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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Präsentiert werden vier Protokolle zum Konstruieren und Ausnutzen von Hefe Saccharomyces cerevisiae Reporterstämmen, um menschliche P53-Transaktivierungspotenziale, Auswirkungen seiner verschiedenen krebsassoziierten Mutationen, ko-exprimierte interagierende Proteine und die Auswirkungen bestimmter kleiner Moleküle.

Zusammenfassung

Die Feststellung, dass das bekannte Säugetier-P53-Protein als Transkriptionsfaktor (TF) in der Hefe S. cerevisiae fungieren kann, hat die Entwicklung verschiedener funktioneller Assays ermöglicht, um die Auswirkungen von 1) Bindungsstellen zu untersuchen [d.h. Das Ansprechelement (RE)] Sequenzvarianten auf P53-Transaktivierungsspezifität oder 2) TP53-Mutationen, koexprimierte Kofaktoren oder kleine Moleküle bei P53-Transaktivierungsaktivität. Es wurden verschiedene Basis- und translationale Forschungsanwendungen entwickelt. Experimentell nutzen diese Ansätze zwei wesentliche Vorteile des Hefemodells aus. Einerseits ermöglicht die einfache Genombearbeitung den schnellen Aufbau qualitativer oder quantitativer Reportersysteme, indem isogene Stämme genutzt werden, die sich nur auf der Ebene eines spezifischen P53-RE unterscheiden, um die sequenzionizifizium abhängige P53-abhängige Transaktivierung. Andererseits ermöglicht die Verfügbarkeit regulierter Systeme für die ektopische P53-Expression die Auswertung der Transaktivierung in einer Vielzahl von Proteinexpressionen. Bewertet in diesem Bericht sind ausgiebig verwendete Systeme, die auf Farbreporter-Gene, Luziferase und das Wachstum von Hefe basieren, um ihre wichtigsten methodischen Schritte zu veranschaulichen und ihre Vorhersagekraft kritisch zu bewerten. Darüber hinaus kann die extreme Vielseitigkeit dieser Ansätze leicht genutzt werden, um verschiedene TFs zu untersuchen, einschließlich P63 und P73, die andere Mitglieder der TP53-Genfamilie sind.

Einleitung

Die Transkription ist ein äußerst komplexer Prozess, bei dem die dynamische, räumliche und zeitliche Organisation von Transkriptionsfaktoren (TFs) und Kofaktoren für die Rekrutierung und Modulation von RNA-Polymerasen in Chromatinregionen als Reaktion auf spezifische Reize1 . Die meisten TFs, einschließlich des menschlichen P53-Tumorsuppressors, erkennen bestimmte cis-wirkende Elemente in Form von DNA-Sequenzen, sogenannten Response-Elementen (REs), die aus einzelnen (oder mehreren) einzigartigen Motiven bestehen, die 6-10 Nukleotide lang sind. Innerhalb dieser Motive können einzelne Positionen verschiedene Variabilitätsgrade2aufweisen, in der Regel nach Positionsgewichtsmatrizen (PWM) oder Logos3,4zusammengefasst.

Die Hefe S. cerevisiae ist ein geeignetes Modellsystem zur Untersuchung verschiedener Aspekte menschlicher Proteine durch Komplementierungs-Assays, ektopische Expression und funktionelle Assays, selbst wenn ein orthologoxes Hefegen nicht vorhanden ist5, 6 , 7. Aufgrund der evolutionären Konservierung von Basalkomponenten des Transkriptionssystems8können viele menschliche TFs (wenn sie ektopisch in Hefezellen ausgedrückt werden) die Expression eines Reportergens modulieren, indem sie durch Promotoren wirken, die entsprechende REs enthalten. Das hier vorgestellte Transkriptionsmodellsystem für humane P53 zeichnet sich durch drei Hauptvariablen aus, deren Wirkungen moduliert werden können: 1) die Modalität der Expression und Art von P53, 2) die RE-Sequenz, die P53-abhängige Transkription steuert, und 3) die Art der Reportergen (Abbildung 1A).

