Application des biopuces microfluidiques technologie pour détecter sérum allergène spécifique immunoglobuline E (sIgE)

Résumé

Cet article présente un protocole pour la détection des immunoglobulines sériques spécifiques E avec un système de chimiluminescence axée sur la cartouche microfluidique et l’évaluation de son utilité dans le diagnostic de l’allergie.

Résumé

Maladie allergique est fréquente chez les adultes et les enfants. Identification des allergènes causatifs est importante dans la prévention et la gestion de la maladie. Toutefois, un système de mesure spécifique de l’immunoglobuline E (IgE) avec un rapport coût-performances fait défaut en Chine continentale, en particulier dans les hôpitaux de soins de santé primaires. Cet article décrit les principe et le fonctionnement des procédures d’utiliser un système de chimiluminescence axée sur la cartouche microfluidique pour détecter l’allergène spécifique IgE dans le sérum. Les résultats ont été comparés avec ceux d’ImmunoCAP (système 1), la norme de l’industrie, et la reproductibilité du système pour détecter les patients sensibilisés aux allergènes courants est évaluée. Les résultats ont montré que, en comparaison avec ImmunoCAP (système 1), le système BioIC (système 2) a bonne précision et sensibilité dans la détection des IgE sériques spécifiques contre différents allergènes respiratoires et alimentaires, mais avec un coût nettement inférieur. Il peut servir comme une bonne alternative au système 1 dans les hôpitaux de soins de santé primaires en Chine continentale qui ont la plus faible financièrement abordables.

Introduction

La prévalence des allergies a augmenté régulièrement au cours des dernières décennies et touche 20 % - 30 % de la population mondiale¹. Identification des allergènes responsables a une importance dans la gestion des maladies. En Chine, étant donné que la peau in vivo enregistré prick tests ne sont pas disponibles dans le pays, la détermination in vitro de IgE sériques spécifiques est le plus important et un outil couramment utilisé pour les allergies de type I diagnostique². Ceci est similaire aux pratiques dans le monde occidental, mais bien que ImmunoCAP système (système 1), un système de base d’immuno-fluorescence, est perçu comme l’étalon-or pour allergie in vitro diagnostic³, son utilisation en Chine est très limitée dû à son prix élevé de l’équipement et réactif. Par conséquent, un nouveau système de diagnostic d’allergie alternative avec un rapport coût-performances est absolument nécessaire.

Le système BioIC (système 2) est un système microfluidique cartouche basé sur le principe de la chimiluminescence pour des dosages d’IgE sériques spécifiques multiplexés. Avec une taille de 7 cm x 4 cm, la cartouche microfluidique est composée de trois couches de plastique moulé par injection. La partie supérieure est polycarbonate transparent de 3 mm d’épaisseur qui assure la bonne stabilité au cours du processus d’assemblage thermique. Avec la couche de 3 mm d’épaisseur inférieure, construite à partir d’un copolymère d’acrylonitrile, butadiène et styrène (ABS), il sandwichs le 0.5 mm d’épaisseur couche intermédiaire en caoutchouc de silicone. Couleur noire, la couche intermédiaire propose fond inférieur lors de la détection par chimiluminescence. Surface du gel de silice, une fine couche de membrane de nitrocellulose (membrane NC) est pulvérisée à la position correspondant à la zone de réaction, ce qui permet le repérage des différentes protéines allergènes. Le but de cette étude est d’évaluer les performances cliniques du système microfluidique permettant de déterminer l’allergène spécifique IgE dans le sérum multiplexé.

Protocole

Cette étude et l’utilisation des échantillons sériques ont été approuvées par le Comité d’éthique de l’université le premier affilié hôpital de Guangzhou Medical (VJJJ-2016-73). Tous les participants ont donné leur consentement écrit indépendamment ou par l’intermédiaire de leurs parents (dans le cas des enfants).

1. Généralités au groupe d’étude

Remarque : Le référentiel d’Information allergie de l’état laboratoire clé des maladies respiratoires (AIR-SKLRD) est une banque de sérums grand établie à l’intérieur de l’hôpital de Guangzhou Institute of Respiratory (GIRH). Lancé dans la dernière décennie, l’AIR-SKLRD a déjà commencé à recueillir et stocker des échantillons de sérum provenant de patients atteints de maladies allergiques, ainsi que leurs renseignements cliniques (tableau 1)^4,5. La présente étude a été réalisée avec des sérums provenant de l’AIR-SKLRD.

