Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הציגו כאן הם ארבעה פרוטוקולים כדי לבנות ולנצל שמרים סכביסים כתבת הכתב כדי לחקור את הפוטנציאל האנושי P53 transactivation הפעלה, השפעות של מוטציות הקשורות לסרטן השונים שלה, שיתוף הביע אינטראקציה חלבונים, ו ההשפעות של מולקולות קטנות ספציפיות.

Abstract

הממצא הידוע P53 חלבון מוכר יכול לשמש כגורם שעתוק (TF) ב -S. cerevisiae ס שמרים הורשו לפיתוח בחני פונקציונלי שונים ללמוד את ההשפעות של 1) מחייב האתר [i.e., אלמנט התגובה (RE)] משתני רצף על P53 הפעלה ספציפיות או 2) TP53 מוטציות, שיתוף מבוטא קופטים, או מולקולות קטנות על פעילות הפעלה P53. יישומי מחקר בסיסיים וטרנסלבותית שונים פותחו. הגישות הללו מנצלות שני יתרונות עיקריים של מודל השמרים. מצד אחד, הקלות של עריכת הגנום מאפשרת בנייה מהירה של מערכות עיתונאי איכותיות או כמותיים על ידי ניצול זנים איזוגניים הנבדלים רק ברמה של P53 מסוימים-RE כדי לחקור את הרצף-ספציפיות של P53 תלוי הפעלה מעבר. מצד שני, הזמינות של מערכות מוסדרים עבור ביטוי חוץ רחמי P53 מאפשר הערכה של הפעלה במגוון רחב של ביטוי חלבון. סקר בדוח זה משמשים באופן נרחב מערכות המבוססות על גנים עיתונאי צבע, לluciferase, ואת הצמיחה של שמרים כדי להמחיש את הצעדים מתודולוגיים העיקריים שלהם כדי להעריך באופן אנוש את כוח החיזוי שלהם. יתר על כן, רב-תכליתיות קיצונית של גישות אלה ניתן לנצל בקלות כדי ללמוד TFs שונים כולל P63 ו P73, שהם חברים אחרים של TP53 משפחת גנים.

Introduction

תמלול הוא תהליך מורכב מאוד הכרוך בפעילות דינמית, מרחבית וטמפורלית של גורמי שעתוק (TFs) וקופנים לגיוס ואפנון של RNA פולימות על אזורי כרומטין בתגובה לגירויים ספציפיים1 . רוב TFs, כולל מדכא הגידול האנושי P53, לזהות רכיבים ספציפיים משחק ציס בצורה של רצפי DNA הנקרא רכיבי תגובה (REs), אשר מורכב של יחיד (או מספר) מוטיבים ייחודיים ~ 6-10 נוקלאוטידים ארוך. בתוך מוטיבים אלה, עמדות בודדות עשויות להראות דרגות שונות של השונות2, מסוכמים בדרך כלל על ידי מטריצות משקל מיקום (pwm) או לוגו3,4.

שמרים S. cerevisiae ס היא מערכת המודל המתאים ללמוד היבטים שונים של חלבונים אנושיים דרך compleמנטציה, ביטוי חוץ רחמי, ומוסר פונקציונלי, גם כאשר גן שמרים אורתוולוגי אינו נוכח5, מיכל בן 6 , 7. בשל השימור האבולוציוני של רכיבי בסיס של מערכת הטרנססקריפט8, מספר רב של מערכות האדם (כאשר הביעו הבעה בתאי שמרים) יכולים לווסת את הביטוי של גן עיתונאי על ידי משחק באמצעות יזמים שעברו הנדסה ל הכיל REs מתאים. מערכת מודל התמלול המוצגת כאן עבור P53 אנושי מתאפיינת בשלושה משתנים מרכזיים שהאפקטים יכולים להיות מאופנן: 1) מודאליות של הביטוי והסוג של P53, 2) רצף RE השליטה P53 תלויי שעתוק, ו 3) סוג של גן עיתונאי (איור 1A).

בנוגע למודאליות של הביטוי P53, ס' cerevisiae ס מאפשר בחירה של inducible, מחדש, או קונסטיטוטיביות9,10,11. בפרט, inducible GAL1 יזם מאפשר בסיס (באמצעות רפפינז כמקור פחמן) או משתנה (על ידי שינוי כמות של גלקטוז במדיה) ביטוי של TF ב שמרים. למעשה, הביטוי tunable דק מייצג פיתוח קריטי ללמידה לא רק P53 עצמה אלא גם P53 משפחה אחרים חלבונים12,13.

בנוגע לסוג ה-REs השולט בביטוי התלוי בP53, ס' cerevisiae ס מאפשר בנייה של זנים כתבת שונים בעל הבדלים ייחודיים ב RE של עניין ברקע איזוגניים אחרת. מטרה זו היא להגיע באמצעות הסתגלות של גישה מגוונת במיוחד הגנום לעריכה שפותחה ב -S. cerevisiae ס, הנקרא delitto perfetto12,14,15,16.