Hinsichtlich der Modalität des P53-Ausdrucks ermöglicht S. cerevisiae die Wahl zwischen induzierbaren, druckbaren oder konstitutiven Promotoren9,10,11. Insbesondere erlaubt der induzierbare GAL1-Promotor die basale (mit Raffinose als Kohlenstoffquelle) oder variable (durch Änderung der Galaktosemenge in den Medien) Expression eines TF in Hefe. Tatsächlich stellt der fein abgestimmte Ausdruck eine kritische Entwicklung dar, um nicht nur P53 selbst, sondern auch andere Proteine der P53-Familie12,13zu studieren.

In Bezug auf die Art der REs, die den P53-abhängigen Ausdruck steuern, ermöglicht S. cerevisiae die Konstruktion verschiedener Reporterstämme, die einzigartige Unterschiede im RE-Interesse in einem ansonsten isogenen Hintergrund aufweisen. Dieses Ziel wird mit einer Anpassung eines besonders vielseitigen Genom-Editing-Ansatzes erreicht, der in S. cerevisiaeentwickelt wurde, genannt delitto perfetto12,14,15,16.

Darüber hinaus können verschiedene Reportergene (d. h. URA3, HIS3 und ADE2) verwendet werden, um transkriptionelle Aktivitäten menschlicher TFs in S. cerevisiaequalitativ und quantitativ zu bewerten. auf experimentelle Bedürfnisse zugeschnitten sein17,18,19,20,21. Die Expression dieser Reportergene verleiht Uracil, Histidin und Adeninprototrophie. Der URA3-Reporter lässt auch das Wachstum von Zellen in Gegenwart von 5-FOA nicht zu und kann somit gegengewählt werden. Das ADE2-Reportersystem hat den Vorteil, dass es neben der Ernährungsauswahl die Identifizierung von Hefezellen ermöglicht, die Wildtyp (d. h. funktional bei ADE2-Expression) oder mutiert (d. h.nicht funktionsfähig auf ADE2) exprimieren. ) P53 aus der Koloniefarbe.

Zum Beispiel erzeugen Hefezellen, die das ADE2-Gen exzieren, normalerweise große weiße Kolonien auf Platten, die begrenzende Mengen an Adenin (2,5-5,0 mg/L) enthalten, während solche, die es schlecht oder nicht transkribieren, auf derselben Platte wie kleinere rote (oder rosa) Kolonien. Dies ist auf die Anhäufung eines Zwischenprodukts im Biosynthetischen Adenin (d. h. P-Ribosylamino-Imidazol, das zuvor Amino-Imidazol-Ribot oder AIR genannt wurde), das zu einem roten Pigment umgewandelt wird. Das qualitative farbbasierte ADE2-Reportergen wurde seitdem durch das quantitative Firefly Photinus pyralis (LUC1)12,22ersetzt. In jüngerer Zeit wurde der ADE2-Reporter mit dem lacZ-Reporter in einem leicht zu bewertenden, semi-quantitativen Doppelreporter-Assay kombiniert, der genutzt werden kann, um P53-Mutanten nach ihrem Restfunktionsgrad zu unterklassifizieren. 23.

Fluoreszierende Reporter wie EGFP (enhanced green fluorescent protein) oder DsRed (Discosoma sp. red fluorescent protein) wurden auch für die quantitative Bewertung der Transaktivierungsaktivität im Zusammenhang mit allen möglichen Missense-Mutationen in der TP53-Codierungssequenz24. Schließlich hat die Chance, abstimmbare Promotoren für die P53-Allelexpression mit isogenen Hefestämmen zu kombinieren, die sich für das RE- und/oder Reportergen unterscheiden, zur Entwicklung einer Datenmatrix geführt, die eine verfeinerte Klassifizierung von krebsassoziierter und Keimbahn erzeugt. Mutante P53 Allele25,26,27.

Die oben beschriebenen Ansätze werden verwendet, um die Transkriptionsaktivität des P53-Proteins zu messen. Die Expression von Wildtyp P53 in der Hefe S. cerevisiae28 und Schizosaccharomyces pombe29 kann jedoch zu Wachstumsverzögerungen führen, die mit Zellzyklusstillstand28,30 oder Zelltod31. In beiden Fällen wird die Hefewachstumshemmung durch eine hohe P53-Expression ausgelöst und mit einer möglichen transkriptionellen Modulation endogener Hefegene korreliert, die am Zellwachstum beteiligt sind. Zur Untermauern dieser Hypothese störte der Funktionsverlustmutant P53 R273H das Wachstum der Hefezellen nicht, wenn er auf ähnlichen Ebenen wie wildartig P5332ausgedrückt wurde. Umgekehrt verursachte die Expression des toxischen Mutanten P53 V122A (bekannt für eine höhere Transkriptionsaktivität im Vergleich zum Wildtyp P53) in Hefe eine stärkere wachstumshemmende Wirkung als der Wildtyp P5332.

Zusätzlich wurde gezeigt, dass humanes MDM2 in der Lage war, die menschliche P53-Transkriptionsaktivität in Hefe zu hemmen und seine Ubiquitination und den anschließenden Abbau zu fördern33. Dementsprechend wurde die Fähigkeit von humanem MDM2 und MDMX, P53-induzierte Hefewachstumshemmung zu hemmen,32,34gezeigt. In einer zusätzlichen Studie wurde eine Korrelation zwischen der Transkriptionsaktivität P53 und den Actin-Expressionsspiegeln festgestellt, wobei ein vermeintliches P53 RE vor dem ACT1-Gen in Hefe32identifiziert wurde. Konsequentwurde die Actin-Expression durch den Wildtyp P53 und noch mehr durch P53 V122A, nicht aber durch mutierte P53 R273H verstärkt. Umgekehrt verringerte sich die Aktinexpression durch P53 in der Kopräsenz der P53-Inhibitoren MDM2, MDMX oder Pifithrin-A (ein kleinmolekularer Inhibitor der P53-Transkriptionsaktivität), die mit den Ergebnissen auf der Grundlage des Hefewachstums-Assays übereinstimmten. Wichtig ist, dass diese Ergebnisse eine Korrelation zwischen der P53-induzierten Wachstumshemmung und dem Grad ihrer Aktivität in Hefe feststellten, die auch genutzt wurde, um kleine Moleküle zu identifizieren und zu untersuchen, die P53-Funktionen modulieren28,34 , 35.

