JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

وتعرض هذه الورقة على بروتوكول لاكتشاف المصل على حدة كريين مناعي ه مع نظام القائم على خرطوشة تشيميلومينيسسينسي موائع جزيئية وتقييم فائدتها في تشخيص الحساسية.

Abstract

أمراض الحساسية أمر شائع في كل من البالغين والأطفال. تحديد مسببات الحساسية المسببة مهم في علاج المرض والوقاية منه. ومع ذلك، التي تفتقر إلى نظام الغلوبولين مناعي محددة لقياس ه (IgE) مع نسبة ارتفاع أسعار-أداء في البر الرئيسي للصين، وبخاصة في مستشفيات الرعاية الصحية الأولية. وتصف هذه الورقة إجراءات المبدأ وتشغيلها باستخدام نظام تشيميلومينيسسينسي المستندة إلى خرطوشة موائع جزيئية للكشف عن حساسية خاصة فريق الخبراء الحكومي الدولي في المصل. تم مقارنة النتائج مع أولئك من إيمونوكاب (نظام 1)، المعيار الصناعي، ويتم تقييم إمكانية تكرار نتائج نظام للكشف عن المرضى توعيتهم بالمواد المسببة للحساسية شيوعاً. وأظهرت النتائج أن "نظام بيوايك" (نظام 2) بالمقارنة مع إيمونوكاب (نظام 1)، قد حسن دقة وحساسية في الكشف عن فريق الخبراء الحكومي الدولي الخاصة بمصل ضد حساسية المستنشق والأغذية المختلفة ولكن بتكلفة أقل بكثير. أنه يمكن أن تكون بمثابة بديل جيد للنظام 1 في الرعاية الصحية الأولية في المستشفيات في البر الرئيسي للصين الذين لديهم القدرة على تحمل التكاليف المالية أقل.

Introduction

انتشار الحساسية زيادة مطردة في العقود الماضية وهي تؤثر على 20% إلى 30% من سكان العالم1. تحديد مسببات الحساسية المسببة له مغزى هام في إدارة الأمراض. وفي الصين، حيث لا تتوفر اختبارات وخز الجلد المجراة في المسجلين في البلاد والعزم في المختبر لفريق الخبراء الحكومي الدولي الخاصة بمصل الدم هو أهم أداة شائعة الاستخدام للنوع الأول من الحساسية تشخيص2. هذا مماثل للممارسات في العالم الغربي، ولكن على الرغم من أن نظام إيمونوكاب (نظام 1)، نظام قاعدة المرتبط بالانزيم الممتز الأسفار، يعتبر بمثابة المعيار الذهبي ل تشخيص الحساسية في المختبر3، استعماله في الصين محدودة للغاية الواجب إلى ارتفاع سعره المعدات وكاشف. ومن ثم هو حاجة ماسة إلى نظام جديد لتشخيص الحساسية بديلة مع نسبة ارتفاع أسعار-أداء.

النظام بيويك (نظام 2) نظام قائم على خرطوشة موائع جزيئية استناداً إلى مبدأ تشيميلومينيسسينسي لفحوصات متعدد لفريق الخبراء الحكومي الدولي الخاصة بالمصل. مع حجم 7 سم × 4 سم، يتألف من ثلاث طبقات من البلاستيك حقن مصبوب خرطوشة موائع جزيئية. الجزء العلوي هو 3 مم سميكة شفافة البولي الذي يحمل الاستقرار جيدة أثناء العمليات الحرارية في الجمعية العامة. جنبا إلى جنب مع الطبقة 3 مم سميكة القاع شيدت من كوبوليمر بوتادين أكريلونيتريل والستيرين (ABS)، فإنه السندويشات 0.5 mm سميكة طبقة وسطى مصنوعة من المطاط سيليكون. يجري سوداء اللون، طبقة وسطى يقدم الخلفية السفلي أثناء الكشف عن تشيميلومينيسسينسي. على رأس هلام السليكا، يتم رش طبقة رقيقة من النيتروسليلوز الغشاء (غشاء NC) في الموضع المقابل لمنطقة رد الفعل، مما يسمح اكتشاف البروتينات المسببة للحساسية المختلفة. والغرض من هذه الدراسة تقييم أداء نظام موائع جزيئية لتحديد متعدد لفريق الخبراء الحكومي الدولي الخاصة بالحساسية في مصل الدم السريرية.

