バイオチップ マイクロ流体技術を応用した検出の血清中のアレルゲン特異免疫グロブリン E (sIgE)

要約

アレルギーの診断に血清特異免疫グロブリン E マイクロ カートリッジ ベースの化学発光システムとその有用性の評価を検出のためのプロトコルを提案する.

要約

アレルギー性疾患は、大人と子供の両方で共通です。原因となるアレルゲンの同定は疾患管理と予防に重要です。しかし、高い価格性能比を持つ特定免疫グロブリン E (IgE) 測定システムはプライマリ ・ ケアの病院を中心に、中国本土で欠けています。本稿では、血清中のアレルゲン特異的 IgE を検出するマイクロ カートリッジ ベースの化学発光システムを使用しての原理と操作手順について説明します。イムノ (システム 1)、工業規格からのそれらと比較した、共通のアレルゲンに感作患者を検出するシステムの再現性を評価します。イムノ (システム 1) と比較して BioIC システム (システム 2) が良好な精度と血清特異的 IgE 様々 な吸入、食物アレルゲンに対して、大幅に低いコストでの検出に感度を持って、その結果。それは低い金融手頃な価格を持っている中国本土のプライマリ ・ ケア病院でシステム 1 に良い代替として使用できます。

概要

アレルギーの有病率は過去数十年間に着実に増加しているし、¹の世界の人口の 20-30% に影響を及ぼしています。原因となるアレルゲンの同定は疾患の管理に重要な意義です。中国では、国で登録されている体内の皮膚プリック テストは利用できないので、血清特異的 IgE の in vitro における決定は最も重要な一般的に使用されるツールの I 型アレルギーは、²を診断します。これは西部の世界で実践に似ていますが、イムノ システム (システム 1) 蛍光酵素免疫測定の基本システムは体外アレルギー診断³のためのゴールド スタンダードとして認識されて、中国での使用は非常に限られたため高い機器と試薬価格。それ故に高い価格性能比を持つ新しい代替アレルギー診断システムが必要ひどく。

BioIC システム (システム 2) は血清特異的 IgE の多重アッセイ用化学発光原理に基づくマイクロ カートリッジ ベース システムです。サイズは 7 cm × 4 cm、マイクロ カートリッジはプラスチックの射出成形の 3 つの層で構成されます。上の部分は 3 mm 厚の透明なポリカーボネート熱アセンブリ プロセス中に良好な安定性を運ぶです。一緒にアクリロニ トリル、ブタジエン、スチレン (ABS) の共重合体から構成されて 3 mm 厚底層、それは 0.5 mm 厚の中間層シリコーンゴム製のサンドイッチします。色の黒が、中間層では、化学発光検出時により低い背景を提供しています。ケイ酸ゲルの上に硝酸セルロースの膜 (NC 膜) の薄層は異なるアレルゲン蛋白質のスポッティングが可能反応ゾーンに対応する位置に散布されています。本研究の目的は、多重化された血清中のアレルゲン特異的 IgE によるマイクロ流体システムの臨床性能評価することです。

プロトコル

この研究と人間の血清の使用は、最初提携病院の広州医科大学 (GYYY-2016-73) の倫理委員会によって承認されました。すべての参加者は、単独で、あるいは (子供) の場合親を介して彼らの書面による同意を与えています。

研究会の基本情報

注: 状態キー研究所の呼吸器疾患 (空気 SKLRD) のアレルギー情報リポジトリは広州呼吸研究所病院 (GIRH) 内に開設された大規模な血清銀行です。最後の十年に開始、空気 SKLRD、すでに収集し、一緒に彼らの臨床情報 (表 1)^4、5のアレルギー疾患患者の血清サンプルを格納始めました。空気 SKLRD 血清と現在の研究を行った。

1. 2015 年 1 月から 2018 年 6 月に採取した血清の空気 SKLRD のデータベースを検索し、地域で共通のアレルゲンに敏感であることがわかったのアレルギー性疾患を持つ患者を選択します。
2. すべての選択された患者にアレルギー性鼻炎や喘息やアレルギー性皮膚炎、じんましんなどのアレルギー関連疾患があるし、複数血清中のアレルゲン特異免疫グロブリン E (sIgE) がこれらの患者の血清に含まれていることを確保します。この地域は、システム 1 で検出された一般的なアレルゲンの感作。
3. これらの科学的な目的、それらの特定の免疫不全、免疫療法に現在これらの血清試料の使用に関するインフォームド コンセントを与えることを拒否する人フォロー アップに失われた不完全なカルテの患者を除外または免疫調節剤や寄生虫感染があることが分かった。
4. 検査所見への干渉を最小限に抑えるために血清コレクション前に治療や薬の処方が与えられていないことを確認します。条件を満たしていないすべての血清サンプルは拒否されました。

2. 研究の流れと利益の測定

注: マイクロ流体システムは、19 のアレルゲンを決定するための 100 μ L の血清を必要があります。静脈血 (5 mL) は、分離ゲルを含む真空血管を使用して各患者から採取しました。1,000 x gで 10 分間遠心分離した後、上層をテスト収集しました。未使用の血清は-80 ° C で保存されていた試験前に, 血清は、30 分間室温で保たれ、渦のミキサーと揺れた。凍結融解の繰り返しは避けた。

1. ヤケヒョウヒダニ(d1)、コナヒョウヒダニ(d2)、ろ紙性(d201)、猫のフケ (e1)、犬のフケ (e5) バミューダ島草 (g2) の全体のアレルゲンに sIgEs の血清サンプルを主にテスト、ティモシー草 (g6)、ゴキブリ (i6)、コウジカビの fumigatus (m3)、カンジダ ・ アルビカンス(m5)、ブタクサ (w1)、卵白 (f1)、ミルク (f2)、小麦 (f4)、ピーナッツ (f13)、大豆 (f14)、アーモンド (f20) ・ カニ (f23) ・海老 (f24)。セクション 3 で与えられた指示に従います。
   注: sIgE 定量は、化学発光分析装置によるアレルゲン特異的 IgE のアッセイ キット (材料の表を参照) と測定で行われました。
2. 再現性に関する十分な血清 (少なくとも 900 μ L) とサンプルの中から 3 つのサンプルをランダムに選択します。9 日間連続で毎日アレルゲン sIgEs の 3 つの血清を測定変更せずに、すべての条件を維持する (すなわち、総数 100 × 9 = 900 μ L の血清)。

3 マイクロ流体システムの半自動化テスト手順

注: システム 2 は、自動マイクロ流体技術、蛋白質のマイクロ アレイ、冷や光の解析、並列の IgE 解析と画像処理技術の統合です。テスト プロトコルは 4 つの部分に分けられる: 装置、サンプル読み込み、潜伏、および測定の準備。

1. 機器の準備
   1. PC とアナライザーの電源を入れます。
      注: 電源スイッチは底面の左側です。
   2. PC でラビ美術館プログラムを起動します。ダーク フレーム警告ウィンドウがポップアップする場合は、リークのテストを実行する[ok]をクリックします。その後、操作インターフェイスに入るように中心のロゴをクリックします。
      注: システムは、アイドル状態が 24 時間以上の場合は、リークのテストを実行するユーザーを思い出させます。
   3. 反応温度と CCD (電荷結合素子) 一時画面の右下隅で確認します。反応温度は 37 ° C ± 1 ° C、約 10 分で上昇して、CCD の温度は-15 ° C ± にドロップする必要が 1 ° C
   4. CCD の温度が-15 ° C ± にドロップ後漏れテストを実行 1 ° Cリークのテストを実行する前に計測器内部に残って他の項目がないことを確認し、ドアを閉じます。ツールをクリックして |システム テスト|リークテスト。テスト中にドアを開けないでください。テストを終了すると、レポート ウィンドウがポップアップ表示されます。
2. サンプル ロード
   1. マイクロ カートリッジに対応する試薬タンクに洗浄バッファー、バッファーの妨害の 120 μ L、60 μ A と B の基質 A と B、60 μ L、100 μ L の血清サンプルは抱合体の 620 μ L を追加します。
3. インキュベーション
   1. カートリッジ IDをクリックして、バーコード スキャナーを使用して、カートリッジのシリアル番号をスキャン、サンプル ID を入力、アナライザーにカートリッジを入れて、ドアを閉じる、アナライザーと分析を開始するを実行] をクリックします。
4. 測定
   1. 測定後結果を統計解析ソフトウェア (Excel など) をエクスポートします。
      注: インキュベーションの 30 分後アナライザー自動的に測定を実行、結果を報告します。
5. アナライザーの切り替え
   1. テストを終えた後、定期メンテナンスのため、カートリッジを取り外し、アナライザーの内部加熱鉄と電磁石 75% アルコールで軽く拭いてください。
      注: いないハードを押すか電磁石を振る。
   2. ラビ美術館ウィンドウを閉じます。温度監視ウィンドウがポップアップします。CCD が 5 ° C 保護モードにあたたまるとき自動的に閉じます。その後で、それはアナライザーと PC の電源をオフにしても安全になります。
      注: は CCD の温度は 5 ° C に上昇している前に、ウィンドウを監視する温度を手動で閉じていないと CCD のウォーミング アップ中に、アナライザーも PC の電源を切らないでください。

4. sIgE 反応の定義

注: 原液血清試料システム 2 の検出範囲は 0.21-100 IU/mL。

1. 0.35 IU/mL のしきい値に基づいて、正^6,7に 0.35 IU/mL を超える sIgE レベルを検討してください。⁸として sIgE テストの反応性の評価: クラス 1 (≥0.35、< 0.70 IU/mL)、クラス 2 (≥0.70 と < 3.50 IU/mL)、クラス 3 (≥3.50 と < 17.50 IU/mL)、クラス 4 (≥17.50 と < 50.00 IU/mL)、クラス 5 (≥50.00 と < 100.00 IU/mL)、とクラス 6 (≥100.00 IU/mL)。

5. 統計解析

1. ヒストグラムを使用して、(図 1) の 19 のアレルゲンの陽性率を示し、検出システム (図 2)⁹の再現性を示すため売れ行きジェニングス曲線を使用します。
2. 3 つの最も一般的な吸入性アレルゲンと食物アレルゲン (合計で、六つのアレルゲン) を選択し、その臨床診断性能^10,11を評価するシステム 1 に結果を比較します。一致率、感度、特異性、正と負の予測値、評価基準として動作して特性 (ROC) カーブ (AUC) 受信機の下の領域が含まれます。
3. スピアマンの相関分析¹²に 2 つのシステム間の相関関係を説明し、一貫性を保つのためのカッパ値を使用を適用します。カッパ値をほぼ分類パーフェクト (0.8-1.0)、実質的な物 (0.6-0.8)、中等度 (0.4-0.6)、fair (0.2-0.4)、または貧しい人々 (< 0.2)¹³。SPSS 23.0 とすぐ MedCalc 11.0 の統計的分析を使用し、 Pを定義 < 統計的有意性として 0.05。

結果

19 一般的なアレルゲンの陽性率
293 血清の結果は、図 3のとおりです。コナヒョウヒダニすべての吸入性アレルゲンの中で最も高い陽性率を持っていた (80.89%, 273/293) D.続いてヤケヒョウヒダニ(78.84%, 231/293)。食物アレルゲンの中でカニは最高の陽性率 (20.48%、60/293) 13.65% (40/293) エビが続きます。食物アレルゲンよ...

ディスカッション

結果と同様に他の多くの研究から^15,16,17、その家を示した 293 アレルギー患者の血清に基づくマイクロ流体システムから結果ダニ (含むヤケヒョウヒダニ、 D. コナヒョウヒダニとB. 性) が主な吸入性アレルゲンの食品、牛乳、ピーナッツ、エビ、カニはアレルギー症状を引き起こす最も一般的なアレルゲ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agnitio BioIC Analyzer	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	BA-G2000
BioIC Allergen specific-IgE Detection Kit	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	DR17A12
BioIC Cartrideg Placement plate	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	T20SET
BioIC Reagent Dispenser	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	DS-1
Image two-dimensional barcode machine	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	NLS-HR200
Software Package, LabIT	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	Version 2.4.12
VORTEX-5 Vortex Mixer	Haimen Kylinbell Lab Lastruments Co., Ltd.	VORTEX-5