Protokoll

1. Bau von ADE2- oder LUC1-Reporterhefestämmen, die einen spezifischen RE (yAFM-RE oder yLFM-RE) enthalten

  1. Streak a yAFM-ICORE oder yLFM-ICORE Stamm12,14 (ICORE = I, ISce-I Endonuklease unter GAL1 Promoter; CO = zählerlich wählbar URA3; RE = Reporter KanMX4 verleiht Kanamycin-Widerstand; Tabelle 1) aus einem 15% Glycerinbestand, der bei -80 °C auf einer YPDA-Agarplatte gelagert wird (Tabelle 2). Lassen Sie es für 2-3 Tage bei 30 °C wachsen.
  2. Nehmen Sie eine Hefekolonie von der frischen Platte (nicht mehr als 3 Wochen alt) und legen Sie sie in einen kleinen Kolben mit 5 ml YPDA (Tabelle 2). Bei 30 °C über Nacht inkubieren, bei 150-200 Umdrehungen von 150 bis 200 Umdrehungen von 150 Rpm schütteln.
  3. Am nächsten Tag, um alle Spuren von Dextrose zu entfernen, pellet die Zellen für 2 min bei 3.000 x g und entsorgen Sie den Überstand durch Umkehrung des Rohres.
    HINWEIS: Führen Sie alle Zentrifugationen in diesem Protokoll bei Raumtemperatur (RT) durch.
  4. Das Zellpellet in 30-50 ml vorgewärmtem CM (vollständiges Medium) mit Galaktose (Tabelle2) wieder auftragen und 4 h bei 30 °C inkubieren, bei 150-200 Rpm schütteln (notwendig für die Induktion von I-SceI).
  5. Zentrifugieren Sie die Zellen für 2 min bei 3.000 x g und entsorgen Sie den Überstand durch Umkehrung des Rohres.
  6. Das Zellpellet in 30-50 ml sterilem Wasser wieder aufsetzen. Wiederholen Sie Schritt 1.5.
  7. Das Zellpellet in 10 ml sterilem Wasser wieder aufsetzen. Wiederholen Sie Schritt 1.5.
  8. Setzen Sie das Zellpellet in 5 ml sterilem LiAcTE (Tabelle 3) wieder aus, einer ionischen Lösung, die die DNA-Aufnahme begünstigt. Wiederholen Sie Schritt 1.5.
  9. Setzen Sie das Zellpellet in 250 l sterilem LiAcTE wieder auf und übertragen Sie die Zellen in ein 1,5 ml-Rohr. Wiederholen Sie Schritt 1.5 und setzen Sie das Zellpellet in 300-500 l sterilem LiAcTE wieder auf.
  10. Während der Wähme denaturieren Sie eine 10 mg/ml-Lösung von Lachssperma-DNA-Träger für 10 min bei 100 °C und kühlen Sie sofort auf Eis, um es als einsträngige DNA zu erhalten.
  11. In einem separaten 1,5 ml-Rohr 500 Picomole des gewünschten Oligonukleotids (Tabelle 3), 5 l der gekochten Lachs-Spermaträger-DNA, 300 l steriler LiAcTE PEG (Tabelle 3) und 50 l der Hefezellsuspension (ab Schritt 1,9) hinzufügen.
  12. Wirbeln Sie die Rohre für 10 s zu mischen und für 30 min bei 30 °C zu brüten, schütteln bei 150-200 U/min. Legen Sie die 1,5 ml Rohre auf die Seite, um schütteln zu begünstigen.
  13. Hitze schockt die Hefezellen für 15 min bei 42 °C in einem Heizblock, zentrifugieren sie dann die Zellen für 20 s bei 10.000 x g. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 1 ml sterilem Wasser wieder aus.
  14. 100 l der Zellsuspension auf der YPDA-Agarplatte verteilen und 1 Tag bei 30 °C inkubieren (umgedreht). Um sicherzustellen, dass gut getrennte Kolonien erhalten werden, verteilen Sie auch 100 l einer Verdünnung von 1:10.
  15. Am nächsten Tag, Replik Platte mit sterilem Samt auf CM AgarPlatte mit Dextrose und 5-FOA (Tabelle 2). Betrachten Sie eine zweite Replikplatte auf einer neuen Platte, wenn viele Zellen übertragen werden (d. h. ein gewisses Wachstum von URA3-Zellen).
  16. Drei Tage später, Replik Platte auf nicht-selektiven YPDA und YPDA enthält G418 (ein Aminoglykosid-Antibiotikum ähnlich Kanamycin) Agar-Platten (Tabelle 2), Markierung jeder Platte, um ihren späteren Vergleich zu erleichtern. Die Platten über Nacht bei 30 °C inkubieren.
  17. Identifizieren Sie am nächsten Tag die Kandidatenreporterstämme aus Kolonien, die G418-empfindlich sind, aber auf YPDA-Platten wachsen (z. B. yLFM- oder yAFM-RE-Kolonien). Streifen Sie die identifizierten Kolonien (3-6 Kolonien) auf einer neuen YPDA-Platte, um einzelne Kolonieisolate zu erhalten und sie für 2 Tage bei 30 °C wachsen zu lassen.
  18. Patch einzelne Hefekolonien auf einer YPDA-Platte, um die Kolonien für weitere Analysen zu isolieren. Nach 24 h bei 30 °C, testen Sie sie durch Nachahmung auf einer YPGA-Agarplatte (Tabelle 2), die das Wachstum von zierlichen Mutanten (d. h. Atemnoten)) verhindern. Zur gleichen Zeit, Replik Platte auf einer neuen YPDA Agar Platte.
  19. Testen Sie die richtigen Pflaster (d. h. Wachstum auf YPDA- und YPGA-Agarplatten; 1-3 Kolonien) ab Schritt 1.18 auf das Vorhandensein einer korrekten Oligonukleotid-Integration durch Kolonie PCR. Montieren Sie einen Reaktionsmix, indem Sie 5 l mit 10x PCR-Puffer (1,5 mM MgCl2), 2 l mit 10 Picomoles/L-Primern (Tabelle3),4 l mit 2,5 mM dNTPs, 0,25 l 5 U/L Taq-Polymerase und Wasser zu einem Endvolumen von 50 l hinzufügen. Multiplizieren Sie den Reaktionsmix für die Anzahl der Hefekolonien, die gesiescreent werden müssen, und aliquot 50 l in jedes PCR-Rohr. Mit einer Pipette eine sehr kleine Menge Hefezellen aus der YPDA Agarplatte in einen einzigen PCR-Reaktionsmix geben.
  20. Führen Sie die PCR-Reaktion mit folgendem Programm durch: 94 °C für 8 min, gefolgt von 35 Denaturierungszyklen für 1 min bei 94 °C, Primern, die 1 min bei 55 °C glühen, und Verlängerung um 2 min bei 72 °C.
  21. Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist, laden Sie ein Aliquot der PCR-Reaktion (etwa ein Zehntel des Volumens) auf ein Agarose-Gel, um die richtige Größe zu überprüfen (ca. 500 bp).
  22. Sequenzieren Sie das PCR-Produkt nach der Reinigung mit einem kommerziellen Kit, um die Integration der gewünschten RE-Sequenz mit den gleichen Primern von Schritt 1.19 zu bestätigen.
  23. Nach der Validierung der korrekten Sequenz einen 15% Glycerinbestand an yAFM-RE oder yLFM-RE Dehnungskultur (in YPDA) machen und bei -80 °C lagern.