יתר על כן, גנים עיתונאי שונים (כלומר, URA3, HIS3, ו- ADE2) ניתן להשתמש באיכות הפעולה והערכה כמותית של הפעילות של tfs האדם ב -S. cerevisiae ס, כל אחד עם תכונות ספציפיות שיכול ל להתאים לצרכים הניסיוניים17,18,19,20,21. הביטוי של הגנים האלה העיתונאי מדבר על ה, היסטידין, ובהתאמה. הכתב הURA3 אינו מאפשר את צמיחת התאים בנוכחות של 5 וכדומה, ולכן ניתן לבחור בו בצורה נגדית. מערכת ADE2 עיתונאי יש את היתרון כי, מלבד הבחירה התזונתית, זה מאפשר זיהוי של תאים שמרים לבטא פראי סוג (כלומר, פונקציונלי על ADE2 ביטוי) או מוטציה (כלומר,לא פונקציונלי על ADE2 ) P53 מצבע המושבה.

לדוגמה, תאים שמרים המבטאים את הגן ADE2 ליצור בגודל בדרך כלל מושבות לבנות על הצלחות המכילות כמויות מגבילות של אדנין (2.5-5.0 mg/L), בעוד אלה כי לא מתאים או לא לתעתזה מופיע על צלחת זהה אדום קטן (או ורוד) מושבות. הדבר נובע מהצטברות של ביניים במסלול הביוסינתטי של אדנין (כלומר, P-ריבוסידלסטינו-סראזול, שנקרא בעבר באופן כולל ובאוויר), המומר ליצירת פיגמנט אדום. הצבע האיכותני המבוססת על ADE2 הוא גן הכתבים מאז הוחלף על ידי הגחלילית הכמותית (LUC1)12,22. לאחרונה, העיתונאי ADE2 כבר בשילוב עם העיתונאי lacz ב קל לציון, חצי כמותי, שיטת עיתונאי כפול כי ניתן לנצל לסווג משנה P53 מוטציות לפי רמת השיורית של פונקציונליות . עשריםואחד

כתבים פלורסנט כגון egfp (חלבון פלורסנט ירוק משופר) או dsred (Discosoma sp. אדום חלבון הניאון) יש גם שימש הערכה כמותית של פעילות ההפעלה הקשורים לכל מוטציות ההיגיון האפשרי ב TP53 ברצף24. לבסוף, הסיכוי של שילוב היזמים tunable עבור ביטוי P53 אלל עם זנים שמרים איזוגניים שונים עבור RE ו/או הגן עיתונאי הובילו לפיתוח של מטריצת נתונים היוצרת סיווג מעודן של סרטן הקשורים ו germline . מוטציה P53 אלטלס25,26,27

הגישות המתוארות לעיל משמשות למדידת הפעילות הטרנסקריפטוניים של החלבון הP53. עם זאת, הביטוי של פראי מסוג P53 ב שמרים S. cerevisiae ס28 ו שיזוסכמיומיב פומל29 יכול לגרום לפיגור הצמיחה, אשר נקשר עם מעצר מחזור התא28,30 או . מוות תאים31 בשני המקרים, עיכוב הצמיחה שמרים מופעלת על ידי ביטוי P53 גבוהה, כבר מתואם עם אפנון פוטנציאל ההמרה של גנים שמרים אנדוגניים מעורב צמיחת תאים. תמיכה השערה זו, אובדן הפונקציה מוטציה P53 R273H לא להפריע צמיחת תאים שמרים כאשר מתבטאת ברמות דומות כמו פראי P5332. לעומת זאת, הביטוי בשמרים של המוטציות הרעילים P53 V122A (הידוע בפעילות הטרנססקריפט גבוהה יותר לעומת פראי-סוג P53) גרם לאפקט מעכבות גדילה חזק יותר מאשר פראי סוג P5332.

בנוסף, זה הוכיח כי האדם MDM2 היה מסוגל לעכב את הפעילות האנושית P53 הטרנס בשמרים, קידום אוביקווינציה שלה והשפלה הבאים33. בהתאם, היכולת של MDM2 אנושי ו mdmx לעכב את P53 המושרה עיכוב הצמיחה שמרים הפגינו32,34. במחקר נוסף, מתאם בין פעילות P53 טרנססקריפט ורמות ביטוי אקטין הוקמה, עם זיהוי של P53 RE במעלה הזרם על הגן ACT1 ב שמרים32. בעקביות, ביטוי אקטין היה משופר על ידי פראי P53 ואפילו יותר כך על ידי P53 V122A, אבל לא על ידי מוטציה P53 R273H. לעומת זאת, ביטוי אקטין ידי P53 ירד בנוכחות שיתוף של P53 מעכבי MDM2, mdmx, או pifithrin-α (מדכא קטן מולקולה של הפעילות P53 הטראנס), עקבי עם התוצאות המבוססות על שמרים-גידול שמרי. חשוב מכך, תוצאות אלה הקימו מתאם בין P53 המושרה עיכוב הצמיחה ומידת הפעילות שלה שמרים, אשר נוצל גם כדי לזהות וללמוד מולקולות קטנות מודלדירוג P53 פונקציות28,34 , 35.

