יישום של טכנולוגיה Microfluidic ביו-שבב על סרום לזהות אלרגן ספציפיים אימונוגלובולין E (sIgE)

Summary

מאמר זה מציג פרוטוקול לגילוי סרום ספציפי אימונוגלובולין E עם מערכת chemiluminescence המבוסס על מחסנית microfluidic והערכת תועלתו באיבחונים אלרגיה.

Abstract

מחלה אלרגית שכיחה אצל מבוגרים וילדים. זיהוי של האלרגנים סיבתי הינו משמעותי ניהול מחלות ומניעה. עם זאת, מערכת מדידה אלקטרוני (IgE) אימונוגלובולין ספציפי עם יחס מחיר-ביצועים גבוהים חסר ביבשת סין, במיוחד בבתי-החולים טיפול ראשוני. מאמר זה מתאר את ההליכים עיקרון ותפעול של באמצעות מערכת chemiluminescence המבוסס על מחסנית microfluidic לזהות IgE הספציפי לאלרגן סרום. התוצאות הושוו עם אלה של ImmunoCAP (מערכת 1), תקן תעשייתי, ומוערכת הפארמצבטית של המערכת לזהות חולים ערים לו אלרגנים נפוצים. התוצאות הראו כי בהשוואה ImmunoCAP (מערכת 1), מערכת BioIC (מערכת 2) יש דיוק טוב ורגישות באיתור IgE ספציפי סרום נגד אלרגנים שונים שאיפה ומזון, אבל עם מחיר נמוך משמעותית. זה יכול לשמש אלטרנטיבה טובה מערכת 1 בבתי חולים טיפול ראשוני בסין יש מקלחון פיננסי נמוך.

Introduction

השכיחות של אלרגיות גדל בהתמדה בעשורים האחרונים, זה משפיע על 20-30% של האוכלוסייה הכללית¹. זיהוי של האלרגנים סיבתי יש משמעות חשובה בניהול המחלות. בסין, מאז בדיקות השמוק עור ויוו רשומים אינם זמינים בארץ, נחישות במבחנה של IgE ספציפי סרום הוא החשוב ביותר, כלי נפוץ עבור סוג אלרגיה המאבחן². זה דומה לשיטות בעולם המערבי, אך למרות מערכת ImmunoCAP (מערכת 1), מערכת immunosorbent מקושרים-אנזים פלורסצנטיות הבסיס, נתפשת כתהליך של תקן הזהב עבור אבחון האלרגיה במבחנה³, השימוש בסין הוא מאוד מוגבל בשל גבוהה וציוד ריאגנט במחיר. לפיכך מערכת חדשה של אבחון האלרגיה אלטרנטיבית עם יחס מחיר-ביצועים גבוהים נדרש קשות.

מערכת BioIC (מערכת 2) היא microfluidic המבוסס על מחסנית מערכת בהתבסס על העיקרון chemiluminescence של מבחני מרובבת של IgE ספציפי סרום. בגודל של 7 ס מ x 4 ס מ, הדיו microfluidic מורכב משלוש שכבות פלסטיק הזריקה יצוק. החלק העליון הוא 3 מ מעבה פוליקרבונט שקוף אשר נושאת את יציבות טובה במהלך תהליכי הרכבה תרמי. יחד עם השכבה התחתונה מ מ בעובי 3 בנוי קופולימר של בוטאדיאן, טבעי styrene (ABS), זה כריך של 0.5 מ מעבה שכבת הביניים עשוי גומי סיליקון. להיות שחור בצבע השכבה האמצעית מציע רקע נמוך יותר במהלך זיהוי chemiluminescence. על גבי סיליקה ג'ל, שכבה דקה של ניטרוצלולוזה קרום (ממברנה NC) מרוסס במיקום המתאים לאזור התגובה, המאפשר את איתור של חלבונים אלרגניים שונים. מטרתו של מחקר זה היא להעריך את הביצועים קליני של מערכת microfluidic מצפני מרובבת IgE הספציפי לאלרגן בנסיוב.

Protocol

מחקר זה, השימוש בנסיוב אדם דגימות אושרו על ידי ועדת האתיקה של הראשון המזוהה עם בית החולים של גואנגג'ואו האוניברסיטה הרפואית (GYYY-2016-73). כל המשתתפים נתנו את הסכמתם בכתב באופן עצמאי או דרך הוריהם (במקרה של ילדים).

1. מידע בסיסי של קבוצת המחקר

הערה: מאגר מידע אלרגיה של מדינת מפתח מעבדה של הנשימה המחלה (אוויר-SKLRD) הוא בנק סרום גדול שהוקם בתוך בית החולים גואנגג'ואו המכון נשימתית (GIRH). יזם בעשור האחרון, האוויר-SKLRD כבר התחיל לאסוף ולאחסן סרום דגימות מחולים במחלות אלרגיות, יחד עם^4,שלהם מידע קליני (טבלה 1)⁵. המחקר הנוכחי בוצע עם סרה מן האוויר-SKLRD.

1. חפש במאגר המידע של האוויר-SKLRD עבור סרה שנאסף בינואר 2015 עד 2018 יוני ובחר לחולים עם מחלה אלרגית, אשר נמצאו להיות רגישים לאלרגנים הנפוצים באזור.
2. להבטיח כי כל החולים שנבחרה יש מחלות אלרגיות הקשורות, כמו קדחת השחת או אסטמה, דלקת עור אלרגית, ו/או סרפדת, כי הסרום של חולים אלו מכיל סרום מרובים אלרגן ספציפיים אימונוגלובולין E (sIgE) sensitizations של אלרגנים נפוצים באזור זה, שזיהה את מערכת 1.
3. אל תכלול חולים עם לא שלם הרשומות הרפואיות, אלו איבדו ולצרכיו, אלה שמסרבים לתת הסכמה מדעת לגבי אופן השימוש שלהם הדוגמאות סרום למטרות מדעיות, אלה עם מזוהה כשל חיסוני, אלה כעת על חיסוני או immunomodulatory סוכנים, או אלו נמצא כי טפילי.
4. ודא שמרשם הטיפול או התרופה ניתנה לפני האוסף סרום כדי למזער הפרעה את ממצאי מעבדה. הדוגמאות סרום שאינם עונים על דרישות הקריטריונים נדחו.

2. ללמוד זרימה ומדידות עניין

הערה: מערכת microfluidic צריך µL 100 של נסיוב לקביעת 19 אלרגנים. דם ורידי (5 מ"ל) נאסף מתוך כל מטופל באמצעות כלי דם ואקום המכיל ג'ל הפרדת. לאחר צריך שתוציאו 10 דקות ב x 1000 גרם, השכבה העליונה נאסף לבדיקה. סרום שאינם בשימוש היה מאוחסן ב- 80 ° c לפני ביצוע בדיקות, הנסיוב נשמר בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, היה מנוער עם מערבל מערבולת. חוזרים ונשנים מחזורים ההקפאה-הפשרה היה נמנע.

1. בעיקר לבדוק את הדוגמאות סרום עבור sIgEs לאלרגנים שלם של Dermatophagoides pteronyssinus (d1), Dermatophagoides farinae (d2), Blomia tropicalis (d201), לפרוות חתולים (e1), יחסית לקשקשי הכלב (e5), ברמודה גראס (g2), טימותי דשא ( g6), תיקנים (i6) fumigatus אספרגילוס (m3), קנדידה אלביקנס (m5), אמברוסיה (w1), חלבון ביצה (f1), חלב (f2), חיטה (f4), בוטנים (f13), סויה (f14), שקדים (f20), סרטן (f23), שרימפס (f24). עקוב אחר ההוראות שניתנו בסעיף 3.
   הערה: נחישות sIgE נעשה עם IgE הספציפי לאלרגן assay קיט (ראה את הטבלה של חומרים) ומדד על ידי מנתח chemiluminescence.
2. בחר באופן אקראי 3 דגימות מקרב הדגימות עם סרום מספיק (לפחות 900 µL) למחקר הפארמצבטית. שמירה על כל התנאים ללא שינוי, למדוד את סרה שלושה עבור אלרגן sIgEs מדי יום 9 ימים רצופים (קרי, סך של 100 x 9 = 900 µL של סרום).

3. חצי אוטומציה שהליך הבדיקה של מערכת microfluidic

הערה: 2 מערכת היא השילוב של טכנולוגיית microfluidic אוטומטי microarray חלבון, אור קר ניתוח, ניתוח IgE מקבילים, טכנולוגיית עיבוד תמונה. פרוטוקול הבדיקה מחולק לארבעה חלקים: הכנה של ציוד, טעינה הדגימה, דגירה, מדידה.

1. הכנת הציוד
   1. הפעל את המחשב ואת הכוח מנתח.
      הערה: מתג ההפעלה הוא בצד השמאל של הבסיס.
   2. הפעלת התוכנית LabIT על המחשב. אם החלון אזהרה מסגרת כהה יצוץ, לחץ על אישור בדיקה הדליפה. לאחר מכן, לחץ על הסמל מרכז להיכנס לממשק מבצע.
      הערה: המערכת יזכיר למשתמש להריץ בדיקת דליפת אם אין פעילות במשך יותר מ 24 שעות.
   3. בדוק את זמני התגובה ואת CCD (תשלום מצמידים מכשיר) Temp בפינה הימנית התחתונה של המסך. זמני התגובה צריך לעלות 37 ° C ± 1 ° C כ- 10 דקות, ולשחרר הזמנית CCD צריך לטאוואנג ± 1 ° C.
   4. הפעל את בדיקת דליפת לאחר הזמנית CCD ירד ל לטאוואנג ± 1 ° C. לפני הפעלת המבחן הדליפה, ודא כי אין פריטים אחרים יישאר בתוך המכשיר ולסגור את הדלת. לחץ על כלים | בדיקת המערכת | בדיקת הדליפה. אל תפתח את הדלת במהלך הבדיקה. עם סיום הבדיקה, חלון דוח יופיע.
2. טעינה הדגימה
   1. הוסף µL 620 של מאגר לשטוף, µL 120 מאגר חסימה, 60 µL של conjugates A ו- B, µL 60 של המצע A ו- B, ו- µL 100 הדוגמאות סרום למיכל ריאגנט המתאימה שעל מחסנית microfluidic.
3. אינקובציה של רגשות
   1. לחץ על מזהה מחסנית, להשתמש בסורק ברקוד כדי לסרוק את המספר הסידורי של המחסנית, הזן את המזהה לדוגמה, להכניס את המחסנית במנתח וסגור את הדלת ולאחר לחץ על מנתח , הפעל כדי להתחיל את הניתוח.
4. מדידה
   1. לייצא את התוצאות לתוכנה סטטיסטית (למשל, Excel) לאחר המדידה.
      הערה: לאחר 30 דקות של דגירה, במנתח באופן אוטומטי מבצע את המדידה ומדווח על התוצאה.
5. החלפת במנתח
   1. תחזוקה שוטפת, מסיים את המבחן, להסיר את המחסנית, לנגב מנתח את חימום פנימי וברזל אלקטרומגנט בקלילות עם 75% אלכוהול.
      הערה: לא ללחוץ חזק או לנער את האלקטרומגנט.
   2. סגור את חלון LabIT. החלון ניטור טמפרטורה יופיע. היא תיסגר באופן אוטומטי כאשר ה-CCD מחממת למצב הגנה 5 ° C. עד אז, זה יהיה בטוח לבטל את הכוח של מנתח ו PC.
      הערה: לא לסגור באופן ידני את הטמפרטורה ניטור חלון לפני הזמנית CCD עלתה עד 5 מעלות צלזיוס, לא לכבות את מנתח ולא המחשב במהלך החימום CCD.

4. ההגדרה של תגובתיות sIgE

הערה: עבור הדגימה סרום מדולל, הטווח זיהוי של 2 מערכת הוא 0.21 – 100 IU/mL.

1. בהתבסס על ערך הסף של 0.35 IU/mL, שקול ברמה sIgE העולה על 0.35 IU/mL להיות חיובי^6,7. לדרג את תגובתיות של הבדיקות sIgE כ⁸: מחלקה 1 (≥0.35 ו < 0.70 IU/mL), כיתה 2 (≥0.70 ו < 3.50 IU/mL), מחלקה 3 (≥3.50 ו < 17.50 IU/mL), כיתה 4 (≥17.50 ו < 50.00 IU/mL), מחלקה 5 (≥50.00 ו < 100.00 IU/mL) , מחלקה 6 (≥100.00 IU/mL).

5. ניתוח סטטיסטי

1. השתמש היסטוגרמה הראה שיעור חיובי של האלרגנים 19 (איור 1) ולהשתמש העקומה Levey-ג'נינגס כדי להדגים את הדיר של זיהוי מערכת (איור 2)⁹.
2. בחר אלרגנים נשימתית הנפוץ ביותר שלושה אלרגנים (בסך הכל, אלרגנים 6) ולהשוות את התוצאות אני מערכת 1 כדי להעריך את ביצועי אבחון קליני^10,11. כוללים את קצב קונקורדנציה רגישות, ירידה לפרטים, ערכים חיוביים ושליליים חזוי, האזור שמתחת המקלט פועל אופייני (ROC) עקומת (AUC) כקריטריונים להערכה.
3. החל ספירמן נמצא מיתאם ניתוח¹² כדי לתאר מתאמים בין שתי המערכות ולהשתמש קאפה ערך עבור עקביות. לסווג את הערך קאפה כמעט מושלם (0.8-1.0), ניכר (0.6-0.8), בינוני (0.4-0.6), יריד (0.2-0.4) או עני (< 0.2)¹³. השתמש SPSS 23.0 וניתוח סטטיסטי MedCalc 11.0 ולהגדיר P 0.05 < כמו מובהקות סטטיסטית.

תוצאות

המחירים חיובי עבור 19 אלרגנים נפוצים
תוצאות סרה 293 מוצגים באיור3. בין כל האלרגנים נשימתית, farinae ד היה שיעור חיובי הגבוה ביותר (80.89%, 273/293), ואחריו ד pteronyssinus (78.84%, 231/293). בין האלרגנים מזון, סרטן יש שיעור חיובי הגבוה ביותר (20.48%, 60/293), ואחריו 13...

Discussion

דומה התוצאות ממחקרים רבים אחרים^15,16,17, התוצאות של המערכת microfluidic מבוסס על שרה מ-293 מטופלים אלרגית, הראה את הבית אבק קרדית (כולל pteronyssinus ד, ד farinae, ו tropicalis דרב) הם האלרגנים נשימתית הראשי המוביל למחלות אלרגיות בדרום סין, ואילו עבור ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agnitio BioIC Analyzer	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	BA-G2000
BioIC Allergen specific-IgE Detection Kit	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	DR17A12
BioIC Cartrideg Placement plate	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	T20SET
BioIC Reagent Dispenser	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	DS-1
Image two-dimensional barcode machine	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	NLS-HR200
Software Package, LabIT	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	Version 2.4.12
VORTEX-5 Vortex Mixer	Haimen Kylinbell Lab Lastruments Co., Ltd.	VORTEX-5