2. Bewertung der Transaktivierungsfähigkeit des P53-Proteins mit dem qualitativen farbbasierten ADE2-Hefetest

  1. Wiederholen Sie die Schritte 1.1 und 1.2 mit dem yAFM-RE Stamm (Tabelle 1).
  2. Am Tag danach die Zellkultur (1:10) in 30-50 ml vorgewärmter YPDA verdünnen und bei 30 °C durch Schütteln weiter inkubieren, bis die OD600nm 0,8-1,0 erreicht.
  3. Wiederholen Sie die Schritte 1.5-1.10.
  4. In einem separaten 1,5 ml-Rohr 300-500 ng Hefe-P53-Expressionsvektor (oder Kontroll-Expressionsvektor) hinzufügen (Tabelle 4), 5 l des gekochten Lachs-Sperma-DNA-Trägers, 300 l steriler LiAcTE PEG und 50 l Hefezellsuspension.
  5. Wiederholen Sie die Schritte 1.12 und 1.13, aber setzen Sie das Zellpellet in 300 l sterilem Wasser wieder auf.
  6. Verteilen Sie 100 l der Zellsuspension auf synthetische selektive (für P53-Expression oder Kontrollvektor) Platten, die Dextrose als Kohlenstoffquelle und hohe Menge an Adenin enthalten (Tabelle 2), und dann 2-3 Tage bei 30 °C inkubieren (umgedreht).
  7. Streifen einzelne Hefe transformant Kolonien (2-6 Streifen pro Platte) auf einer neuen selektiven Platte und lassen Sie sie über Nacht bei 30 °C wachsen.
  8. Am Tag danach, mit sterilen Samt Replik Platte auf neue selektive Platten, die für die Beurteilung der Farbe Phänotyp ermöglichen (d. h. Platten mit Dextrose als Kohlenstoffquelle, aber Begrenzung der Menge an Adenin; Tabelle 2). Die Platten 3 Tage lang bei 30 °C auf den Kopf stellen. Optional, um die Temperaturempfindlichkeit von P53-Protein zu bewerten, inkubieren bei drei verschiedenen Temperaturen für 3 Tage: 24 °C, 30 °C und 37 °C.
    HINWEIS: Derselbe Streifen kann mehrmals nachgebaut werden.
  9. Um die Transaktivierungsfähigkeit des P53-Proteins zu bewerten, überprüfen Sie den farbbasierten Phänotyp von Hefekolonien und vergleichen Sie den P53-Protein-Phänotyp in Bezug auf P53-Wildtyp- und leere Vektor-Phänotypen.

3. Bewertung der Transaktivierungsfähigkeit von P53-Proteinen mit dem quantitativen Lumineszenz-basierten LUC1-Hefetest

  1. Transformieren Sie Hefezellen mit P53-Expressionsvektoren (oder Steuerelementen) (Tabelle 4) mithilfe der LiAc-basierten Methode, die in Protokoll 2 beschrieben ist. Verwenden Sie yLFM-RE-Stamm (Tabelle 1).
  2. Einzelne Transformanten auf einer neuen selektiven Platte mit der hohen Menge an Glukose enthaltendem Adenin als Kohlenstoffquelle aufflicken und über Nacht bei 30 °C wachsen lassen. Erstellen Sie für jeden Transformationstyp 5-7 verschiedene Patches.
  3. Nach dem über Nacht Wachstum, resuspendieren Sie eine kleine Menge von Hefezellen mit einem sterilen Zahnstocher oder Pipettenspitze von der Platte in synthetischen selektiven Medium mit Dextrose oder Raffinose als Kohlenstoffquelle (200 l Endvolumen in einer transparenten 96-Well-Platte, mit einer runden oder flachen Boden). Wenn das Experiment eine induzierbare P53-Expression erfordert, fügen Sie dem Raffinosemedium Galaktose hinzu, um den Induktionsgrad zu modulieren (Tabelle 2).
    HINWEIS: Diese Zellsuspensionen sollten eine OD600nm von etwa 0,4 und nicht höher als 1 haben.
  4. Messen Sie die Absorption jedes Brunnens bei OD600nm nach induzierbarem P53-Ausdruck (4-8 h bei 30°C bei 150-200 Rprossen) mit einem Multilabel-Plattenleser. Stellen Sie sicher, dass die Zellsuspensionen homogen sind, indem Sie jeden Brunnen mit einer Mehrkanalpipette mischen.
  5. 10-20 l Zellsuspension von der transparenten 96-Wellplatte in eine weiße 384 (oder 96) Wellplatte übertragen und mit einem gleichen Volumen (10-20 l) Lysepuffer mischen. 10-15 min bei RT auf einem Shaker (150-200 Rpm) inkubieren, um eine Permeabilisierung der Zelle auf das Luziferasesubstrat zu erreichen.
  6. Fügen Sie 10-20 L Firefly-Luziferase-Substrat hinzu und messen Sie die Lichteinheiten (LU) durch einen Multi-Label-Plattenleser.
  7. Um die Transaktivierungsfähigkeit des P53-Proteins zu bestimmen, normalisieren Sie die LUs jedes Brunnens auf die entsprechende OD600nm (relative Lichteinheit, RLU). Berechnen Sie die durchschnittliche RLU und Die Standardabweichung von 3-4 Flecken Hefetransformant Kolonien.
  8. Vergleichen Sie die P53-Protein-Transaktivierungsdaten in Bezug auf P53-Wildtyp und leeren Vektor, entweder durch Subtrahieren der mit dem leeren Vektor erhaltenen Werte oder durch die Division durch die Werte, die mit dem leeren Vektor (d. h. Rechenfalte der Induktion) erhalten wurden.
    HINWEIS: Die Transaktivierungsaktivität P53 kann auch mit demselben Versuchsaufbau in Gegenwart von P53-interagierenden Proteinen (d. h. MDM2 und MDMX) und/oder einschließlich medikamentöser Behandlung bewertet werden.

4. Bewertung der P53-Proteinwachstumshemmung mit dem Hefe-Phänotyppicken-Assay

  1. Transformieren Sie Hefezellen mit P53/MDM2/MDMX(oder Steuer-) Expressionsvektoren (Tabelle 4) mit der liAc-basierten Methode, die in Abschnitt 2 beschrieben wird. Verwenden Sie den Stamm CG379 (Tabelle 1) und verteilen Sie Hefetransformationants auf minimal selektiven Platten (Tabelle 2).
  2. Wachsen Sie transformierte Zellen in minimalem selektiven Medium (Tabelle 2) auf ca. 1 OD600nm.
  3. Verdünnn Sie Hefezellen auf 0,05 OD600nm im selektiven Induktionsmedium (Tabelle 2), und fügen Sie optional ein ausgewähltes kleines Molekül der entsprechenden Konzentration (oder nur Lösungsmittel) hinzu, um ihre Wirksamkeit bei der Reaktivierung des Mutmittels P53 oder bei der Hemmung von MDM2- /MDMX-P53-Interaktionen.
  4. Inkubieren Sie Zellen bei 30 °C unter kontinuierlichem Orbitalschütteln (200 U/min) für ca. 42 h (Zeit, die von Negativkontrollhefe benötigt wird, um die Mid-Log-Phase zu erreichen, ca. 0,45 OD600nm).
  5. Spot 100 L Aliquots von Hefezellkulturen auf minimalen selektiven Platten (Tabelle 2).
  6. 2 Tage bei 30 °C inkubieren.
  7. Messen Sie das Hefewachstum, indem Sie die Anzahl der Kolonien zählen, die in den 100-L-Kulturtropfen (Koloniebildeinheit, KBE-Zahlen) erhalten wurden. Berechnen Sie z. B. die mutierte reaktivierende Wirkung von Verbindungen, wobei das Wachstum von Wildtyp P53, der Hefe als maximal möglichen Effekt ausdrückt (auf 100% eingestellt), während das Wachstum von Zellen, die mutierteP53 (aber der Lösungsmittelkontrolle ausgesetzt) die Null-Stufe der Reaktivierung.