Protocol

1. בנייה של ADE2 או LUC1 כתבת זנים שמרים המכיל מחדש מסוים (YAFM-re או ylfm-re)

  1. פס yAFM icore או ylfm-icore להתאמץ12,14 (icore = אני, isce-i endonuclease תחת GAL1 יזם; CO = מונה לבחירה URA3; RE = כתבת KanMX4 הענקת התנגדות לקנאמיצין; שולחן 1) מ 15% מניות גליצרול שאוחסנו ב-80 ° c על צלחת בע (שולחן 2). תן לו לצמוח 2-3 ימים ב 30 ° c.
  2. קח מושבה אחת שמרים מן הלוח הטרי (לא יותר מ 3 שבועות בן) ומניחים אותו בבקבוקון קטן המכיל 5 מ ל YPDA (שולחן 2). דגירה ב 30 ° צ' לילה, רועד ב 150-200 סל ד.
  3. למחרת, כדי להסיר את כל העקבות של דקסטרוז, מצנלת את התאים עבור 2 דקות ב 3,000 x g ולמחוק את הסופרנטנט על ידי היפוך של הצינור.
    הערה: בצע את כל הcentrifugations בפרוטוקול זה בטמפרטורת החדר (RT).
  4. להשעות מחדש את הגלולה תא ב 30-50 מ ל של טרום מחומם (מדיה מלאה) המכיל את גלקטוז (שולחן 2) ו הדגירה עבור 4 h ב 30 ° c, לרעוד ב 150-200 סל"ד (הכרחי עבור אינדוקציה של I-scei).
  5. צנטריפוגה את התאים עבור 2 דקות ב 3,000 x g ולמחוק את supernatant על ידי היפוך של הצינור.
  6. להשעות מחדש את הגלולה בתא ב 30-50 מ ל של מים סטריליים. חזור על שלב 1.5.
  7. השהה מחדש את הגלולה ב -10 מ ל של מים סטריליים. חזור על שלב 1.5.
  8. להשעות מחדש את הגלולה תא 5 מ ל של LiAcTE סטרילי (שולחן 3), פתרון יונית מעדיף ספיגת ה-DNA. חזור על שלב 1.5.
  9. להשעות מחדש את הגלולה תא ב 250 μL של LiAcTE סטרילי ולהעביר את התאים לצינור 1.5 mL. חזור על שלב 1.5 והשהה מחדש את הגלולה הסלולרית ב 300-500 μL של LiAcTE סטרילי.
  10. במהלך השטף, הטמפרטורה 10 מ"ג/mL של הספק ה-DNA של זרע של דג סלמון עבור 10 דקות ב 100 ° צ' ולהירגע מיד על הקרח כדי לשמור עליו כמו דנ א אחד נטוש.
  11. ב שפופרת נפרד 1.5 mL, להוסיף 500 picomoles הרצוי של מחלת השמש הרצויה (שולחן 3), 5 μl של ה-DNA של הנושאת זרע של סלמון מבושלים, 300 μl של השעיית liacte מבושל (שולחן 3), ו50 μl של הבולם התא של שמרים (משלב 1.9).
  12. מערבולת את הצינורות עבור 10 s כדי לערבב ו דגירה עבור 30 דקות ב 30 ° צ', רועד ב 150-200 סל ד. מניחים את צינורות 1.5 mL בצד לטובת לרעוד.
  13. החום הלם התאים שמרים עבור 15 דקות ב 42 ° c בבלוק חימום, ולאחר מכן צנטריפוגה את התאים עבור 20 s ב 10,000 x g. הסר את הסופרנטאנט והשהה מחדש את התאים ב-1 מ ל של מים סטריליים.
  14. התפשטות 100 μL של השעיית התא על הצלחת באגר YPDA ומודטה (הפוך) ליום אחד ב 30 ° c. כדי להבטיח היטב הופרדו מושבות מתקבלים, גם להפיץ 100 μL של 1:10 דילול.
  15. למחרת, צלחת עותק משוכפל באמצעות לוטרינרים סטרילי על צלחת אגר ס מ המכיל דקסטרוז ו 5-זה (שולחן 2). לשקול צלחת העתק השני על צלחת חדשה אם הרבה תאים מועברים (כלומר, כמה הצמיחה של URA3 תאים).
  16. שלושה ימים לאחר מכן, לוחית העתק על שאינם סלקטיבית YPDA ו-YPDA המכיל G418 (אנטיביוטיקה הגליקסייד דומה לקאנאמיצין) אגר צלחות (שולחן 2), סימון כל צלחת כדי להקל על ההשוואה הבאים שלהם. מודאת הצלחות לילה. ב -30 מעלות צלזיוס
  17. למחרת, לזהות את זני העיתונאי המועמדים ממושבות כי הם G418 רגישים אבל לגדול על צלחות YPDA (למשל, yLFM-או yAFM-RE מושבות). פס המושבות מזוהה (3-6 מושבות) על צלחת YPDA חדש כדי לקבל מושבה אחת לבודד ולתת להם לגדול עבור יומיים ב 30 ° c.
  18. תיקון מושבות שמרים יחיד על צלחת YPDA כדי לבודד את המושבות עבור ניתוחים נוספים. לאחר 24 שעות ב 30 ° c, מבחן אותם על ידי ציפוי משוכפל על צלחת באגר YPGA (שולחן 2) למנוע את הצמיחה של מוטציות קטנות (כלומר, המוטנטים לקויה הנשימה). באותו זמן, לוחית העתק על צלחת חדשה של YPDA אגר.
  19. בדוק את התיקונים הנכונים (כלומר, צמיחה על YPDA ו-YPDA אגר צלחות; 1-3 מושבות) משלב 1.18 לנוכחות של התיקון הנכון של מחלת האוגיונואוןעל ידי המושבה PCR. להרכיב תערובת התגובה על ידי הוספת 5 μl של מאגר ה-PCR 10x (1.5 mM mgcl2), 2 μl של 10 picomoles/μl התחל (שולחן 3), 4 μl של 2.5 mM dntps, 0.25 μl של 5 U/μl מסוג, ומים לנפח הסופי של 50 μ הכפל את תערובת התגובה עבור מספר מושבות שמרים צריך להיות מוקרן ו סדרת מחלקים 50 μl לתוך כל צינור PCR. באמצעות פיפטה, להוסיף כמות קטנה מאוד של תאים שמרים מהצלחת הלוח YPDA לתוך ערבוב אחד התגובה PCR.
  20. בצע את תגובת ה-PCR באמצעות התוכנית הבאה: 94 ° צ' למשך 8 דקות ואחריו 35 מחזורי הדנטורציה עבור 1 דקות ב-94 ° c, מעגלי התחל עבור 1 דקות בשעה 55 ° c וסיומת 2 דקות ב-72 ° c.
  21. לאחר השלמת התגובה, טען סדרת מחלקים של תגובת ה-PCR (כעשירית הנפח) על ג'ל agarose כדי לבדוק את הגודל הנכון (~ 500 bp).
  22. רצף את מוצר ה-PCR לאחר הטיהור עם ערכת מסחרית כדי לאשר את האינטגרציה של הרצף RE הרצוי באמצעות אותו התחל של שלב 1.19.
  23. לאחר האימות של הרצף הנכון, לעשות 15% גליצרול מלאי של תרבות yAFM-RE או yLFM-RE הזנים (ב YPDA) ולאחסן אותו ב--80 ° c.

