일반적으로 위치 중량 행렬(PWM) 또는 로고^3,4로요약된다.

상기 효모 S. 세레비시아는 정형고효모 유전자가 존재하지 않는 경우에도 보완 성 검사, 자궁외 발현 및 기능성 관찰을 통해 인간 단백질의 다양한 측면을 연구하는 데 적합한 모델 시스템입니다^{5. 6개 , 7.}전사 계통 8의 기저 성분의진화적 보존으로 인해 많은 인간 FFs(효모 세포에서 ectopically 발현시)는 프로모터를 통해 작용하여 리포터 유전자의 발현을 조절할 수 있습니다. 적절한 REs를 포함합니다. 인간 P53에 대해 여기에 제시된 전사 모델 시스템은 그 효과를 변조할 수 있는 세 가지 주요 변수를 특징으로 한다: 1) P53의 발현 및 유형의 양상, 2) P53 의존적 전사를 제어하는 RE 서열, 및 3) 리포터 유전자(그림1A).

P53 발현의 양상에 관하여, S. cerevisiae는 유도성, 억압적, 또는 구성적인프로모터의 선택을 허용한다 9,^10,11. 특히, 유도성 GAL1 프로모터는 효모에서 TF의 기저(라피노스를 탄소원으로 사용) 또는 가변(매체 내의 갈락토의 양을 변화시킴으로써) 발현을 허용한다. 실제로, 미세조정가능한 발현은 P53 자체뿐만 아니라 다른 P53 패밀리 단백질^12,13을연구하기 위한 중요한 발전을 나타낸다.

P53 의존식을 제어하는 R의 유형에 관해서는, S. cerevisiae그렇지 않으면 등소성 배경에 관심의 RE에 독특한 차이를 소유하는 다른 기자 균주의 건설을 할 수 있습니다. 이러한 목표는 델리토 페르페토^{12, 14, 15,16에서}개발된 특히 다재다능한 게놈 편집 접근법의 적응을 이용하여 도달한다.

더욱이, 상이한 리포터 유전자(즉, URA3, HIS3 및 ADE2)는 S. cerevisiae에서인간 FF의 전사 활동을 질적 및 정량적으로 평가하는 데 사용될 수 있으며, 각각 특정 기능을 가지고 있을 수 있습니다. 실험적 필요에맞게 17,^18,19,20,21. 이 리포터 유전자의 발현은 각각 우라실, 히스티딘 및 아데닌 프로토위트로피를 부여합니다. URA3 리포터는 5-FOA가 있는 세포의 성장을 허용하지 않으므로 역선택될 수 있습니다. ADE2 리포터 시스템은 영양 선택 외에도 야생형(즉, ADE2 발현에서 기능적) 또는 돌연변이(즉,ADE2에서 기능적이지 않음)를 발현하는 효모 세포를 식별할 수 있다는 장점이 있습니다. ) 식민지 색상에서 P53.

예를 들어, ADE2 유전자를 발현하는 효모 세포는 아데닌(2.5-5.0 mg/L)을 제한하는 플레이트에 보통 크기의 백색 식민지를 생성하는 반면, 제대로 또는 전사하지 않는 세포는 더 작은 빨간색(또는 분홍색)과 같은 플레이트에 나타납니다. 식민지. 이것은 아데닌 생합성 통로에 있는 중간의 축적 때문입니다 (즉, P-ribosylamino-imidazole, 이전에 는 아미노-이미다졸 리보티드 또는 AIR라고 불렸습니다), 이는 적색 안료를 형성하기 위하여 변환됩니다. 질적 색계 ADE2 리포터 유전자는 이후 양적 반딧불 Photinus pyralis (LUC1)^12,22로대체되었다. 최근에는 ADE2 리포터가 lacZ 리포터와 결합하여 점수가 매편, 반정적, 이중 리포터 분석으로 P53 돌연변이체의 잔류 수준에 ^{따라 하위 분류에 악용될 수 있습니다. 23}.

EGFP (향상된 녹색 형광 단백질) 또는 DsRed (디스코소마 sp. 적색 형광 단백질)와 같은 형광 기자는 또한 가능한 모든 오센스 돌연변이와 관련된 트랜스 활성화 활성의 정량적 평가에 사용되어 왔다. TP53 코딩 시퀀스^24. 마지막으로, RE 및/또는 리포터 유전자에 대해 다른 이소제닉 효모 균주와 P53 알레일 발현을 위한 튜닝 가능한 프로모터를 결합할 수 있는 기회는 암 관련 및 생식선의 정제된 분류를 생성하는 데이터 매트릭스의 발달로 이끌어 냈습니다. 돌연변이 P53 대두^25,26,27.