1. Recherche base de données de l’AIR-SKLRD pour les sérums prélevés de 2015 de janvier à juin 2018 et sélectionner les patients atteints de la maladie allergique, qui se sont révélés sensibles aux allergènes communs dans la région.
2. Assurez-vous que tous les patients sélectionnés ont des maladies allergiques liées, telles que la rhinite allergique et l’asthme, dermatite allergique, ou urticaire, et que le sérum de ces patients contienne plusieurs immunoglobulines de l’allergène spécifique sérum E (sIgE) sensibilisations des allergènes courants dans cette région, détectés par le système 1.
3. Exclure les patients avec des dossiers médicaux incomplètes, ceux perdus de vue, ceux qui refusent de donner leur consentement éclairé concernant l’utilisation de leurs échantillons de sérum à des fins scientifiques, ceux avec une immunodéficience identifié, ceux actuellement sur l’immunothérapie ou des agents immunomodulateurs, ou ceux qui présentent des infections parasitaires.
4. Assurer qu'aucune prescription de traitement ou de la drogue a été donnée avant la collecte de sérum afin de minimiser les interférences pour les résultats de laboratoire. Tous les échantillons de sérum qui ne remplissent pas les critères ont été rejetées.

2. Etude des flux et des mesures d’intérêt

Remarque : Le système microfluidique doit 100 µL de sérum pour la détermination de 19 allergènes. Sang veineux (5 mL) ont été prélevé de chaque patient à l’aide d’un vaisseau sanguin sous vide contenant du gel de séparation. Après centrifugation pendant 10 min à 1 000 x g, la couche supérieure a été recueillie pour être analysés. Sérum inutilisé a été stocké à-80 ° C. Avant l’essai, le sérum a été maintenu à température ambiante pendant 30 min et a été secoué par un vortex. Les cycles de gel-dégel répétés ont été évitées.

1. Principalement de tester les échantillons de sérum de sIgEs aux allergènes entiers de Dermatophagoides pteronyssinus (d1), Dermatophagoides farinae (d2), Blomia tropicalis (d201), poils de chat (e1), poils de chien (e5), herbe des Bermudes (g2), timothy grass) G6), blattes (i6), Aspergillus fumigatus (m3), Candida albicans (m5), herbe à poux (w1), blanc de œuf (f1), lait (f2), blé (f4), arachide (f13), soja (f14), amande (f20), crabe (f23) et crevette (f24). Suivez les instructions indiquées au point 3.
   NOTE : sIgE dosage a été fait avec l’IgE allergène spécifique test kit (voir la Table des matières) et mesurée par un analyseur à chimiluminescence.
2. Choisir au hasard trois échantillons parmi les échantillons avec suffisant (au moins 900 µL) de sérum pour une étude de reproductibilité. Garder toutes les conditions inchangées, mesurer les trois sérums pour sIgEs allergène par jour pendant 9 jours consécutifs (soit un total de 100 x 9 = 900 µL de sérum).

3. procédure d’essai semi automatisation du système microfluidique

Remarque : Le système 2 est l’intégration d’une technologie automatique microfluidique, microarray de protéine, lumière froide analyse, analyse IgE parallèle et technologie de traitement d’image. Le protocole d’essai est divisé en quatre parties : préparation de l’équipement, chargement d’échantillon, d’incubation et de mesure.

1. Préparation du matériel
   1. Allumez le PC et la puissance de l’analyseur.
      Remarque : L’interrupteur est sur la gauche de la base.
   2. Lancez le programme LabIT sur le PC. Si la fenêtre d’avertissement de Darks apparaît, cliquez sur OK pour exécuter le Test de fuite. Par la suite, cliquez sur le logo de centre pour accéder à l’interface d’opération.
      Remarque : Le système rappellera à l’utilisateur d’exécuter le Test de fuite s’il est inactif pendant plus de 24 h.
   3. Vérifier le Temp de réaction et le CCD (charge - coupled device) Temp dans le coin inférieur droit de l’écran. Le Temp de réaction devrait s’élever à 37 ° C ± 1 ° C en 10 min environ, et le Temp de CCD devrait tomber à-15 ° C ± 1 ° C.
   4. Exécutez le Test de fuite après le Temp du CCD, a chuté à-15 ° C ± 1 ° C. Avant d’exécuter l’essai d’étanchéité, assurez-vous qu’il n’y a pas d’autres éléments laissés à l’intérieur de l’instrument et fermer la porte. Cliquez sur outils | Système de Test | Test d’étanchéité. N’ouvrez pas la porte au cours des essais. Lorsque le test est terminé, la fenêtre d’état s’affiche.
2. Chargement de l’échantillon
   1. Ajouter 620 µL de tampon de lavage, 120 µL de tampon de blocage, 60 µL de conjugués A et B, 60 µL de substrat A et B et 100 µL de sérum dans le réservoir de réactif correspondant sur la cartouche microfluidique.
3. Incubation
   1. Cliquez sur l’ID de la cartouche, utiliser le scanner de code à barres pour scanner le numéro de série de la cartouche, entrez l’ID d’échantillon, mettre la cartouche dans l’analyseur et fermer la porte et cliquez sur analyseur et exécuter pour démarrer l’analyse.
4. Mesure
   1. Exporter les résultats vers un logiciel de statistique (par exemple, Excel) après la mesure.
      Remarque : Après 30 min d’incubation, l’analyseur automatiquement effectue la mesure et indique le résultat.
5. Extinction de l’analyseur
   1. Pour l’entretien de routine, après avoir terminé le test, retirez la cartouche et essuyer l’analyseur fer de chauffage intérieur et électro-aimant légèrement avec 75 % d’alcool.
      Remarque : Ne pas appuyer fort ou secouer l’électro-aimant.
   2. Fermez la fenêtre LabIT. La fenêtre de contrôle de température sautera vers le haut. Il se ferme automatiquement lorsque le capteur CCD chauffe pour le mode de protection de 5 ° C. D’ici là, il sera prudent de couper l’alimentation de l’analyseur et le PC.
      Remarque : Ne fermez pas manuellement la contrôle fenêtre avant le Temp de CCD est passé à 5 ° C de température et n’éteignez pas la puissance de l’analyseur, ni le PC pendant l’échauffement du CCD.