2. הערכה של יכולת הפעלת חלבון P53 באמצעות האיכות האיכותית ADE2 שמרים המבוססת על צבע

  1. חזור על שלבים 1.1 ו-1.2 באמצעות המתח yAFM-RE (טבלה 1).
  2. יום לאחר מכן, לדלל את התרבות התא (1:10) ב 30-50 מ ל של טרום מחומם מראש ולהמשיך המאריטה ב 30 ° צ' על ידי טלטול עד OD600nm מגיע 0.8-1.0 (~ 2 h).
  3. חזור על שלבים 1.5-1.10.
  4. בצינור 1.5 mL נפרד, להוסיף 300-500 ng של שמרים P53 (או שליטה) הביטוי וקטור (שולחן 4), 5 μl של המוביל הזרע סלמון מבושלים ה-DNA, 300 μl של הבולם הסטרילי של LiAcTE, ו50 μl של השעיית תא שמרים.
  5. חזור על שלבים 1.12 ו 1.13 אבל להשעות מחדש את הגלולה התא ב 300 μL של מים סטריליים.
  6. התפשטות 100 μL של השעיית התא על סלקטיבי סינתטי (עבור P53 ביטוי או שליטה וקטור) לוחות המכילים דקסטרוז כמקור פחמן כמות גבוהה של אדנין (שולחן 2), ואז דגירה (הפוך) ב 30 ° c עבור 2-3 ימים.
  7. מושבות שמרים בעלי פס יחיד (2-6 פסים לצלחת) על צלחת סלקטיבית חדשה ולתת להם לצמוח לילה ב 30 ° c.
  8. ביום שלאחר מכן, באמצעות צלחת העתק סטרילי ולוטרינרים על לוחות סלקטיבי חדשים המאפשרים הערכה של הצבע פנוטיפ (כלומר, צלחות המכילות דקסטרוז as מקור פחמן, אך הגבלת כמות של אדנין; טבלה 2). הפוך את הצלחות ב 30 ° c עבור 3 ימים. באופן אופציונלי, כדי להעריך את רגישות הטמפרטורה של חלבון P53, דגירה בשלוש טמפרטורות שונות עבור 3 ימים: 24 ° צ', 30 ° c, ו 37 ° c.
    הערה: הרצף יכול להיות בציפוי משוכפל פעמים רבות.
  9. כדי להעריך את יכולת ההפעלה P53 חלבון, לבדוק את הצבע מבוסס הפנוטיפ של מושבות שמרים ולהשוות את P53 החלבון ביחס P53 wild-סוג וריקים פנוטיפים וקטוריים.