전술한 접근법은 P53 단백질의 전사 활성을 측정하기 위해 사용된다. 그러나, 효모 S. 세레비시아28 및 척수사카로마이스^{폼베(29)에서} 야생형 P53의 발현은 세포주기 검거^28,30 또는 세포주기와 연관된 성장 지연을 유발할 수 있다. 세포 죽음³¹. 두 경우 모두, 효모 성장 억제는 높은 P53 발현에 의해 유발되고 세포 성장에 관여하는 내인성 효모 유전자의 잠재적인 전사 변조와 상관관계가 있다. 이러한 가설을 뒷받침하는, 기능 상실 돌연변이P53 R273H는 야생형 P53^32와유사한 수준으로 발현될 때 효모 세포 성장을 방해하지 않았다. 반대로, 독성 돌연변이P53 V122A(야생형 P53에 비해 전사 활성이 높은 것으로 공지)의 효모에서발현은 야생형 P53^32보다더 강한 성장 억제 효과를 일으켰다.

부가적으로, 인간 MDM2는 효모에서 인간 P53 전사 활성을 억제할 수 있었고, 그 유비퀴틴화 및 후속 분해를 촉진할 수 있었다는 것을 입증하였다^33. 이에 따라, 인간 MDM2 및 MDMX가 P53-유도 효모 성장억제를 억제하는 능력을 32,^34로입증하였다. 추가 연구에서는, 효모^32에있는 ACT1 유전자에 putative P53 RE 상류의 확인과 함께 P53 전사 활성 및 액틴 발현 수준 사이 상관관계가 확립되었다. 일관되게, 액틴 발현은 P53 V122A에 의해 야생형 P53 및 더욱 강화되었지만, 돌연변이 P53 R273H에 의해서는 아니었다. 반대로, P53에 의한 액틴 발현은 효모 성장 분석법에 기초한 결과와 일치하는 P53 억제제 MDM2, MDMX, 또는 피피테린 α(P53 전사 활성의 소분자 억제제)의 공존존재에서 감소하였다. 중요한 것은, 이러한 결과는 P53 유도 성장 억제와 효모에서의 활성 정도 사이의 상관 관계를 확립했으며, 이는 또한 P53 기능을 변조하는 소분자를 식별하고 연구하기 위해 악용되어 왔다^{28,34 , 35}.

프로토콜

1. 특정 RE를 포함하는 ADE2 또는 LUC1 기자 효모 균주의 건설 (yAFM-RE 또는 yLFM-RE)

