Применение технологии Microfluidic биочип обнаружить сыворотке Аллерген конкретных иммуноглобулина е (sIgE)

Резюме

Этот документ представляет протокол обнаружения сыворотки специфические антитела с системой на основе картриджа хемилюминесценции microfluidic и оценки его полезность в специальные диагнозы.

Аннотация

Аллергические заболевания встречается у взрослых и детей. Выявления причинных аллергенов значительное заболеваниями и профилактике. Однако в материковой части Китая, особенно в первичной медицинской помощи больницы отсутствует систему измерения конкретных иммуноглобулина Е (IgE) с коэффициентом высокая цена производительность. Этот документ описывает принцип и операции процедур с использованием системы на основе картриджа хемилюминесценции microfluidic для выявления аллергенов специфических IgE в сыворотке. Результаты были по сравнению с теми, от ImmunoCAP (система 1), промышленный стандарт, и оценивается воспроизводимость системы для выявления больных, сенсибилизированных к аллергенов. Результаты показали, что по сравнению с ImmunoCAP (система 1), BioIC системы (System 2) имеет хорошую точность и чувствительность в выявлении сыворотки специфических IgE против различных аллергенов летучими и продовольствия, но с значительно более низкой стоимости. Это может служить хорошей альтернативой для системы 1 в первичной медицинской помощи больницы в материковой части Китая, которые имеют меньше финансовой доступности.

Введение

Распространенность аллергии неуклонно растет в течение последних десятилетий и затрагивает 20% - 30% от общей численности населения¹. Выявления причинных аллергенов имеет важное значение в управлении заболеваний. В Китае поскольку зарегистрированные в естественных условиях кожи укол тесты доступны не в стране, в пробирке определения IgE сыворотки конкретных является наиболее важным и широко используемым инструментом для Аллергия типа диагнозов². Это похоже на практике в западном мире, но хотя флуоресценции иммуноферментного базовой системы, ImmunoCAP системы (система 1), рассматривается как золотой стандарт в пробирке специальные диагноза³, его использование в Китае весьма ограничены из-за для его высокой стоимости оборудования и реагентов. Поэтому крайне необходима новая система диагностики альтернативные аллергии с коэффициентом высокая цена производительность.

BioIC системы (System 2) является microfluidic картридж на основе системы, основанной на принципе хемолюминесценции для мультиплексных анализы сыворотки специфических IgE. С размером 7 см х 4 см, картридж microfluidic состоит из трех слоев инъекции формованных пластиковых. Верхняя часть — 3 мм прозрачного поликарбоната, которая осуществляет хорошую стабильность во время процессов тепловой сборки. Вместе с 3 мм толщиной нижнего слоя построены из сополимер акрилонитрила, бутадиена и стирола (ABS) она бутерброды 0,5 мм толстой средний слой, сделанный из силиконового каучука. Черный цвет, средний слой предлагает более низкая предпосылка обнаружением хемолюминесценции. На вершине силикагель тонкий слой мембраны нитроцеллюлозы (NC мембраны) распыляется в позиции, соответствующей зоне реакции, которая позволяет кровянистые выделения различных аллергенных белков. Цель этого исследования заключается в оценке клинической эффективности microfluidic системы для мультиплексных определения Аллерген специфических IgE в сыворотке.

протокол

Это исследование и использование образцов сыворотки крови человека были утверждены Этический Комитет первым филиалом больница из Гуанчжоу медицинского университета (GYYY-2016-73). Все участники дали свое письменное согласие, самостоятельно или через своих родителей (в случае детей).

1. Основная информация о группе исследования

Примечание: Специальные хранилища информации состояния ключа Лаборатория респираторных заболеваний (AIR-SKLRD) является большой сыворотки банком создан внутри Guangzhou Институте респираторных больницы (GIRH). Начатый в последнее десятилетие, воздух-SKLRD уже начали собирать и хранить образцы сыворотки у пациентов с аллергическими заболеваниями, вместе с их клинической информации (Таблица 1)^4,5. Текущее исследование было проведено с сера из воздуха-SKLRD.

1. Поиск базы данных SKLRD воздуха для сыворотки, собранных с января 2015 года до июня 2018 и выберите больных аллергическим заболеванием, которые были найдены быть чувствительным к аллергенов в регионе.
2. Обеспечить всех выбранных пациентов аллергических заболеваний, таких, как аллергический ринит и астма, аллергический дерматит, или крапивница, а у этих больных сыворотка несколько сыворотки Аллерген специфические антитела (sIgE) Почему аллергенов в этом регионе, обнаруженных в системе 1.
3. Исключать пациентов с неполной медицинские записи, погибших в последующей деятельности, те, которые отказываются дать осознанное согласие относительно использования их образцов сыворотки для научных целей, те с выявленными иммунодефицита, те в настоящее время на иммунотерапию или иммуномодулирующих агентов, или те обнаружены паразитарные инфекции.
4. Убедитесь, что без рецепта лечения или наркотиков было дано до сбора сыворотки с тем, чтобы свести к минимуму вмешательство в результаты лабораторных исследований. Все образцы сыворотки, которые не удовлетворяют критериям, были отклонены.

2. Исследование потока и измерения интереса

Примечание: Система microfluidic нуждается 100 мкл сыворотки для определения 19 аллергенов. Венозная кровь (5 мл) была собрана из каждого пациента, с помощью вакуума кровеносный сосуд, содержащий отделяя гель. После центрифугирования 10 мин на 1000 x g, верхний слой была собрана для тестирования. Неиспользуемые сыворотка хранятся при температуре-80 ° C. До начала испытаний, сыворотка хранится при комнатной температуре в течение 30 мин и был потрясен с вихревой смеситель. Удалось избежать повторных циклов замораживания и оттаивания.

1. Главным образом пробы сыворотки для sIgEs всего аллергенов Dermatophagoides pteronyssinus (d1), Dermatophagoides farinae (d2), Blomia tropicalis (d201), cat перхоть (e1), перхоть собаки (Е5), трава Бермудских островов (g2), Тимоти трава) G6), тараканы (i6), Aspergillus fumigatus (м3), Candida albicans (m5), Амброзия (w1), яичного белка (f1), молоко (f2), пшеницы (f4), арахиса (f13), сои (f14), миндаль (f20), краб (f23) и креветки (f24). Следуйте инструкциям, приведенным в разделе 3.
   Примечание: sIgE определение было сделано с Аллерген специфических IgE assay комплекта (см. Таблицу материалы) и измеряется хемилюминесцентного анализатора.
2. Случайно выберите три пробы из числа образцов с достаточно сыворотки (по крайней мере 900 мкл) для воспроизводимости результатов исследования. Сохраняя все условия без изменений, измерить три sera для аллерген sIgEs ежедневно, за 9 дней подряд (т.е. в общей сложности 100 x 9 = 900 мкл сыворотки).

3. полу автоматизации процедуры испытания системы microfluidic

Примечание: 2 системы заключается в интеграции технологии автоматического microfluidic microarray протеина, холодный свет анализа, параллельного анализа МГЭ и технологии обработки изображения. Протокол испытаний разделена на четыре части: подготовка оборудования, образец загрузки, инкубации и измерения.

1. Подготовка оборудования
   1. Включите ПК и анализатор мощности.
      Примечание: Выключатель питания находится на левой стороне основания.
   2. Запустите программу Лабит на ПК. Если всплывающее окно предупреждения Темного кадра , нажмите кнопку ОК , чтобы запустить тест утечки. После этого нажмите на логотип центра ввести операции интерфейс.
      Примечание: Система будет напоминать пользователю запускать испытание на герметичность , если она находится в состоянии простоя для более чем 24 часа.
   3. Проверьте реакцию Temp и ПЗС (зарядовой) Temp в правом нижнем углу экрана. Temp реакции должно возрасти до 37 ° C ± 1 ° C около 10 мин, и Temp КБО должен упасть до-15 ° C ± 1 ° C.
   4. Запустить проверку утечки после CCD температура упала до-15 ° C ± 1 ° C. Перед запуском теста утечки, убедитесь Есть не другие вещи, оставленные внутри инструмента и закройте дверцу. Нажмите инструменты | Испытание системы | Испытание на герметичность. Во время тестирования не открывать дверь. Когда тест завершен, появится всплывающее окно отчета.
2. Пример загрузки
   1. Мкл 620 мыть буфера, 120 мкл блокировки буфера, 60 мкл конъюгатов A и B, 60 мкл субстрат A и B и 100 мкл образцов сыворотки в соответствующий реагент бак на microfluidic картриджа.
3. Инкубация
   1. Нажмите на Картридж ID, используйте штрих-код сканер для сканирования серийный номер картриджа, введите идентификатор образца, вставьте картридж в анализаторе и закрыть дверь и нажмите кнопку анализатор и запустить , чтобы начать анализ.
4. Измерение
   1. Экспортируйте результаты статистического программного обеспечения (например, Excel) после измерения.
      Примечание: После 30 минут инкубации, анализатор автоматически выполняет измерения и сообщает результат.
5. Отключения анализатор
   1. Для текущего ремонта, после окончания теста выньте картридж и протрите анализатор внутреннего обогрева железа и электромагнитом слегка с 75% алкоголя.
      Примечание: Не нажимайте жесткий или встряхнуть электромагнита.
   2. Закройте окно Лабит А.о. Появится всплывающее окно контроля температуры. Он автоматически закроется, когда КБО нагревается до 5 ° C режим защиты. К тому времени это будет безопасно выключить питание анализатора и ПК.
      Примечание: Не закрыть вручную контроля окно, прежде чем CCD Temp возросла до 5 ° C температуры и не выключите анализатор ни ПК во время разминки CCD.

4. Определение sIgE реактивности

Примечание: Для образца неразбавленном сыворотки, дальность обнаружения системы 2 — 0,21 – 100 МЕ/мл.

1. Основываясь на пороговое значение 0.35 МЕ/мл, рассмотрим sIgE уровень более 0,35 МЕ/мл быть позитивные^6,7. Оценить реактивности sIgE тестов как⁸: класс 1 (≥0.35 и < 0,70 МЕ/мл), класс 2 (≥0.70 и < 3,50 МЕ/мл), класс 3 (≥3.50 и < 17,50 МЕ/мл), класса 4 (≥17.50 и < 50.00 МЕ/мл), 5-го класса (≥50.00 и < 100.00 МЕ/мл) и класс 6 (≥100.00 МЕ/мл).

5. Статистический анализ

1. Используйте гистограмму чтобы показать положительные темпы 19 аллергенов (рис. 1) и использовать Levey-Дженнингс кривой, чтобы продемонстрировать повторяемость обнаружения системы (рис. 2)⁹.
2. Выберите три наиболее распространенных вдыхаемые аллергены и пищевых аллергенов (в общей сложности шесть аллергены) и сравнить результаты я 1 системы для оценки ее клинической диагностики производительности^10,11. Включать уровень согласования, чувствительность, специфичность, положительной и отрицательной прогностической ценности и площадь под приемник операционной характеристика (ROC) кривой (AUC) как критерии оценки.
3. Примените корреляции Спирмена анализ¹² для описания взаимосвязей между двумя системами и использовать Каппа значение для обеспечения согласованности. Классифицировать Каппа значение как почти идеальный (0,8-1,0), существенные (0,6 – 0,8), умеренную (0,4 – 0,6), ярмарка (0,2 – 0,4) или бедных (< 0,2)¹³. Использовать SPSS 23,0 и MedCalc 11.0 статистический анализ и определить P < 0,05 как статистической значимости.

Результаты

Положительные темпы для 19 аллергенов
Результаты на 293 сера показаны на рисунке 3. Среди всех вдыхаемые аллергены, D. farinae имели положительный показатель (80.89%, 273/293), а затем D. pteronyssinus (78,84%, 231/293). Среди пищевых аллергенов, краб имеет в...

Обсуждение

Аналогичные результаты многих других исследований^15,16,17, результаты от microfluidic системы на основе сыворотки от 293 аллергия больных показал, что дом пылевых клещей (включая D. pteronyssinus, D. farinaeи B. tropicalis) являются основными вдыхае...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agnitio BioIC Analyzer	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	BA-G2000
BioIC Allergen specific-IgE Detection Kit	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	DR17A12
BioIC Cartrideg Placement plate	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	T20SET
BioIC Reagent Dispenser	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	DS-1
Image two-dimensional barcode machine	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	NLS-HR200
Software Package, LabIT	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	Version 2.4.12
VORTEX-5 Vortex Mixer	Haimen Kylinbell Lab Lastruments Co., Ltd.	VORTEX-5