Ergebnisse

Bau von ADE2 oder LUC1 Reporter Hefe-Stämme

Derdelitto perfettoapproach12,14,15,16 wurde angepasst, um den Bau von P53 Reporter Hefestämmen zu ermöglichen ( Abbildung1...

Diskussion

Hefebasierte Assays haben sich als nützlich erwiesen, um verschiedene Aspekte der P53-Proteinfunktionen zu untersuchen. Diese Assays sind besonders empfindlich für die Bewertung des P53-Transaktivierungspotenzials gegenüber Varianten von RE-Zielstandorten, einschließlich der Bewertung funktioneller Polymorphismen. Der Einsatz von Farbreportern sowie die Miniaturisierung des Luziferase-Assays führen zu kostengünstigen und relativ skalierbaren Assays. Außerdem ist der Wachstumsinhibitionstest potenziell für den Ein...

Offenlegungen

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Danksagungen

Wir danken der Europäischen Union (FEDER-Fonds POCI/01/0145/FEDER/007728 durch Programa Operacional Factores de Competitividade - COMPETE) und nationalen Fonds (FCT/MEC, Fundaéo para a Ciéncia e Tecnologia und Ministério da Educaéo e Ciéncia) unter der Partnerschaftsabkommen PT2020 UID/QUI/50006/2019 und die Projekte (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014 - POCI-01-0145-FEDER-016581. FCT-Stipendien: SFRH/BD/96189/2013 (S. Gomes). Diese Arbeit wurde von der Compagnia S. Paolo, Turin, Italien (Projekt 2017.0526) und dem Gesundheitsministerium(Projekt 5x1000, 2015 und 2016; aktuelle Forschung 2016) unterstützt. Wir danken Dr. Teresa Lépez-Arias Montenegro (Universität Trient, Lehrlaboratorien für experimentelle Wissenschaften) für die Unterstützung bei der Videoaufzeichnung.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
L-Aspartic acidSIGMA11189
QIAquick PCR Purification KitQIAGEN28104
L-PhenylalanineSIGMA78019
PeptoneBD Bacto211677
Yeast ex+A2:C26tractBD Bacto212750
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium SulfateBDTM233520
Lithium Acetate DihydrateSIGMA517992
Bacteriological Agar Type ABiokar DiagnosticsA1010 HA
G418 disulfate saltSIGMAA1720
Ammonium SulfateSIGMAA2939
L-Arginine Monohydro-chlorideSIGMAA5131
Adenine Hemisulfate SaltSIGMAA9126
Passive Lysis Buffer 5xPROMEGAE1941
Bright-Glo Luciferase Assay System PROMEGAE2620
5-FOAZymo ResearchF9001
D-(+)-GalactoseSIGMAG0750
L-Glutamic acidSIGMAG1251
Dextrose SIGMAG7021
L-HistidineSIGMAH8125
L-IsoleucineSIGMAI2752
L-LysineSIGMAL1262
L-LeucineSIGMAL8000
L-MethionineSIGMAM2893
PEGSIGMAP3640
D-(+)-Raffinose PentahydrateSIGMAR0250
L-SerineSIGMAS4500
L-TryptophanSIGMAT0271
L-ThreonineSIGMAT8625
UracilSIGMAU0750
L-ValineSIGMAV0500

Referenzen

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