1. 줄무늬 yAFM-ICORE 또는 yLFM-ICORE 균주^12,14 (ICORE = I, GAL1 프로모터하에서 의 ISce-I 엔도너렐리스; CO = 카운터 선택 우라3; RE = 카나마이신 저항을 수여하는 KanMX4 리포터; 표1) YPDA 한천 플레이트상에 -80°C에 보관된 15%글리세롤 스톡으로부터(표 2). 30 °C에서 2-3 일 동안 자랍니다.
2. 신선한 접시에서 효모 콜로니 1개를 꺼내 (3주 이상 된 것) YPDA 5 mL을 함유한 작은 플라스크에 놓습니다(표 2). 밤새 30°C에서 배양하고, 150-200 rpm에서 흔들어.
3. 다음 날, 덱스트로스의 모든 흔적을 제거하기 위해, 3,000 x g에서 2 분 동안 세포를 펠렛하고 튜브의 반전으로 상판을 버립니다.
   참고: 실온(RT)에서 이 프로토콜의 모든 원심분리를 수행합니다.
4. 갈락토제(표 2)를 함유하는 30-50 mL의 미리 온난한 CM(complete media)에서 세포 펠릿을 재중단하고 30°C에서 4시간 동안 배양하고 150-200 rpm에서 흔들어 (I-SceI의 유도에 필요함).
5. 3,000 x g에서 2 분 동안 세포를 원심 분리하고 튜브의 반전으로 상판을 버립니다.
6. 30-50 mL의 멸균수에서 세포 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. 1.5단계를 반복합니다.
7. 멸균수 10 mL에서 세포 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. 1.5단계를 반복합니다.
8. DNA 섭취를 선호하는 이온 용액인 멸균LiAcTE(표 3)의 5 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 1.5단계를 반복합니다.
9. 멸균 LiAcTE의 250 μL에 있는 세포 펠릿을 다시 중단하고 1.5 mL 관으로 세포를 전송합니다. 1.5단계를 반복하고 300-500 μL의 멸균 LiAcTE에서 세포 펠릿을 다시 중단한다.
10. 세차하는 동안, 100 °C에서 10 분 동안 연어 정자 DNA 캐리어의 10 mg / mL 용액을 변성시키고 얼음에 즉시 식혀 단일 가닥 DNA로 유지하십시오.
11. 별도의 1.5 mL 튜브에 원하는 올리고뉴클레오티드 500 피코몰을 첨가 (표3),삶은 연어 정자 DNA의 5 μL, 300 μL의 멸균 LiAcTE PEG (표3),및 효모 세포 현탁액의 50 μL (단계 1.9에서).
12. 10s의 튜브를 30°C에서 30분 동안 혼합하고 배양하고, 150-200 rpm에서 흔들어. 1.5 mL 튜브를 옆으로 놓아 흔들림을 선호합니다.
13. 가열 블록에서 42 °C에서 15 분 동안 효모 세포를 가열 한 다음 10,000 xg에서 20 s의 세포를 원심 분리합니다. 상급물을 제거하고 멸균수 1 mL에서 세포를 다시 일시 중단하십시오.
14. YPDA 한천 플레이트에 세포 현탁액의 100 μL을 퍼뜨리고 30°C에서 1일 동안 배양(거꾸로)한다. 잘 분리 된 식민지를 얻으려면 1 :10 희석의 100 μL을 퍼뜨리는 것입니다.
15. 다음날, 덱스트로오스와 5-FOA를 함유한 CM 한천 플레이트에 멸균 벨벳을 사용한 복제판(표 2). 많은 세포가 옮겨지는 경우 새로운 플레이트상에 제2 복제판을 고려한다(즉, URA3 세포의 일부 성장).
16. 3일 후, G418(카나마이신과 유사한 아미노글리코시드 항생제)을 함유하는 비선택적 YPDA 및 YPDA 상에 복제판(표 2)을 표시하여, 그들의 후속 비교를 용이하게 하기 위해 각 플레이트를 표시하였다. 플레이트를 30°C에서 밤새 배양합니다.
17. 다음 날, G418 민감하지만 YPDA 플레이트(예: yLFM- 또는 yAFM-RE 콜로니)에서 성장하는 콜로니로부터 후보 리포터 균주를 식별한다. 확인된 콜로니(3-6 콜로니)를 새로운 YPDA 플레이트상에 연속하여 단일 콜로니 분리를 얻고 30°C에서 2일 동안 자랍니다.
18. 추가 분석을 위해 식민지를 격리하기 위해 YPDA 플레이트에 단일 효모 식민지를 패치하십시오. 30°C에서 24시간 후, 몸집이 작은 돌연변이(즉, 호흡기결핍 돌연변이)의 성장을 방지하는 YPGA 한천 플레이트(표 2)에 복제도금으로 시험한다. 동시에, 새로운 YPDA 한천 접시에 복제 판.
19. 콜로니 PCR에 의한 올바른 올리고뉴클레오티드 통합의 존재에 대해 1.18단계에서 올바른 패치(즉, YPDA 및 YPGA 한천 플레이트의 성장, 1-3콜로니)를 테스트합니다. 10x PCR 버퍼(1.5 mM MgCl_2),2 μL 의 10 피코몰/μL 프라이머(표3),2.5 mM dNTP의 4 μL, 5 U/μL Taq 폴리머라제의 0.25μL, 50 μL의 최종 부피에 물을 추가하여 반응 혼합물을 조립한다. 각 PCR 튜브내로 50 μL의 양치질이 필요한 효모 콜로니의 수에 대한 반응 혼합을 곱한다. 파이펫을 사용하여, YPDA 한천 플레이트에서 아주 적은 양의 효모 세포를 단일 PCR 반응 혼합물에 첨가한다.
20. 다음 프로그램과 함께 PCR 반응을 수행: 94°C 8분 동안 94°C, 94°C에서 1분 동안 35사이클의 변성, 55°C에서 1분 동안 어닐링, 72°C에서 2분 동안 연장.
21. 반응이 완료된 후, 아가로즈 겔에 PCR 반응(부피의 약 1/10)을 적재하여 정확한 크기(~500 bp)를 확인합니다.
22. PCR 생성물을 상용 키트로 정제한 후 동일한 단계 1.19를 사용하여 원하는 RE 서열의 통합을 확인한다.
23. 올바른 서열의 유효성 검사 후, yAFM-RE 또는 yLFM-RE 균주 배양(YPDA)의 15% 글리세롤 스톡을 만들어 -80°C에 저장한다.