Protocol

وقد أقر هذه الدراسة واستخدام عينات مصل الدم البشري لجنة الأخلاقيات التابعة لجامعة "الأولى التابعة للمستشفى من قوانغتشو الطبية" (جييي-2016-73). جميع المشاركين أعطت موافقتها الخطية بشكل مستقل أو عن طريق آبائهم (في حالة الأطفال).

1-الأساسية من المعلومات من فريق الدراسة

ملاحظة: "مستودع معلومات الحساسية" الدولة مفتاح المختبر من أمراض الجهاز التنفسي (الهواء-سكلرد) بنك كبير مصل المنشأة داخل مستشفى "معهد قوانغتشو للجهاز التنفسي" (جيرة). بدأ في العقد الماضي، الهواء-سكلرد بدأ بالفعل لجمع وتخزين عينات المصل من المرضى الذين يعانون من أمراض الحساسية، جنبا إلى جنب مع تلك المعلومات السريرية (الجدول 1)4،5. وأجرى الدراسة الحالية مع الأمصال من الهواء-سكلرد.

  1. البحث في قاعدة الجوية سكلرد للأمصال التي تم جمعها من عام 2015 في كانون الثاني/يناير إلى حزيران/يونيه عام 2018، وتحديد المرضى الذين يعانون من أمراض الحساسية، الذي وجد أن الحساسية لمسببات الحساسية الشائعة في المنطقة.
  2. ضمان أن جميع المرضى المحدد لها الأمراض المتصلة بالحساسية، مثل حساسية الآنف والربو، والتهاب الجلد التحسسي، أو الشرى، ويحتوي المصل من هؤلاء المرضى متعددة مصل الغلوبولين المناعي ه (sIgE) الخاصة بالحساسية إباحة لمسببات الحساسية الشائعة في هذه المنطقة، والكشف عنها بواسطة 1 النظام.
  3. استبعاد المرضى الذين يعانون من عدم اكتمال السجلات الطبية، الذين فقدوا من المتابعة، أولئك الذين يرفضون إعطاء الموافقة عن علم فيما يتعلق باستخدام عينات مصلية بهم للأغراض العلمية، والمصابين نقص المناعة المكتسب التي تم تحديدها، وتلك الموجودة حاليا في العلاج المناعي أو وكلاء إيمونومودولاتوري، أو تلك التي تبين أن الإصابات الطفيلية.
  4. ضمان لا توجد وصفه العلاج أو المخدرات أعطيت قبل جمع المصل بغية التقليل إلى أدنى حد من التدخل للنتائج المختبرية. وقد رفضت جميع عينات مصل الدم التي لا تفي بالمعايير.

2-دراسة تدفق وقياسات للفائدة

ملاحظة: يحتاج نظام موائع جزيئية 100 ميليلتر من المصل لتحديد حساسية 19. وجمعت وريدي الدم (5 مل) من كل مريض باستخدام الأوعية الدموية فراغ الذي يحتوي على جل فصل. بعد سينتريفوجينج لمدة 10 دقائق في 1,000 س ز، جمعت الطبقة العليا للاختبار. تم تخزين المصل غير مستخدمة في-80 درجة مئوية. قبل الاختبار، المصل أبقى في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة، وقد اهتزت مع خلاط دوامة. تم تجنب تكرار دورات التجميد والذوبان.

  1. أساسا اختبار عينات مصلية سيجيس للحساسية كله من بر القط (e1)، تروبيكاليس بلوميا (d201)، والكلب بر (e5)، برمودا العشب (g2)، بتيرونيسينوس ديرماتوفاجويديس (d1)، فاريناي ديرماتوفاجويديس (d2)، تيموثي العشب ( g6)، الصراصير (i6)، رشاشيه دخناء (م 3)، المبيضات البيض (m5)، السجاد (w1)، البيض الأبيض (f1)، الحليب (f2)، القمح (f4) والفول السوداني (f13)، فول الصويا (f14)، اللوز (f20)، السلطعون (f23)، والجمبري (f24). اتبع التعليمات الواردة في القسم 3.
    ملاحظة: تحديد sIgE فعل مع فريق الخبراء الحكومي الدولي الخاصة بحساسية المقايسة كيت (انظر الجدول للمواد)، وقياس هو محلل تشيميلومينيسسينسي.
  2. حدد ثلاث عينات من بين العينات مع مصل كافية (على الأقل 900 ميليلتر) لدراسة إمكانية تكرار نتائج عشوائياً. حفظ جميع الظروف لم تتغير، قياس الأمصال الثلاثة لحساسية سيجس يوميا لمدة 9 أيام متتالية (أي ما مجموعة 100 × 9 = 900 ميليلتر مصل).