4. définition de la réactivité de sIgE

Remarque : Pour un échantillon de sérum non dilué, la plage de détection du système 2 est de 0,21 – 100 IU/mL.

1. Basé sur la valeur de seuil de 0,35 UI/mL, envisager un niveau de sIgE excédant 0,35 UI/mL pour être positif^6,7. Évaluer la réactivité des tests sIgE comme⁸: classe 1 (≥0.35 et < 0,70 UI/mL), classe 2 (≥0.70 et < 3,50 UI/mL), classe 3 (≥3.50 et < 17,50 UI/mL), de la classe 4 (≥17.50 et < 50,00 UI/mL), classe 5 (≥50.00 et < 100,00 UI/mL) et la classe 6 (≥100.00 UI/mL).

5. analyse statistique

1. Utiliser un histogramme pour afficher le taux de positivité des 19 allergènes (Figure 1) et utiliser la courbe de Levey-Jennings pour démontrer la répétabilité de la détection du système (Figure 2)⁹.
2. Sélectionnez les trois inhalants allergènes les plus courants et les allergènes alimentaires (au total, six allergènes) et comparer les résultats à l’i 1 système d’évaluer ses performances diagnostiques cliniques^10,11. Inclure le taux de concordance, sensibilité, spécificité, valeurs prédictives positives et négatives et l’aire sous le récepteur (ROC) de la caractéristique (AUC) de fonctionnement comme les critères d’évaluation.
3. Appliquer corrélation analyse¹² pour décrire les corrélations entre les deux systèmes et utiliser la valeur kappa par souci de cohérence de Spearman. Classer la valeur kappa comme presque parfait (0,8 à 1,0), importante (0,6 – 0,8), modérée (0,4 à 0,6), Foire/salon (0,2 – 0,4) ou pauvres (< 0,2)¹³. Utiliser l’analyse statistique SPSS 23,0 et MedCalc 11,0 et définir P < 0,05 comme signification statistique.

Résultats

Taux positifs pour des allergènes communs 19
Les résultats sur 293 sérums sont indiquées à la Figure 3. Parmi tous les allergènes inhalants, d. farinae avait le plus haut taux de positivité (80,89 %, 273/293), suivie par D. Pteronyssinus (78.84 %, 231/293). Parmi les allergènes alimentaires, crabe a le plus haut taux de positivité (20,48 %, 60/293), suivie de 13,65 % (40/293) pour la crevette. Le taux gl...

Discussion

Similaires aux résultats de nombreuses autres études^15,16,17, les résultats du système microfluidique issu des sérums de 293 patients allergiques ont montré que la maison acariens (y compris d. pteronyssinus, D. farinaeet b. tropicalis) sont les principaux allergènes inhalants conduisant à des maladies allergiques au sud de la Chine, alors que pour la nourriture, lait, arachide, crevette et cr...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agnitio BioIC Analyzer	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	BA-G2000
BioIC Allergen specific-IgE Detection Kit	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	DR17A12
BioIC Cartrideg Placement plate	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	T20SET
BioIC Reagent Dispenser	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	DS-1
Image two-dimensional barcode machine	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	NLS-HR200
Software Package, LabIT	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	Version 2.4.12
VORTEX-5 Vortex Mixer	Haimen Kylinbell Lab Lastruments Co., Ltd.	VORTEX-5