2. 질적 색계 ADE2 효모 분석기준을 이용한 P53 단백질 환활성화 능력 평가

1. yAFM-RE 스트레인을 사용하여 1.1 단계및 1.2단계를 반복합니다(표 1).
2. 다음날, 미리 온난한 YPDA의 30-50 mL에서 세포 배양물(1:10)을 희석하고 OD_600nm가 0.8-1.0(~2시간)에 도달할 때까지 흔들어 30°C에서 계속 배양한다.
3. 1.5-1.10 단계를 반복합니다.
4. 별도의 1.5 mL 튜브에 효모 P53 (또는 제어) 발현 벡터 (표4), 삶은 연어 정자 DNA 담체의 5 μL, 멸균 LiAcTE PEG 300 μL, 효모 세포 현탁액 50 μL을 추가합니다.
5. 1.12 단계 와 1.13 단계를 반복하지만 멸균 수의 300 μL에서 세포 펠릿을 다시 중단하십시오.
6. 덱스트로를 함유하는 합성 선택적(P53 발현 또는 대조벡터용) 플레이트상에 100 μL의 세포 현탁액을 탄소 공급원및 고량의 아데닌(표 2)으로 확산한 다음, 2-3일 동안 30°C에서 배양(거꾸로)한다.
7. 새로운 선택적 플레이트에 단일 효모 형질전환 콜로니 (플레이트 당 2-6 줄무늬)를 연속하고 30 °C에서 하룻밤 자라게하십시오.
8. 그 다음 날, 멸균 벨벳 복제판을 사용하여 색 표현형(즉, 덱스트로오스를 탄소원으로 함유하지만 아데닌의 양을 제한하는 플레이트)의 평가를 허용하는 새로운 선택적 플레이트에; 표2). 플레이트를 30°C에서 3일 동안 거꾸로 배양합니다. 선택적으로, P53 단백질의 온도 민감도를 평가하기 위해, 3일 동안 3개의 상이한 온도에서 배양한다: 24°C, 30°C, 및 37°C.
   참고: 동일한 줄무늬를 여러 번 복제할 수 있습니다.
9. P53 단백질 과분활성화 능력을 평가하기 위해 효모 콜로니의 색상 기반 표현형을 확인하고 P53 야생형 및 빈 벡터 표현형에 대하여 P53 단백질 표현형을 비교한다.

3. 정량발광기반 LUC1 효모 분석기를 이용한 P53 단백질 환동성 능력 평가

1. 프로토콜 2에 기재된 LiAc 기반 방법을사용하여 P53(또는 대조군) 발현 벡터(표 4)로 효모 세포를 변형시킨다. yLFM-RE 스트레인을 사용하십시오(표1).
2. 탄소 공급원으로서 포도당을 함유하는 다량의 아데닌을 가진 새로운 선택적 플레이트상에 단일 형질전환제를 패치하고 밤새 30°C에서 성장하게 하였다. 각 변환 유형에 대해 5-7개의 다른 패치를 만듭니다.
3. 하룻밤 성장 후, 탄소 공급원으로서 덱스트로스 또는 라피노스를 함유하는 합성 선택적 배지에서 플레이트로부터 멸균 이쑤시개 또는 피펫 팁을 사용하여 소량의 효모 세포를 재중단(투명한 96웰 플레이트에 최종 부피, 원형으로 또는 평평한 바닥). 실험에 유도가능한 P53 발현이 필요한 경우, 라피노스 배지에 갈락토스를 추가하여 유도수준을 조절한다(표 2).
   참고: 이러한 셀 현탁액은 약 0.4의 OD_600nm를 가져야 하며 1보다 높지 않아야 합니다.
4. 멀티 라벨 플레이트 리더를 사용하여 유도 가능한 P53 발현 후 OD_600nm에서 각 웰의 흡광도를 측정합니다(30°C에서 4-8시간 및 150-200 rpm 흔들림). 셀 현탁액이 각 웰을 멀티채널 파이펫과 혼합하여 균일한지 확인합니다.
5. 투명한 96 웰 플레이트로부터 10-20 μL의 세포 현탁액을 백색 384(또는 96) 웰 플레이트로 옮기고 용해 완충액의 동일한 부피(10-20 μL)와 혼합한다. RT에서 10-15 분 동안 인큐베이션을 셰이커 (150-200 rpm)에 하여 루시퍼라아제 기판에 세포의 투과율을 달성합니다.
6. 반딧불 루시퍼라아제 기판 10-20 μL을 추가하고 다중 라벨 플레이트 리더로 광 단위(LU)를 측정합니다.
7. P53 단백질 환활성화 능력을 결정하기 위해, 각각의 LU를 상응하는 OD_{600nm(상대광} 단위, RLU)로 정규화한다. 효모 변형 식민지의 3-4 패치에서 평균 RLU 및 표준 편차를 계산합니다.
8. P53 야생형 및 빈 벡터에 대하여 P53 단백질 과역 데이터를 비교하거나, 빈 벡터로 얻어진 값을 빼거나 빈 벡터로 얻은 값으로 나누어(즉, 유도의 계산 폴드)로 나눈다.
   참고: P53 환활성화 활성은 또한 P53-상호 작용 단백질(즉, MDM2 및 MDMX) 및/또는 약물 치료를 포함하는 동일한 실험 적 설정을 사용하여 평가될 수 있다.

4. 효모 자형형 분석기준을 이용한 P53 단백질 성장 억제 평가

1. 섹션 2에 기재된 LiAc 기반 방법을 사용하여 P53/MDM2/MDMX(또는 제어) 발현 벡터(표 4)로 효모 세포를 변형시킵니다. CG379 스트레인(표 1)을 사용하고 최소한의 선택플레이트에 효모 형질전환제를 퍼뜨리다(표2).
2. 최소 선택적 배지(표 2)에서 형질전환된 세포를 약 1OD_600nm로성장시킨다.
3. 효모 세포를 선택적 유도 배지에서 0.05 OD_600nm로 희석(표2)및 선택적으로, 선택된 소분자를 적절한 농도(또는 용매만)에 첨가하여 돌연변이 P53을 재활성화하거나 MDM2를 억제하는 데 그 효능을 시험한다. /MDMX-P53 상호 작용.
4. 30°C에서 연속 궤도 흔들림(200 rpm)에서 약 42시간 동안 배양세포(음극 대조 효모가 중간 로그 상에 도달하는 데 필요한 시간, 약 0.45 OD_600nm).
5. 최소 선택플레이트 상에 효모 세포 배양물의 100μL aliquots를 발견한다(표 2).
6. 30 °C에서 2 일 동안 배양하십시오.
7. 100 μL 배양 방울(콜로니 형성 단위, CFU 카운트)에서 얻어진 콜로니의 수를 계수하여 효모 성장을 측정하였다. 예를 들어, 효모를 최대 가능한 효과로 표현하는 야생형 P53의 성장을 고려한 화합물의 돌연변이 재활성화 효과를 계산하는 한편, 돌연변이 P53을 발현하는 세포의 성장(그러나 용매 조절에 노출됨)을 나타낸다. 0 단계의 재활성화를 말합니다.

결과

의 건설 ADE2 또는 LUC1 리포터 효모 균주

델리토 퍼페토접근법^{12,14,15,16은} P53 리포터 효모 균주의 시공을 가능하게 하도록 적응되었다(도

토론

효모 계 분석에 따르면 P53 단백질 기능의 다양한 측면을 조사하는 데 유용하다는 것이 입증되었습니다. 이러한 해학은 기능적 다형성의 평가를 포함하여 RE 표적 부위의 변이체로 P53 환활성화 잠재력을 평가하는 데 특히 민감하다. 색상 리포터의 사용뿐만 아니라 루시퍼라아제 분석의 소형화는 비용 효율적이고 상대적으로 확장 가능한 분석결과를 낳습니다. 또한, 성장 억제 시험은 잠재적으로 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
L-Aspartic acid	SIGMA	11189
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28104
L-Phenylalanine	SIGMA	78019
Peptone	BD Bacto	211677
Yeast ex+A2:C26tract	BD Bacto	212750
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate	BDTM	233520
Lithium Acetate Dihydrate	SIGMA	517992
Bacteriological Agar Type A	Biokar Diagnostics	A1010 HA
G418 disulfate salt	SIGMA	A1720
Ammonium Sulfate	SIGMA	A2939
L-Arginine Monohydro-chloride	SIGMA	A5131
Adenine Hemisulfate Salt	SIGMA	A9126
Passive Lysis Buffer 5x	PROMEGA	E1941
Bright-Glo Luciferase Assay System	PROMEGA	E2620
5-FOA	Zymo Research	F9001
D-(+)-Galactose	SIGMA	G0750
L-Glutamic acid	SIGMA	G1251
Dextrose	SIGMA	G7021
L-Histidine	SIGMA	H8125
L-Isoleucine	SIGMA	I2752
L-Lysine	SIGMA	L1262
L-Leucine	SIGMA	L8000
L-Methionine	SIGMA	M2893
PEG	SIGMA	P3640
D-(+)-Raffinose Pentahydrate	SIGMA	R0250
L-Serine	SIGMA	S4500
L-Tryptophan	SIGMA	T0271
L-Threonine	SIGMA	T8625
Uracil	SIGMA	U0750
L-Valine	SIGMA	V0500