Aplicación de la tecnología de microfluidos Biochip para detectar suero alergénico-específicos de la inmunoglobulina E (sIgE)

Resumen

Este papel presenta un protocolo para la detección específica de suero, inmunoglobulina E, con un sistema de quimioluminiscencia basado en cartucho de microfluidos y la evaluación de su utilidad en diagnósticos de alergia.

Resumen

Enfermedad alérgica es común en adultos y niños. Identificación de los alergenos causales es importante en la prevención y manejo de la enfermedad. Sin embargo, carece de un sistema de medición específicos de la inmunoglobulina E (IgE) con una alta relación calidad-precio en China continental, especialmente en los hospitales de atención primaria. Este documento describe los procedimientos de principio y funcionamiento de la utilización de un sistema de quimioluminiscencia basado en el cartucho de microfluidos para detectar IgE alergeno-específica en suero. Los resultados fueron comparados con los de ImmunoCAP (sistema 1), el estándar industrial, y se evalúa la reproducibilidad del sistema para detectar a pacientes sensibilizados a los alergenos comunes. Los resultados mostraron que en comparación con ImmunoCAP (sistema 1), el sistema BioIC (sistema 2) tiene buena precisión y sensibilidad en la detección de suero específico IgE contra alergenos inhalantes y alimentos distintos pero con un costo significativamente menor. Puede servir como una buena alternativa en los hospitales de atención primaria en la China continental que tienen baja rentabilidad financiera del sistema 1.

Introducción

La prevalencia de las alergias ha aumentado de manera constante en las últimas décadas y afecta a 20% - 30% de la población mundial¹. Identificación de los alergenos causales tiene gran importancia en el manejo de las enfermedades. En China, ya que no hay pruebas del pinchazo de la piel in vivo registrado en el país, determinación in vitro de IgE específicos del suero es la más importante herramienta comúnmente utilizada para alergia de tipo I el diagnóstico². Esto es similar a las prácticas en el mundo occidental, pero aunque el sistema ImmunoCAP (sistema 1), un sistema de base de enzima-ligado del inmunosorbente de la fluorescencia, es percibido como el estándar de oro para el diagnóstico de alergia in vitro³, su uso en China es muy limitada debido a su alto precio equipo y reactivo. Por lo tanto, es urgentemente un nuevo sistema de diagnóstico de alergias alternativa con una alta relación calidad-precio.

El sistema BioIC (sistema 2) es un sistema de cartucho de microfluidos basado en el principio de quimioluminiscencia para ensayos multiplexados de suero específico IgE. Con un tamaño de 7 cm x 4 cm, el cartucho de microfluidos se compone de tres capas de plástico moldeado por inyección. La parte superior es de policarbonato transparente de 3 mm de grosor que lleva buena estabilidad durante los procesos de Asamblea termal. Junto con la capa de 3 mm de espesor inferior hecha de un copolímero de acrilonitrilo, butadieno y estireno (ABS), sandwiches los 0.5 mm de espesor capa intermedia hecha de caucho de silicona. Color negro, la capa media ofrece fondo inferior durante la detección de la quimioluminescencia. En la parte superior del gel de silicona, se rocía una fina capa de nitrocelulosa membrana (NC) en la posición correspondiente a la zona de reacción, que permite la localización de diferentes proteínas alergénicas. El propósito de este estudio es evaluar el rendimiento clínico del sistema de microfluidos para la determinación multiplexado de alergénico-específicos de IgE en suero.

Protocolo

Este estudio y el uso de muestras de suero fueron aprobados por el Comité de ética de la primera afiliada Hospital de Guangzhou Universidad médica (GYYY-2016-73). Todos los participantes han dado su consentimiento por escrito de forma independiente o a través de sus padres (en el caso de los niños).

1. básica información del grupo de estudio

Nota: El repositorio de información de la alergia del estado clave de laboratorio de enfermedades respiratorias (aire-SKLRD) es un banco grande de suero dentro del Hospital Instituto de Guangzhou de respiratorio (GIRH). Iniciado en la última década, la SKLRD de aire ya ha comenzado a recolectar y almacenar muestras de suero de pacientes con enfermedades alérgicas, junto con su información clínica (tabla 1)^4,5. El presente estudio se realizó con sueros de aire-SKLRD.

1. Base de datos de aire SKLRD para sueros recogidos de enero de 2015 a de 2018 junio y seleccionamos a los pacientes con enfermedad alérgica, que fueron encontrados para ser sensibles a los alérgenos comunes en la región.
2. Asegurar que todos los pacientes seleccionados tienen enfermedades relacionadas con la alergia, tales como rinitis alérgica y asma, dermatitis alérgica, o urticaria, y que el suero de estos pacientes contiene múltiples sérica alergeno-específica, inmunoglobulina E, (sIgE) sensibilizaciones de los alergenos comunes en esta región, detectados por el sistema 1.
3. Excluir a los pacientes con historias clínicas incompletos, los perdidos durante el seguimiento, los que se niegan a dar su consentimiento informado con respecto al uso de sus muestras de suero para propósitos científicos, ésos con una inmunodeficiencia identificada, ésos actualmente en inmunoterapia o agentes inmunomoduladores, o los que se encuentran que las infecciones parasitarias.
4. Asegúrese de que ninguna prescripción de tratamiento o fármaco fue dado antes de la colección del suero con el fin de minimizar la interferencia en los resultados del laboratorio. Todas las muestras de suero que no cumplan los criterios fueron rechazadas.

2. estudio de flujo y las mediciones de interés

Nota: El sistema de microfluidos necesita 100 μl del suero para la determinación de los 19 alérgenos. Se extrajo sangre venosa (5 mL) de cada paciente usando un recipiente vacío de sangre conteniendo gel de separación. Después de centrifugar 10 min a 1.000 x g, se recolectó la capa superior para la prueba. Suero se almacenó a-80 ° C. Antes de la prueba, el suero se mantuvo a temperatura ambiente durante 30 min y fue sacudido con un mezclador de tipo vórtex. Ciclos repetidos de congelación y descongelación se evitaron.

1. Prueba sobre todo las muestras de suero para sIgEs a todo alergenos del Dermatophagoides pteronyssinus (d1) Dermatophagoides farinae (d2), Blomia tropicalis (d201), caspa de gato (e1), caspa de perro (e5), zacate Bermuda (g2), timothy grass) G6), cucarachas (i6), Aspergillus fumigatus (m3), Candida albicans (m5), Ambrosia (w1), clara de huevo (f1), leche (f2), trigo (f4), maní (f13), soja (f14), almendra (f20), cangrejo (f23) y camarón (f24). Siga las instrucciones en la sección 3.
   Nota: sIgE determinación se realizó con la IgE alergeno-específica análisis kit (véase la Tabla de materiales) y medido por un analizador de quimioluminiscencia.
2. Seleccionar al azar tres muestras entre las muestras con suficiente suero (por lo menos 900 μL) para un estudio de reproducibilidad. Mantener todas las condiciones sin cambios, medir los tres sueros para alérgenos sIgEs diariamente durante 9 días consecutivos (es decir, un total de 100 x 9 = 900 μl de suero).

3. procedimiento de prueba de semi-automatización del sistema de microfluidos

Nota: El sistema 2 es la integración de la tecnología de microfluidos automático, microarrays de proteínas, análisis de luz fría, paralelo análisis de IgE y tecnología de procesamiento de imagen. El protocolo de pruebas se divide en cuatro partes: preparación de los equipos, carga de la muestra, incubación y medición.

1. Preparación de los equipos
   1. Encienda el PC y el poder del analizador.
      Nota: El interruptor está a la izquierda de la base.
   2. Inicie el programa LabIT en el PC. Si aparece la ventana de advertencia de Marco oscuro , haga clic en Aceptar para ejecutar la prueba de fugas. Después, haga clic en el logo del centro para entrar en la interfaz de la operación.
      Nota: El sistema recordará al usuario para ejecutar la prueba de fugas si está inactivo durante más de 24 h.
   3. Compruebe la temperatura de reacción y el CCD (dispositivo de carga acoplada) Temp en la esquina inferior derecha de la pantalla. Se eleva la temperatura de reacción a 37 ° C ± de 1 ° C en unos 10 minutos, y la temperatura de la CCD debe caer hasta-15 ° C ± 1 ° C.
   4. Ejecutar la prueba de fuga después de que la temperatura de la CCD ha bajado a-15 ° C ± 1 ° C. Antes de ejecutar la prueba de fuga, asegúrese de que no hay otros artículos dejados dentro el instrumento y cierre la puerta. Haga clic en herramientas | Prueba del sistema | Prueba de fugas. No abra la puerta durante la prueba. Cuando la prueba haya terminado, aparecerá la ventana de informe.
2. Carga de la muestra
   1. Añadir 620 μl de tampón de lavado, 120 μl de solución amortiguadora de bloqueo, 60 μL de conjugados de A y B, 60 μL de sustrato A y B y 100 μl de las muestras de suero para el correspondiente depósito de reactivo en el cartucho de microfluidos.
3. Incubación
   1. Clic en ID del cartucho, utilice el escáner de código de barras para analizar el número de serie del cartucho, introduzca el ID de muestra, ponga el cartucho en el analizador y cierre la puerta y analizador y Ejecutar para iniciar el análisis.
4. Medición
   1. Exportar los resultados a software estadístico (por ejemplo, Excel) después de la medición.
      Nota: Después de 30 min de incubación, el analizador realiza la medición y automáticamente informa el resultado.
5. Conmutación en el analizador
   1. Para mantenimiento de rutina, después de terminar la prueba, retire el cartucho y el analizador hierro calefacción interna y electroimán ligeramente con alcohol del 75%.
      Nota: No presione fuerte o sacudir el electroimán.
   2. Cierre la ventana LabIT. Se abrirá la ventana de control de temperatura. Se cerrará automáticamente cuando el CCD se calienta en el modo de protección de 5 ° C. Entonces, será seguro desconectar la alimentación del analizador y PC.
      Nota: No cierre manualmente el control ventana antes de que la temperatura de la CCD ha aumentado a 5 ° C de la temperatura y no apague el analizador ni el PC durante el calentamiento de la CCD.

4. definición de reactividad sIgE

Nota: Para una muestra de suero sin diluir, el rango de detección de la 2 de sistema es 0.21 – 100 IU/mL.

1. Basado en el valor de umbral de 0,35 UI/mL, considerar un nivel sIgE superior a 0,35 UI/mL para ser positivo^6,7. Tarifa de la reactividad de las pruebas sIgE como⁸: clase 1 (≥0.35 y < 0,70 UI/mL), clase 2 (≥0.70 y < 3,50 UI/mL), clase 3 (≥3.50 y < 17,50 UI/mL), clase 4 (≥17.50 y < 50,00 UI/mL), clase 5 (≥50.00 y < 100,00 UI/mL) y la clase 6 (≥100.00 UI/mL).

5. estadístico análisis

1. Utilice un histograma para mostrar la tasa positiva de los 19 alergenos (figura 1) y la curva de Levey-Jennings para demostrar la capacidad de repetición de la detección de sistema (figura 2)⁹.
2. Seleccionar los tres más comunes alergenos inhalantes y alérgenos alimentarios (en total, seis alergenos) y comparar los resultados al sistema 1 para evaluar su rendimiento diagnóstico clínico^10,11. Incluyen la tasa de concordancia, sensibilidad, especificidad, valores predictivos positivo y negativo y el área bajo el receptor funcionando curva característica (ROC) (AUC) como los criterios de evaluación.
3. Aplicación de análisis de correlación de Spearman¹² para describir correlaciones entre los dos sistemas y utilizar el valor kappa de consistencia. Categorizar el valor de kappa como casi perfecto (0,8 – 1,0), sustancial (0,6 – 0,8), moderada (0,4 – 0,6), Feria (0.2 – 0.4) o pobre (< 0,2)¹³. Uso de análisis estadístico SPSS 23.0 y MedCalc 11.0 y definir P < 0.05 como significación estadística.

Resultados

Tasas positivas para los alergenos comunes 19
Los resultados de 293 sueros se muestran en la figura 3. Entre todos los alergenos inhalantes, D. farinae tuvo la mayor tasa de positiva (80.89%, 273/293), seguido por D. pteronyssinus (78.84%, 231/293). Entre los alérgenos alimentarios, el cangrejo tiene la mayor tasa positiva (20,48%, 60/293), seguido de 13,65% (40/293) de camarón. La tasa total positiva para aler...

Discusión

Similar a los resultados de otros muchos estudios^15,16,17, los resultados del sistema de microfluidos basado en sueros de pacientes alérgicos 293 demostró que casa los ácaros del polvo (como D. pteronyssinus, D. farinaey B. tropicalis) son los principales alergenos inhalantes lleva a enfermedades alérgicas en sur de China, mientras que para alimentos, leche, maní, camarón y cangrejo son los aler...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agnitio BioIC Analyzer	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	BA-G2000
BioIC Allergen specific-IgE Detection Kit	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	DR17A12
BioIC Cartrideg Placement plate	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	T20SET
BioIC Reagent Dispenser	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	DS-1
Image two-dimensional barcode machine	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	NLS-HR200
Software Package, LabIT	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	Version 2.4.12
VORTEX-5 Vortex Mixer	Haimen Kylinbell Lab Lastruments Co., Ltd.	VORTEX-5