3. הערכה של היכולת להפעלת חלבון P53 באמצעות האור הכמותי מבוסס שיטת LUC1 שמרים

  1. שינוי צורה של תאים שמרים עם P53 (או בקרה) וקטורי ביטוי (טבלה 4) תוך שימוש בשיטה המבוססת על liac המתוארת בפרוטוקול 2. השתמש במתח של yLFM-RE (טבלה 1).
  2. תיקון transformants יחיד על צלחת סלקטיבית חדשה עם כמות גבוהה של אדנומין המכיל גלוקוז כמו מקור הפחמן ולתת להם לגדול ב 30 ° c לילה. עבור כל סוג שינוי, לעשות 5-7 טלאים שונים.
  3. לאחר הצמיחה לילה, להשעות כמות קטנה של תאים שמרים באמצעות קיסם סטרילי או פיילט עצה מן הצלחת ב בינונית סלקטיבית סינתטי המכיל דקסטרוז או רפפינז כמו מקור הפחמן (200 μL הסופי של שקוף 96 טוב צלחת, עם סיבוב או בתחתית שטוחה). אם הניסוי דורש inducible P53 ביטוי, להוסיף גלקטוז למדיום רפפינוז לווסת את רמת האינדוקציה (שולחן 2).
    הערה: השעיות התא הללו אמורות להיות בעלת OD600nm של כ-0.4 וללא יותר מ-1.
  4. מדוד את ספיגת כל טוב ב OD600nm לאחר inducible P53 ביטוי (4-8 h ב 30 ° צ' עם 150-200 rpm רועד) באמצעות קורא לוחית multilabel. ודא שהשעיות התאים הן הומוגניות על-ידי ערבוב כל היטב באמצעות פיפטה רב-ערוצית.
  5. העבר 10-20 μL של השעיית התא מתוך שקוף 96 הצלחת הבאר לתוך 384 לבן (או 96) צלחת היטב לערבב עם נפח שווה (10-20 μL) של מאגר לפירוק. דגירה עבור 10-15 דקות ב RT על שייקר (150-200 rpm) כדי להשיג חדירות של התא למצע לוציפראז.
  6. הוסף 10-20 μL של גחלילית לוציפראז ולמדוד את יחידות האור (LU) על ידי קורא לוחית רב תוויות.
  7. כדי לקבוע את יכולת ההפעלה של חלבון P53, לנרמל את ה-LUs של כל הבאר ל-OD600nm (יחידת אור יחסית, rlu). חישוב ממוצע RLU וסטיית התקן מ-3-4 טלאים של מושבות שמרים.
  8. להשוות את נתוני הP53 החלבון ביחס P53 פראי סוג וקטור ריק, או על ידי חיסור הערכים שהתקבלו עם וקטור ריק או על ידי חלוקה לפי הערכים שהתקבלו עם וקטור ריק (כלומר, קיפול המחשוב של אינדוקציה).
    הערה: ניתן להעריך גם את פעילות P53 ההפעלה באמצעות הערכה ניסיונית זהה בנוכחות של חלבונים בעלי P53 אינטראקציה (כלומר, MDM2 ו-MDMX) ו/או כולל טיפול תרופתי.

4. הערכה של עיכוב הצמיחה של חלבון P53 באמצעות השמרים פנומיטילי

  1. שינוי צורה של תאים שמרים עם P53/MDM2/MDMX (או פקד) ביטוי וקטורים (טבלה 4) באמצעות השיטה המבוססת על liac המתוארת בסעיף 2. השתמש זן CG379 (טבלה 1) ולהפיץ transformants שמרים על לוחות סלקטיבי מינימלי (טבלה 2).
  2. לגדול תאים שהפכו בינוני סלקטיבי מינימלי (שולחן 2) כ 1 OD כ600nm.
  3. לדלל תאים שמרים כדי 0.05 OD600nm במדיום אינדוקציה סלקטיבית (שולחן 2), ובמידת הצורך, להוסיף מולקולה קטנה שנבחרה לריכוז המתאים (או ממס בלבד) כדי לבדוק את יעילותה בהפעלה מחדש של מוטציה P53 או מעכב MDM2- /MDMXT-P53 אינטראקציות.
  4. התאים מודדים ב 30 ° c תחת טלטול מסלולית רציפה (200 rpm) עבור כ 42 h (הזמן הנדרש על ידי שמרים בקרה שלילית להגיע באמצע יומן השלב, על 0.45 OD600nm).
  5. ספוט 100 μL של תרביות תאים שמרים על לוחות סלקטיביים מינימליים (שולחן 2).
  6. מודטה למשך יומיים ב -30 ° c.
  7. למדוד את הצמיחה שמרים על ידי ספירת מספר המושבות שהתקבלו 100 μL התרבות טיפות (המושבה ויוצרים יחידה, ספירת CFU). לדוגמה, לחשב את ההשפעה של מוטציה הפעלה מחדש של תרכובות בהתחשב הצמיחה של פראי-סוג P53 ביטוי שמרים כמו ההשפעה המקסימלית האפשרית (להגדיר כדי 100%), בעוד הצמיחה של תאים המבטא מוטציה P53 (אבל חשוף לבקרת ממס) מייצג רמת אפס של ההפעלה מראש.

תוצאות

בניית מ ADE2 או LUC1 כתבת זנים שמרים

הגישה הטיפולית12,14,15,16 כבר הותאם כדי לאפשר את הבנייה של P53 העיתונאי זנים שמ?...

Discussion

שמרים מבוססי בחני הוכיחו שימושי כדי לחקור היבטים שונים של פונקציות חלבון P53. בחני אלה רגישים במיוחד להערכת פוטנציאל ההפעלה הפעלת כלפי משתנים של אתרי יעד RE, כולל הערכה של פולימריות פונקציונלי. השימוש כתבים צבע, כמו גם המזעור של התוצאה לוציפראז תוצאות בעלות חסכונית ומדרגי יחסית. כמו כן, מבחן ...

Disclosures

המחברים לא מצהירים. על ניגוד אינטרסים

Acknowledgements

אנו מודים לאיחוד האירופי (כספי פדר poci/01/0145/פדר/007728 באמצעות מתכנתים המבצע מפעל להתחרות) וכספים לאומיים (fct/MEC, האופרה הלאומית של ciência e ומיניצ) באמצעות ה הסכם שותפות PT2020 UID/קי/50006/2019 והפרוייקטים (3599-PPCDT) לפטין/DTP-FTO/1981/2014-POCI-01-0145-פדר-016581. מלגות FCT: SFRH/BD/96189/2013 (S. גומז). עבודה זו נתמכת על ידי Compagnia S. פאולו, טורינו, איטליה (פרויקט 2017.0526) ומשרד הבריאות, (פרויקט 5x1000, 2015 ו 2016; המחקר הנוכחי 2016). אנו מודים עמוקות ד ר תרזה לופס-אריות מונטנגרו (אוניברסיטת טרנטו, מעבדות לימוד של מדעים ניסיוניים) לסיוע בהקלטת וידאו.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
L-Aspartic acidSIGMA11189
QIAquick PCR Purification KitQIAGEN28104
L-PhenylalanineSIGMA78019
PeptoneBD Bacto211677
Yeast ex+A2:C26tractBD Bacto212750
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium SulfateBDTM233520
Lithium Acetate DihydrateSIGMA517992
Bacteriological Agar Type ABiokar DiagnosticsA1010 HA
G418 disulfate saltSIGMAA1720
Ammonium SulfateSIGMAA2939
L-Arginine Monohydro-chlorideSIGMAA5131
Adenine Hemisulfate SaltSIGMAA9126
Passive Lysis Buffer 5xPROMEGAE1941
Bright-Glo Luciferase Assay System PROMEGAE2620
5-FOAZymo ResearchF9001
D-(+)-GalactoseSIGMAG0750
L-Glutamic acidSIGMAG1251
Dextrose SIGMAG7021
L-HistidineSIGMAH8125
L-IsoleucineSIGMAI2752
L-LysineSIGMAL1262
L-LeucineSIGMAL8000
L-MethionineSIGMAM2893
PEGSIGMAP3640
D-(+)-Raffinose PentahydrateSIGMAR0250
L-SerineSIGMAS4500
L-TryptophanSIGMAT0271
L-ThreonineSIGMAT8625
UracilSIGMAU0750
L-ValineSIGMAV0500

References

  1. Spitz, F., Furlong, E. E. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nature Reviews Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).
  2. Pan, Y., Tsai, C. J., Ma, B., Nussinov, R. Mechanisms of transcription factor selectivity. Trends in Genetics. 26 (2), 75-83 (2010).
  3. Das, M. K., Dai, H. K. A survey of DNA motif finding algorithms. BMC Bioinformatics. 8 Suppl 7, S21 (2007).
  4. Sebastian, A., Contreras-Moreira, B. The twilight zone of cis element alignments. Nucleic Acids Resesarch. 41 (3), 1438-1449 (2013).
  5. Iggo, R., et al. Validation of a yeast functional assay for p53 mutations using clonal sequencing. Journal of Pathology. 231 (4), 441-448 (2013).
  6. Kaeberlein, M., Burtner, C. R., Kennedy, B. K. Recent developments in yeast aging. PLoS Genetics. 3 (5), e84 (2007).
  7. Scharer, E., Iggo, R. Mammalian p53 can function as a transcription factor in yeast. Nucleic Acids Research. 20 (7), 1539-1545 (1992).
  8. Kennedy, B. K. Mammalian transcription factors in yeast: strangers in a familiar land. Nature Reviews Molecular Cellular Biology. 3 (1), 41-49 (2002).
  9. Belli, G., Gari, E., Piedrafita, L., Aldea, M., Herrero, E. An activator/repressor dual system allows tight tetracycline-regulated gene expression in budding yeast. Nucleic Acids Research. 26 (4), 942-947 (1998).
  10. Mumberg, D., Muller, R., Funk, M. Regulatable promoters of Saccharomyces cerevisiae: comparison of transcriptional activity and their use for heterologous expression. Nucleic Acids Research. 22 (25), 5767-5768 (1994).
  11. Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).
  12. Inga, A., Storici, F., Darden, T. A., Resnick, M. A. Differential transactivation by the p53 transcription factor is highly dependent on p53 level and promoter target sequence. Molelcular and Cellular Biology. 22 (24), 8612-8625 (2002).
  13. Resnick, M. A., Inga, A. Functional mutants of the sequence-specific transcription factor p53 and implications for master genes of diversity. Proceeding of the National Academy of Science USA. 100 (17), 9934-9939 (2003).
  14. Tomso, D. J., et al. Functionally distinct polymorphic sequences in the human genome that are targets for p53 transactivation. Proceeding of the National Academy of Science USA. 102 (18), 6431-6436 (2005).
  15. Storici, F., Lewis, L. K., Resnick, M. A. In vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides. Nature Biotechnology. 19 (8), 773-776 (2001).
  16. Storici, F., Resnick, M. A. The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast. Methods in Enzymology. 409, 329-345 (2006).
  17. Campomenosi, P., et al. p53 mutants can often transactivate promoters containing a p21 but not Bax or PIG3 responsive elements. Oncogene. 20 (27), 3573-3579 (2001).
  18. Flaman, J. M., et al. A simple p53 functional assay for screening cell lines, blood, and tumors. Proceedings of the National Academy of Science USA. 92 (9), 3963-3967 (1995).
  19. Kovvali, G. K., Mehta, B., Epstein, C. B., Lutzker, S. G. Identification of partial loss of function p53 gene mutations utilizing a yeast-based functional assay. Nucleic Acids Research. 29 (5), E28 (2001).
  20. Shimada, A., et al. The transcriptional activities of p53 and its homologue p51/p63: similarities and differences. Cancer Research. 59 (12), 2781-2786 (1999).
  21. Sunahara, M., et al. Mutational analysis of p51A/TAp63gamma, a p53 homolog, in non-small cell lung cancer and breast. Oncogene. 18 (25), 3761-3765 (1999).
  22. Andreotti, V., et al. p53 transactivation and the impact of mutations, cofactors and small molecules using a simplified yeast-based screening system. PLoS ONE. 6 (6), e20643 (2011).
  23. Hekmat-Scafe, D. S., et al. Using yeast to determine the functional consequences of mutations in the human p53 tumor suppressor gene: An introductory course-based undergraduate research experience in molecular and cell biology. Biochemistry Molecular Biology Educaction. 45 (2), 161-178 (2017).
  24. Kato, S., et al. Understanding the function-structure and function-mutation relationships of p53 tumor suppressor protein by high-resolution missense mutation analysis. Proceedings of the National Academy of Science USA. 100 (14), 8424-8429 (2003).
  25. Monti, P., et al. Transcriptional functionality of germ line p53 mutants influences cancer phenotype. Clinical Cancer Research. 13 (13), 3789-3795 (2007).
  26. Monti, P., et al. Dominant-negative features of mutant TP53 in germline carriers have limited impact on cancer outcomes. Molecular Cancer Research. 9 (3), 271-279 (2011).
  27. Leroy, B., et al. The TP53 website: an integrative resource centre for the TP53 mutation database and TP53 mutant analysis. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D962-D969 (2013).
  28. Nigro, J. M., Sikorski, R., Reed, S. I., Vogelstein, B. Human p53 and CDC2Hs genes combine to inhibit the proliferation of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 1357-1365 (1992).
  29. Bureik, M., Jungbluth, A., Drescher, R., Wagner, P. Human p53 restores DNA synthesis control in fission yeast. Biological Chemistry. 378 (11), 1361-1371 (1997).
  30. Leao, M., et al. Alpha-mangostin and gambogic acid as potential inhibitors of the p53-MDM2 interaction revealed by a yeast approach. Journal of Natural Products. 76 (4), 774-778 (2013).
  31. Hadj Amor, I. Y., et al. Human p53 induces cell death and downregulates thioredoxin expression in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Research. 8 (8), 1254-1262 (2008).
  32. Leao, M., et al. Novel simplified yeast-based assays of regulators of p53-MDMX interaction and p53 transcriptional activity. FEBS J. 280 (24), 6498-6507 (2013).
  33. Di Ventura, B., Funaya, C., Antony, C., Knop, M., Serrano, L. Reconstitution of Mdm2-dependent post-translational modifications of p53 in yeast. PLoS ONE. 3 (1), e1507 (2008).
  34. Leao, M., et al. Discovery of a new small-molecule inhibitor of p53-MDM2 interaction using a yeast-based approach. Biochemichal Pharmacology. 85 (9), 1234-1245 (2013).
  35. Billant, O., Blondel, M., Voisset, C. p53, p63 and p73 in the wonderland of S. cerevisiae. Oncotarget. 8 (34), 57855-57869 (2017).
  36. Cho, Y., Gorina, S., Jeffrey, P. D., Pavletich, N. P. Crystal structure of a p53 tumor suppressor-DNA complex: understanding tumorigenic mutations. Science. 265 (5170), 346-355 (1994).
  37. Muller, P. A., Vousden, K. H., Norman, J. C. p53 and its mutants in tumor cell migration and invasion. Journal of Cellular Biology. 192 (2), 209-218 (2011).
  38. Oren, M., Rotter, V. Mutant p53 gain-of-function in cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), a001107 (2010).
  39. Walerych, D., Napoli, M., Collavin, L., Del Sal, G. The rebel angel: mutant p53 as the driving oncogene in breast cancer. Carcinogenesis. 33 (11), 2007-2017 (2012).
  40. Ciribilli, Y., et al. The coordinated p53 and estrogen receptor cis-regulation at an FLT1 promoter SNP is specific to genotoxic stress and estrogenic compound. PLoS ONE. 5 (4), e10236 (2010).
  41. Menendez, D., Inga, A., Resnick, M. A. Potentiating the p53 network. Discovery Medicine. 10 (50), 94-100 (2010).
  42. Monti, P., et al. Characterization of the p53 mutants ability to inhibit p73 beta transactivation using a yeast-based functional assay. Oncogene. 22 (34), 5252-5260 (2003).
  43. Monti, P., et al. Tumour p53 mutations exhibit promoter selective dominance over wild-type p53. Oncogene. 21 (11), 1641-1648 (2002).
  44. Shiraishi, K., et al. Isolation of temperature-sensitive p53 mutations from a comprehensive missense mutation library. Journal of Biological Chemistry. 279 (1), 348-355 (2004).
  45. Soussi, T. TP53 mutations in human cancer: database reassessment and prospects for the next decade. Advances in Cancer Research. 110, 107-139 (2011).
  46. Malkin, D. Li-Fraumeni Syndrome. Genes and Cancer. 2, 474-484 (2001).
  47. el-Deiry, W. S., Kern, S. E., Pietenpol, J. A., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Definition of a consensus binding site for p53. Nature Genetics. 1 (1), 45-49 (1992).
  48. Menendez, D., Inga, A., Resnick, M. A. The expanding universe of p53 targets. Nature Reviews in Cancer. 9, 724-737 (2009).
  49. Ciribilli, Y., et al. Transactivation specificity is conserved among p53 family proteins and depends on a response element sequence code. Nucleic Acids Research. 41 (18), 8637-8653 (2013).
  50. Smeenk, L., et al. Characterization of genome-wide p53-binding sites upon stress response. Nucleic Acids Research. 36, 3639-3654 (2008).
  51. Vyas, P., et al. Diverse p53/DNA binding modes expand the repertoire of p53 response elements. Proceeding of the National Academy of Science USA. 114 (40), 10624-10629 (2017).
  52. Tebaldi, T., et al. Whole-genome cartography of p53 response elements ranked on transactivation potential. BMC Genomics. 16, 464 (2015).
  53. Wang, T., et al. Species-specific endogenous retroviruses shape the transcriptional network of the human tumor suppressor protein p53. Proceedings of the National Academy of Science USA. 104, 18613-18618 (2007).
  54. Bond, G. L., et al. A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans. Cell. 119 (5), 591-602 (2004).
  55. Zeron-Medina, J., et al. A polymorphic p53 response element in KIT ligand influences cancer risk and has undergone natural selection. Cell. 155 (2), 410-422 (2013).
  56. Lion, M., et al. Evolution of p53 transactivation specificity through the lens of a yeast-based functional assay. PLoS ONE. 10 (2), e0116177 (2015).
  57. Schumacher, B., et al. C. elegans ced-13 can promote apoptosis and is induced in response to DNA damage. Cell Death and Differentiation. 12 (2), 153-161 (2005).
  58. Jordan, J. J., et al. Low-level p53 expression changes transactivation rules and reveals superactivating sequences. Proceeding of the National Academy of Science USA. 109 (36), 14387-14392 (2012).
  59. Soares, J., et al. Oxazoloisoindolinones with in vitro antitumor activity selectively activate a p53-pathway through potential inhibition of the p53-MDM2 interaction. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 66, 138-147 (2015).
  60. Leao, M., et al. Enhanced cytotoxicity of prenylated chalcone against tumour cells via disruption of the p53-MDM2 interaction. Life Sciences. 142, 60-65 (2015).
  61. Soares, J., et al. A tryptophanol-derived oxazolopiperidone lactam is cytotoxic against tumors via inhibition of p53 interaction with murine double minute proteins. Pharmacol Research. 95-96, 42-52 (2015).
  62. Soares, J., et al. DIMP53-1: a novel small-molecule dual inhibitor of p53-MDM2/X interactions with multifunctional p53-dependent anticancer properties. Molecular Oncology. 11 (6), 612-627 (2017).
  63. Soares, J., et al. Reactivation of wild-type and mutant p53 by tryptophanolderived oxazoloisoindolinone SLMP53-1, a novel anticancer small-molecule. Oncotarget. 7 (4), 4326-4343 (2016).
  64. Sharma, V., Monti, P., Fronza, G., Inga, A. Human transcription factors in yeast: the fruitful examples of P53 and NF-small ka, CyrillicB. FEMS Yeast Research. 16 (7), (2016).
  65. Stepanov, A., Nitiss, K. C., Neale, G., Nitiss, J. L. Enhancing drug accumulation in Saccharomyces cerevisiae by repression of pleiotropic drug resistance genes with chimeric transcription repressors. Molecular Pharmacology. 74 (2), 423-431 (2008).
  66. Sharma, V., et al. Quantitative Analysis of NF-kappaB Transactivation Specificity Using a Yeast-Based Functional Assay. PLoS ONE. 10 (7), e0130170 (2015).
  67. Epinat, J. C., et al. Reconstitution of the NF-kappa B system in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 13 (7), 599-612 (1997).
  68. Inga, A., Reamon-Buettner, S. M., Borlak, J., Resnick, M. A. Functional dissection of sequence-specific NKX2-5 DNA binding domain mutations associated with human heart septation defects using a yeast-based system. Human Molecular Genetics. 14 (14), 1965-1975 (2005).
  69. Reamon-Buettner, S. M., Ciribilli, Y., Inga, A., Borlak, J. A loss-of-function mutation in the binding domain of HAND1 predicts hypoplasia of the human hearts. Human Molecular Genetics. 17 (10), 1397-1405 (2008).
  70. Balmelli-Gallacchi, P., et al. A yeast-based bioassay for the determination of functional and non-functional estrogen receptors. Nucleic Acids Research. 27 (8), 1875-1881 (1999).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

150P53

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved