生物芯片微流控技术在血清过敏源特异性免疫球蛋白 E (sIgE) 检测中的应用

摘要

本文提出了一种基于微流控剂的化学发光系统检测血清特异性免疫球蛋白 E 的方法, 并评价其在过敏诊断中的应用价值。

摘要

过敏性疾病在成人和儿童中都很常见。病因过敏原的鉴定在疾病管理和预防中具有重要意义。然而, 中国大陆, 特别是初级保健医院, 缺乏具有较高性价比的特定免疫球蛋白 e (IgE) 测量系统。本文介绍了利用微流化物盒化学发光系统检测血清中过敏原特异性 IgE 的原理和操作步骤。并将结果与免疫 Cap (系统 1)、工业标准和该系统的重现性进行了比较, 以检测对常见过敏原敏感的患者。结果表明, 与免疫 Cap (系统 1) 相比, 生物 Ic 系统 (系统 2) 在检测血清特异性 IgE (Ige) 时具有较好的精度和灵敏度, 但成本要低得多。它可以作为中国大陆初级保健医院系统1的一个很好的替代方案, 因为这些医院的经济承受能力较低。

引言

在过去几十年里, 过敏的流行率稳步上升, 影响到全球人口^的20% 至 30% 1。病因过敏原的鉴定对疾病的管理具有重要意义。在中国, 由于国内没有登记的体内皮肤刺试验, 体外测定血清特异性 IgE 是 i 型过敏诊断最重要、最常用的工具 2.这与西方世界的做法类似, 但尽管作为荧光酶联免疫吸附基系统的免疫 cap 系统 (系统 1) 被认为是体外过敏诊断的黄金标准 3, 但由于在中国, 其使用非常有限。其较高的设备和试剂价格。因此, 迫切需要一个具有较高性价比的新型替代过敏诊断系统。

BioIC 系统 (系统 2) 是一种基于化学发光原理的基于血清特定 ige 多路检测的微流体墨盒系统。微流体盒的尺寸为7厘米 x 4 厘米, 由三层注塑塑料组成。上部为3毫米厚的透明聚碳酸酯, 在热装配过程中具有良好的稳定性。它与由丙烯腈、丁烯和苯乙烯 (ABS) 的共聚物制成的3毫米厚的底层一起, 将由硅橡胶制成的0.5 毫米厚的中间层三明治。中间层是黑色的, 在化学发光检测过程中提供较低的背景。在硅胶的顶部, 在与反应区相对应的位置喷洒一层薄薄的硝化纤维素膜 (NC 膜), 从而可以发现不同的过敏性蛋白质。本研究的目的是评价微流体系统在血清中多联检测过敏原特异性 IgE 的临床性能。

研究方案

本研究和人体血清样本的使用得到了广州医科大学第一附属医院伦理委员会 (GYYY-2016-73) 的批准。所有参与者都独立或通过其父母 (就儿童而言) 给予书面同意。

1. 研究小组的基本资料

注: 呼吸道疾病国家重点实验室 (AIR-SKLRD) 过敏信息库是在广州呼吸医院研究所 (GIRH) 内建立的大型血清库。Air-sklrd 在过去十年中启动, 已开始收集和储存过敏性疾病患者的血清样本及其临床信息 (表 1)^4、5.目前的研究是用 AIR-SKLRD 的血清进行的。

1. 在 AIR-SKLRD 的数据库中搜索2015年1月至2018年6月收集的血清, 并选择过敏性疾病患者, 他们被发现对该地区的常见过敏原敏感。
2. 确保所有选定的患者都有过敏性相关疾病, 如过敏性鼻炎和/哮喘、过敏性皮炎和/或荨麻疹, 并且这些患者的血清中含有多种血清过敏原特异性免疫球蛋白 E (sIgE)该系统1检测到该地区常见过敏原的敏化。
3. 排除医疗记录不完整的患者、因随访而丢失的患者、拒绝就血清样本用于科学目的提供知情同意的患者、已确定免疫缺陷的患者、目前正在接受免疫治疗的患者或免疫调节剂, 或那些被发现有寄生虫感染。
4. 确保在采集血清之前不给予治疗或药物处方, 以最大限度地减少对实验室结果的干扰。所有不符合标准的血清样本均被拒绝。

2. 研究流程和测量感兴趣

注: 微流体系统需要100μl 的血清来测定19种过敏原。使用含有分离凝胶的真空血管从每个患者身上采集静脉血液 (5 毫升)。在 1, 000 x 克离心10分钟后, 收集上层进行测试。未使用血清储存在-80°c。在测试之前, 血清在室温下保持 30分钟, 并与涡旋混合器晃动。避免了重复的冻融循环。

1. 主要检测 Sige 的血清样本对翼状肌病(d1) 的全过敏原.仙人掌 ( D1)、热带黑虫(d1)、猫皮草 (e1)、狗皮草 (e1)、百慕大草 (g2)、提莫西草 (g6)、蟑螂 (i6)、熏蒸曲霉 ( m3)、白色念珠菌(m5)、野草 (w1)、蛋清 (f1)、牛奶 (f1)、小麦 (f1)、花生 (f1)、大豆 (f1)、杏仁 (f1)、螃蟹 (f1) 和虾 (f1)。按照第3节中给出的说明进行操作。
   注: sIgE 测定是用过敏原特异性 IgE 试剂盒 (见材料表) 进行的, 并由化学发光分析仪测量。
2. 从有足够血清 (至少 900Μl) 的样品中随机选择三个样品, 以便进行重现性研究。保持所有条件不变, 连续9天每天测量过敏原 Sige 的三个血清 (即血清总长度为 100 x 9 = 900μl)。

3. 微流体系统的半自动化测试程序

注: 系统2是集成自动微流体技术, 蛋白质微阵列, 冷光分析, 并行 IgE 分析, 图像处理技术。测试协议分为四个部分: 设备的制备、样品加载、孵化和测量。

1. 设备的准备
   1. 打开电脑和分析仪电源。
      注: 电源开关位于底座的左侧。
   2. 在电脑上启动 LabIT 程序。如果弹出"暗帧" 警告窗口, 请单击 "确定"运行"泄漏测试"。然后, 单击中心徽标进入操作界面。
      注: 如果用户空闲时间超过 24小时, 系统将提醒用户运行泄漏测试。
   3. 检查屏幕右下角的反应温度和 CCD (电荷耦合器件) 温度。反应温度应在大约10分钟内上升到 37°c±1°c, CCD 温度应下降到-15°c±1°c。
   4. 在 CCD 温度下降到-15°c±1°c 后, 运行Ak 测试。在运行张好测试之前, 请确保仪器内没有其他项目, 并关闭门。点击工具系统测试泄漏测试。在测试过程中不要开门。测试完成后, 将弹出报告窗口。
2. 样品加载
   1. 添加620微米的洗涤缓冲液、120μl 的阻滞剂、60μl 的共轭 a 和 B、60μl 的基板 A 和 B, 以及100μl 的血清样品到微流体墨盒上相应的试剂罐中。
3. 孵化
   1. 点击墨盒 id, 使用条形码扫描器扫描墨盒的序列号, 输入样品 id, 将墨盒放入分析仪并关闭门, 然后单击"分析器" 并运行以开始分析。
4. 测量
   1. 测量后将结果导出到统计软件 (如 Excel)。
      注: 孵育30分钟后, 分析仪会自动执行测量并报告结果。
5. 关闭分析仪
   1. 对于日常维护, 在完成测试后, 取出墨盒, 用75% 的酒精轻轻擦拭分析仪的内部加热铁和电磁铁。
      注: 请勿用力按压或摇晃电磁铁。
   2. 关闭 "标签" 窗口。温度监测窗口将弹出。当 CCD 升温至5°C 保护模式时, 它将自动关闭。届时, 关闭分析仪和 PC 的电源将是安全的。
      注: 在 CCD 温度上升到5°c 之前, 不要手动关闭温度监测窗口, 也不要在 CCD 预热期间关闭分析仪和 PC 的电源。

4. sIgE 反应性的定义

注: 对于未稀释的血清标本, 系统2的检测范围为 0.21–100 iu l。

1. 根据 0.35 iu/ml 的阈值, 认为超过 0.35 iuml 的 sige 水平为^{正 6,7}。将 sIgE 测试的反应性评为⁸: 第1类 (≥0.35 和 lt;0.70 Iu/ml)、第2类 (≥0.70 和 lt;3.50 iu/ml)、第3类 (≥3.50 和 & lt;17.50 Iu/ml)、第4类 (≥17.50 和 lt;50.00 iu/ml)、第5类 (≥50.00 和 Lt;100.00 iu/ml)和第6类 (≥100.00 Iu/ml)。

5. 统计分析

1. 使用直方图显示19种过敏原的阳性率 (图 1), 并使用 Levey-Jennings 曲线来演示检测系统的可重复性 (图 2)⁹。
2. 选择三种最常见的吸入过敏原和食物过敏原 (共六种过敏原), 并将结果与 I System 1 进行比较, 以评估其临床诊断性能^10,11。以一致性率、灵敏度、特异性、正负预测值和接收器操作特性 (AUC) 曲线 (AUC) 下的面积为评价标准。
3. 应用斯皮尔曼的相关分析¹²来描述两个系统之间的相关性, 并使用 kappa 值进行一致性。将 kappa 值归类为几乎完美 (0.8–1.0)、实质性 (0.6–0.8)、中等值 (0.4-0.6)、公平 (0.2-0.4) 或差 (lt;0.2)¹³。使用 SPSS 23.0 和 MedCalc 11.0 统计分析, 并将p < 0.05 定义为统计意义。

结果

19种常见过敏原的阳性率
293 sera 的结果如图 3所示。在所有吸入过敏原中, d. farinae的阳性率最高 (80.89, 271-293), 其次是d.翼状鼻窦炎(78.84, 231/293)。在食物过敏原中, 螃蟹的阳性率最高 (20.48, 60/293), 其次是 13.65 (40/293)。吸入性过敏原的总阳性率高于食物过敏原。

微流?...

讨论

与许多其他研究 15^、16、17的结果类似, 基于293名过敏患者血清的微流控系统的结果显示, 室内尘螨 (包括d. 翼状肌瘤), D. farinae和b. tropicalis) 是导致中国南方过敏性疾病的主要吸入性过敏原, 而对于食物、牛奶、花生、虾和螃蟹来说, 则是导致过敏性症状的最常见的过敏原。关于对三种过敏原进行的重现性研究...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agnitio BioIC Analyzer	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	BA-G2000
BioIC Allergen specific-IgE Detection Kit	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	DR17A12
BioIC Cartrideg Placement plate	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	T20SET
BioIC Reagent Dispenser	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	DS-1
Image two-dimensional barcode machine	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	NLS-HR200
Software Package, LabIT	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	Version 2.4.12
VORTEX-5 Vortex Mixer	Haimen Kylinbell Lab Lastruments Co., Ltd.	VORTEX-5