3-إجراء الاختبار شبه التشغيل الآلي لنظام موائع جزيئية

ملاحظة: 2 النظام هو إدماج التكنولوجيا موائع جزيئية التلقائي، ميكرواري البروتين، تحليل الضوء الباردة، تحليل فريق الخبراء الحكومي الدولي الموازي، وتكنولوجيا تجهيز الصورة. بروتوكول الاختبار ينقسم إلى أربعة أجزاء: إعداد المعدات وتحميل عينة، والحضانة، والقياس.

  1. إعداد المعدات
    1. قم بتشغيل جهاز الكمبيوتر وقوة محلل.
      ملاحظة: مفتاح الطاقة على الجانب الأيمن القاعدة.
    2. بدء تشغيل البرنامج ﻻبيت على جهاز الكمبيوتر. إذا كان إطار تحذير الإطار الظلام للملوثات العضوية الثابتة، انقر فوق موافق لتشغيل اختبار تسرب. بعد ذلك، انقر على شعار مركز لإدخال واجهة العملية.
      ملاحظة: سوف أذكر هذا النظام للمستخدم بتشغيل اختبار تسرب إذا كان خاملاً لأكثر من 24 ساعة.
    3. تحقق من رد فعل درجة الحرارة واتفاقية مكافحة التصحر (جهاز) Temp في الزاوية اليمنى السفلي من الشاشة. ينبغي أن ترتفع "درجة الحرارة رد فعل" إلى 37 درجة مئوية ± 1 درجة مئوية في حوالي 10 دقائق، وينبغي إسقاط Temp اتفاقية مكافحة التصحر إلى-15 درجة مئوية ± 1 درجة مئوية.
    4. تشغيل اختبار تسرب بعد أن انخفضت درجة الحرارة اتفاقية مكافحة التصحر إلى-15 درجة مئوية ± 1 درجة مئوية. قبل تشغيل اختبار تسرب، تأكد من عدم وجود أي عناصر أخرى تركت في داخل الصك وإغلاق الباب. انقر فوق أدوات | اختبار النظام | اختبار تسرب. لا تفتح الباب أثناء الاختبار. عند الانتهاء من الاختبار، وسوف يطفو إطار التقرير.
  2. تحميل عينة
    1. إضافة ميليلتر 620 المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي، ميليلتر 120 من المخزن المؤقت لحظر، 60 ميليلتر من يصرف ب 60 ميليلتر من الركازة A و B، و 100 ميليلتر من عينات المصل إلى خزان كاشف المقابلة على خرطوشة موائع جزيئية.
  3. الحضانة
    1. انقر فوق معرف خرطوشةواستخدام الماسح الضوئي الباركود لتفحص الرقم التسلسلي للخرطوشة وأدخل معرف عينة، وضع الخرطوشة في المحلل وإغلاق الباب، وانقر فوق محلل و تشغيل لبدء التحليل.
  4. قياس
    1. تصدير النتائج إلى البرامج الإحصائية (Excel مثلاً) بعد القياس.
      ملاحظة: بعد 30 دقيقة من الحضانة، المحلل تلقائياً يقوم بالقياس وتقارير النتيجة.
  5. التبديل بين الخروج من محلل
    1. للصيانة الروتينية، بعد الانتهاء من الاختبار، قم بإزالة الخرطوشة ومسح الحديد التدفئة الداخلية للمحلل ومغناطيس طفيفة مع الكحول 75%.
      ملاحظة: لا الضغط الثابت أو هزة المغناطيس الكهربائي.
    2. قم بإغلاق إطار ﻻبيت. سوف يطفو على السطح نافذة مراقبة درجة الحرارة. فإنه سيتم تلقائياً إغلاق عند دفء اتفاقية مكافحة التصحر لوضع الحماية 5 درجة مئوية. وبحلول ذلك الوقت، سيكون من آمنة إيقاف الطاقة محلل وجهاز الكمبيوتر.
      ملاحظة: لا تقم بإغلاق يدوياً درجة الحرارة رصد نافذة قبل Temp اتفاقية مكافحة التصحر قد ارتفع إلى 5 درجة مئوية، وعدم إيقاف الطاقة للمحلل ولا جهاز الكمبيوتر أثناء الاحماء اتفاقية مكافحة التصحر.

4-تعريف مفاعليه sIgE

ملاحظة: عينة مصل غير مخفف، هو الكشف عن نطاق 2 نظام 0.21 – 100 وحدة دولية/مل.

  1. استناداً إلى قيمة عتبة 0.35 وحدة دولية/مل، النظر إلى مستوى sIgE تتجاوز 0.35 وحدة دولية/مل أن تكون إيجابية6،7. معدل مفاعليه الاختبارات sIgE ك8: الفئة 1 (≥0.35 و < 0.70 وحدة دولية/مل)، الطبقة 2 (≥0.70 و < 3.50 وحدة دولية/مل)، الفئة 3 (≥3.50 و < 17.50 وحدة دولية/مل)، الفئة 4 (≥17.50 و < 50.00 وحدة دولية/مل)، الفئة 5 (≥50.00 و < 100.00 وحدة دولية/مل) ، والفئة 6 (≥100.00 وحدة دولية/مل).

5-إحصائية تحليل

  1. استخدام الرسم بياني لإظهار معدل إيجابي لحساسية 19 (الشكل 1) واستخدام المنحنى جينينغز ليفي لإثبات التكرار ل الكشف عن نظام (الشكل 2)9.
  2. حدد الثلاث الأكثر شيوعاً حساسية مواد التنشق وحساسية الطعام (في المجموع، حساسية الست)، ومقارنة النتائج بانا 1 نظام تقييم الأداء التشخيصي السريري10،11. وتشمل نسبة التوافق وحساسية وخصوصية، والقيم التنبؤية الإيجابية والسلبية والمنطقة الخاضعة للمتلقي تشغيل خاصية (ROC) المنحنى (AUC) كمعيار للتقييم.
  3. تطبيق سبيرمان لارتباط التحليل12 لوصف العلاقات المتبادلة بين النظامين واستخدم قيمة كابا للاتساق. تصنيف القيمة كابا تقريبا مثالية (0.8-1.0)، والكبيرة (0.6-0.8)، معتدلة (0.4 – 0.6)، ومعرض (0.2-0.4)، أو الفقراء (< 0.2)13. استخدام التحليل الإحصائي SPSS 23.0 و MedCalc 11.0 وتعريف ف < 0.05 كدلالة إحصائية.

النتائج

معدلات إيجابية للحساسية مشتركة 19
يتم إظهار النتائج في الأمصال 293 في الشكل 3. بين جميع الحساسية الاستنشاق، فاريناي دال- حققت أعلى معدل الإيجابية (80.89%، 273/293)، تليها دال بتيرونيسينوس (78.84%، 231/293). بين حساسية الطعام، كراب لديها أعلى معدل...

Discussion

مماثلة للنتائج من العديد من الدراسات الأخرى15،16،17، النتائج من نظام موائع جزيئية استناداً إلى الأمصال من مرضى حساسية 293 أظهرت أن منزل الغبار العث (بما في ذلك بتيرونيسينوس د، فاريناي د، و تروبيكاليس باء) هي حساسية مواد التنشق...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون أستاذ مي جيانغ لمساعدتها في التحليل الإحصائي والسيد المطرقة تسوى في إعداد المخطوطة. هذه الدراسة أيده قوانغتشو العلم والتكنولوجيا مؤسسة (201804020043) والوطنية العلوم الطبيعية مؤسسة في الصين (81572063 تشرف وتشرف 81802076). مجموعات التمويل المتفق عليها مع تصميم الدراسة، وتحليل البيانات وإعداد مخطوطة، وقرار نشر. لم ترد أي تمويل آخر لهذه الدراسة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Agnitio BioIC AnalyzerAgnitio Science & Technology(Taiwan, China)BA-G2000
BioIC Allergen specific-IgE Detection KitAgnitio Science & Technology(Taiwan, China)DR17A12
BioIC Cartrideg Placement plateAgnitio Science & Technology(Taiwan, China)T20SET
BioIC Reagent DispenserAgnitio Science & Technology(Taiwan, China)DS-1
Image two-dimensional barcode machineAgnitio Science & Technology(Taiwan, China)NLS-HR200
Software Package, LabITAgnitio Science & Technology(Taiwan, China)Version 2.4.12
VORTEX-5 Vortex MixerHaimen Kylinbell Lab Lastruments Co., Ltd.VORTEX-5

References

  1. Kamble, S., Bharmal, M. Incremental Direct Expenditure of Treating Asthma in the United States. Journal of Asthma Research. 46 (1), 73-80 (2009).
  2. Paganelli, R., et al. Specific IgE antibodies in the diagnosis of atopic disease. Clinical evaluation of a new in vitro test system, UniCAP, in six European allergy clinics. Allergy. 53 (8), 763-768 (1998).
  3. Wang, J., Godbold, J. H., Sampson, H. A. Correlation of serum allergy (ige) tests performed by different assay systems. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 121 (5), 1219-1224 (2008).
  4. Sun, B., Zheng, P., Wei, N., Huang, H., Zeng, G. Co-sensitization to silkworm moth (Bombyx mori) and 9 inhalant allergens among allergic patients in Guangzhou, Southern China. PLoS ONE. 9 (5), e94776 (2014).
  5. Zeng, G., et al. Component-Resolved Diagnostic Study of Dermatophagoides Pteronyssinus Major Allergen Molecules in a Southern Chinese Cohort. Journal of Investigational Allergology & Clinical Immunology. 25 (5), 343-351 (2015).
  6. Luo, W., et al. grass pollen allergens and components detected in a southern Chinese cohort of patients with allergic rhinitis and/or asthma. Molecular Immunology. 78 (2016), 105-112 (2016).
  7. Zeng, G., et al. Longitudinal profiles of serum specific IgE and IgG4 to Dermatophagoides pteronyssinus allergen and its major components during allergen immunotherapy in a cohort of southern Chinese children. Molecular Immunology. 74 (2016), 1-9 (2016).
  8. Lee, J. H., et al. Specific IgE measurement using AdvanSure(R) system: comparison of detection performance with ImmunoCAP(R) system in Korean allergy patients. Clinica Chimica Acta. (9-10), 914-919 (2012).
  9. Eckels, J., et al. Quality control, analysis and secure sharing of Luminex(R) immunoassay data using the open source LabKey Server platform. Bmc Bioinformatics. 14 (1), 145 (2013).
  10. Bland, J. M., Altman, D. G. Statistical methods for assessing agreement between two methods of clinical measurement. Lancet. 327 (8476), 307-310 (1986).
  11. Carletta, J. Assessing Agreement on Classification Tasks: The Kappa Statistic. Computational Linguistics. 22 (2), 249-254 (1996).
  12. Shyur, S. D., et al. Determination of multiple allergen-specific IgE by microfluidic immunoassay cartridge in clinical settings. Pediatric Allergy and Immunology. 21, 623-633 (2010).
  13. Cesana, B. M., Antonelli, P., Gallazzi, E., Marino, A. Comparison of measurement methods: an endless application of wrong statistical methods. Intensive Care Medicine. 37 (6), 1038-1040 (2011).
  14. Park, K. H., Lee, J., Sim, D. W., Lee, S. C. Comparison of Singleplex Specific IgE Detection Immunoassays: ImmunoCAP Phadia 250 and Immulite 2000 3gAllergy. Annals of Laboratory Medicine. 38 (1), 23-31 (2018).
  15. Teppo, H., Revonta, M., Haahtela, T. Allergic rhinitis and asthma have generally good outcome and little effect on quality of life - a 20-year follow-up. Allergy. 66 (8), 1123-1125 (2011).
  16. Fischer, J., et al. Prevalence of type I sensitization to alpha-gal in forest service employees and hunters. Allergy. 72 (10), 1540-1547 (2017).
  17. Li, J., et al. A multicentre study assessing the prevalence of sensitizations in patients with asthma and/or rhinitis in China. Allergy. 64 (7), 1083-1092 (2009).
  18. Ahlstedt, S. Understanding the usefulness of specific IgE blood tests in allergy. Clinical & Experimental Allergy. 32 (1), 11-16 (2002).
  19. Wood, R. A., Segall, N., Ahlstedt, S., Williams, P. B. Accuracy of IgE antibody laboratory results. Annals of Allergy Asthma & Immunology. 100 (2), 288-289 (2008).
  20. Aberer, W., Kränke, B., Hager, A., Wick, G. In vitro allergy testing needs better standardization--test results from different laboratories lack comparability mostly due to missing effective standards. International Archives of Allergy & Immunology. 108 (1), 82-88 (1995).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

146

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved