Aplicação da tecnologia de Microfluidic Biochip para detectar soro alérgeno-específicas E de imunoglobulina (sIgE)

Resumo

Este trabalho apresenta um protocolo para a detecção de imunoglobulina soro específico E com um sistema de cartucho-baseado da quimioluminescência microfluídicos e a avaliação de sua utilidade no diagnóstico de alergia.

Resumo

Doença alérgica é comum em adultos e crianças. Identificação dos alérgenos causadores é significativa na prevenção e gestão de doença. No entanto, um sistema de medição específico de imunoglobulina E (IgE) com uma relação preço-desempenho elevado está faltando na China continental, especialmente nos hospitais de cuidados primários. Este artigo descreve os procedimentos de princípio e operação de usando um sistema de cartucho-baseado da quimioluminescência microfluidic para detectar IgE alérgeno-específicos no soro. Os resultados foram comparados com os do ImmunoCAP (sistema 1), o padrão industrial, e a reprodutibilidade do sistema para detectar pacientes sensibilizados a alérgenos comuns é avaliada. Os resultados mostraram que, em comparação com o ImmunoCAP (sistema 1), o sistema BioIC (sistema 2) tem boa precisão e sensibilidade na detecção de IgE específicos do soro contra vários alérgenos inalantes e alimentos, mas com um custo significativamente menor. Ele pode servir como uma boa alternativa para sistema 1 em hospitais de cuidados primários na China continental, que têm menor disponibilidade financeira.

Introdução

A prevalência de alergias aumentou de forma constante nas últimas décadas e está afetando 20% - 30% da população global¹. Identificação dos alérgenos causadores tem um significado importante na gestão das doenças. Na China, uma vez que testes cutâneos de pele in vivo registrado não estão disponíveis no país, determinação in vitro de IgE do soro específico é o mais importante e ferramenta comumente usada para tipo I alergia diagnostica². Isso é semelhante às práticas no mundo ocidental, mas embora ImmunoCAP sistema (sistema 1), um sistema de base de enzima-lig da imunoabsorção fluorescência, é percebido como o padrão ouro para o diagnóstico de alergia in-vitro³, seu uso na China é muito limitado devido de seu alto preço do equipamento e do reagente. Portanto, é extremamente necessário um novo sistema de diagnóstico de alergia alternativo com uma relação preço-desempenho elevado.

O sistema BioIC (sistema 2) é um sistema baseado em cartucho microfluidic, baseado no princípio da quimioluminescência para multiplexado ensaios de IgE específicos do soro. Com um tamanho de 7 cm x 4 cm, o cartucho microfluídicos é composto de três camadas de plástico moldado por injeção. A parte superior é de 3 mm de espessura em policarbonato transparente que carrega boa estabilidade durante os processos de montagem térmica. Juntamente com a camada de 3 mm de espessura inferior construída a partir de um copolímero de acrilonitrila, butadieno e estireno (ABS), la sanduíches a 0,5 mm de espessura camada média feita de borracha de silicone. Sendo na cor preta, a camada média oferece mais baixo fundo durante a detecção de quimioluminescência. Em cima do gel de silicone, uma fina camada de membrana de nitrocelulose (NC membrana) é pulverizada na posição correspondente à zona de reação, que permite que a mancha de diferentes proteínas alergênicas. O objetivo deste estudo é avaliar o desempenho clínico do sistema microfluidic para determinação de IgE alérgeno-específicos no soro multiplexado.

Protocolo

Este estudo e o uso de amostras de soro humano foram aprovados pelo Comitê de ética da Universidade o primeiro afiliado Hospital de Guangzhou Medical (GYYY-2016-73). Todos os participantes têm dado o seu consentimento escrito independentemente ou através de seus pais (no caso das crianças).

1. base informações do grupo de estudo

Nota: O repositório de informações de alergia do estado chave laboratório de doença respiratória (ar-SKLRD) é um banco de grande soro estabelecido dentro do Hospital Instituto de Guangzhou respiratória (GIRH). Iniciada na última década, o ar-SKLRD já começou a coletar e armazenar amostras de soro de pacientes com doenças alérgicas, juntamente com suas informações clínicas (tabela 1)^4,5. O atual estudo foi realizado com soros do ar-SKLRD.

1. Banco de dados do ar-SKLRD para soros colhidos de janeiro de 2015 para junho de 2018 e seleccione os pacientes com doença alérgica, que foram encontrados para ser sensível para os alérgenos comuns na região.
2. Certifique-se de que todos os pacientes selecionados têm doenças alérgicas-relacionados, tais como rinite alérgica e asma, dermatite alérgica, ou urticária, e que o soro destes pacientes contém vários imunoglobulina de alérgeno específico de soro E (sIgE) sensibilizações de alérgenos comuns nesta região, detectados pelo sistema 1.
3. Excluir pacientes com prontuários incompletos, aqueles perdeu para acompanhamento, aqueles que se recusam a fornecer o consentimento informado sobre a utilização de suas amostras de soro para fins científicos, aqueles com uma imunodeficiência identificada, aqueles atualmente na imunoterapia ou agentes imunomoduladores, ou aqueles encontrados para ter infecções parasitárias.
4. Certifique-se de que nenhuma prescrição de tratamento ou medicamento foi dado antes da colheita de soro a fim de minimizar a interferência com os achados de laboratório. Todas as amostras de soro que não cumprem os critérios foram rejeitadas.

2. estudar o fluxo e as medidas de interesse

Nota: O sistema microfluidic precisa de 100 µ l de soro para a determinação de 19 alérgenos. O sangue venoso (5 mL) foi coletado de cada paciente, utilizando uma embarcação de sangue vácuo contendo gel de separação. Depois da centrifugação por 10min a 1.000 x g, a camada superior foi coletada para o teste. Não utilizado soro foi armazenado a-80 ° C. Antes do teste, o soro foi mantido em temperatura ambiente por 30 min e foi abalado com um misturador do vortex. Ciclos de congelamento e descongelamento repetidos foram evitados.

1. Principalmente, testar as amostras de soro para o evento inteiro alérgenos de Dermatophagoides pteronyssinus (d1), Dermatophagoides farinae (d2), Blomia tropicalis (d201), pelo de gato (e1), pelos de cão (e5), grama de Bermuda (g2), Timóteo (de grama G6), baratas (i6), Aspergillus fumigatus (m3), Candida albicans (m5), tasna (w1), clara de ovo (f1), leite (f2), trigo (f4), amendoim (f13), soja (f14), amêndoa (f20), caranguejo (f23) e camarão (f24). Siga as instruções dadas na secção 3.
   Nota: determinação do sIgE foi feita com o IgE alérgeno específico ensaio kit (veja a Tabela de materiais) e medido por um analisador de quimioluminescência.
2. Selecione aleatoriamente amostras de três dentre as amostras com suficiente (pelo menos 900 µ l) de soro para um estudo de reprodutibilidade. Mantendo todas as condições inalteradas, medir os três soros para evento de alérgeno diariamente por 9 dias consecutivos (ou seja, um total de 100 x 9 = 900 µ l de soro).

3. procedimento de teste semiautomação do sistema microfluídicos

Nota: O sistema 2 é a integração de tecnologia automática microfluidic proteína microarray, luz fria análise, análise paralela de IgE e tecnologia de processamento de imagem. Protocolo do teste é dividido em quatro partes: a preparação do equipamento, carregamento de amostra, incubação e medição.

1. Preparação do equipamento
   1. Ligue o PC e o poder do analisador.
      Nota: O interruptor de alimentação está à esquerda da base.
   2. Inicie o programa LabIT no PC. Se a janela de aviso de Quadro escuro aparece, clique em Okey para executar o teste de vazamento. Depois, clique no logo do centro para entrar na interface de operação.
      Nota: O sistema lembrará o usuário executar o teste de vazamento , se é ocioso por mais de 24 h.
   3. Verifique a temperatura de reação e CCD (charge - coupled device) Temp no canto inferior direito da tela. A temperatura de reação deve elevar-se a 37 ° C ± 1 ° C em cerca de 10 min, e o CCD Temp deve cair para-15 ° C ± 1 ° C.
   4. Executar o teste de vazamento após o CCD Temp baixou para-15 ° C ± 1 ° C. Antes de executar o teste de vazamento, certificar-se de que não existem outros itens dentro do instrumento e feche a porta. Clique em ferramentas | Teste de sistema | Teste de vazamento. Não abra a porta durante o teste. Quando o teste for concluído, a janela de relatório irá aparecer.
2. Carregamento de amostra
   1. Adicione 620 µ l de tampão de lavagem, 120 µ l de tampão de bloqueio, 60 µ l de conjugados A e B, 60 µ l de substrato A e B e 100 µ l de amostras de soro para o tanque de reagente correspondente no cartucho microfluidic.
3. Incubação
   1. Clique no ID do cartucho, use o scanner de código de barras para verificar o número serial do cartucho, digite a ID de amostra, colocar o cartucho para o analisador e fecha a porta e clique em Analyzer e executar para iniciar a análise.
4. Medição
   1. Exporte os resultados para o software estatístico (por exemplo, Excel) após a medição.
      Nota: Após 30 min de incubação, o analisador automaticamente executa a medição e relata o resultado.
5. Fora o analisador de comutação
   1. Para manutenção de rotina, depois de terminar o teste, remova o cartucho e limpe do analisador aquecimento interno ferro e eletroímã levemente com 75% de álcool.
      Nota: Não pressione com força ou agitar o eletroímã.
   2. Feche a janela LabIT. A janela de monitoramento de temperatura irá aparecer. Fechará automaticamente quando o CCD aquece para o modo de proteção de 5 ° C. Nessa altura, será seguro desligar a energia do analisador e PC.
      Nota: Não feche manualmente a janela de monitoramento antes que o CCD Temp aumentou para 5 ° C de temperatura e não desligue o poder do analisador nem o PC durante o warm-up CCD.

4. definição de reatividade sIgE

Nota: Para uma amostra de soro não diluído, o intervalo de detecção do sistema o 2 é 0,21 – 100 IU/mL.

1. Com base no valor limiar de 0,35 UI/mL, considere um sIgE nível superior a 0,35 UI/mL para ser positivo^6,7. Avaliar a reatividade dos testes sIgE como⁸: classe 1 (≥0.35 e < 0,70 UI/mL), classe 2 (≥0.70 e < 3,50 UI/mL), classe 3 (≥3.50 e < 17,50 UI/mL), classe 4 (≥17.50 e < 50,00 UI/mL), classe 5 (≥50.00 e < 100,00 UI/mL) e classe 6 (≥100.00 UI/mL).

5. análise estatística

1. Use um histograma para mostrar a taxa positiva dos 19 alérgenos (Figura 1) e use a curva de Levey-Jennings para demonstrar a repetibilidade da deteção sistema (Figura 2)⁹.
2. Selecione os três mais comuns alérgenos inalantes e alérgenos alimentares (no total, seis alérgenos) e comparar os resultados com o I 1 sistema para avaliar seu desempenho diagnóstico clínico^10,11. Incluem a taxa de concordância, sensibilidade, especificidade, valores preditivos positivos e negativos e a área sob o receptor operando curva característica (ROC) (AUC) como os critérios de avaliação.
3. Aplicação de análise de correlação Spearman¹² para descrever as correlações entre os dois sistemas e usar o valor de kappa para a consistência. Categorizar o valor de kappa como quase perfeito (0.8-1.0), substancial (0,6-0,8), moderada (0,4-0,6), razoável (0,2 – 0,4) ou pobres (< 0.2)¹³. Usar a análise estatística SPSS 23,0 e MedCalc 11.0 e definir P < 0,05 como significância estatística.

Resultados

Taxas positivas para 19 alérgenos comuns
Os resultados em 293 soro são mostrados na Figura 3. Entre todos os alérgenos inalantes, d. farinae tiveram a maior taxa positiva (80,89%, 273/293), seguido por D. pteronyssinus (% 78.84, 231/293). Entre os alérgenos alimentares, caranguejo tem a maior taxa positiva (20.48%, 60/293), seguido por 13.65% (40/293) para camarão. A taxa total de positiva para alérgenos in...

Discussão

Semelhante aos resultados de muitos outros estudos^15,16,17, os resultados do sistema microfluidic baseado em soros de 293 pacientes alérgicos mostrou aquela casa ácaros (incluindo d. pteronyssinus, D. farinaee b. tropicalis) são os principais alérgenos inalantes, levando a doenças alérgicas no sul da China, Considerando que para o alimento, leite, amendoim, camarão e caranguejo são os alérgen...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agnitio BioIC Analyzer	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	BA-G2000
BioIC Allergen specific-IgE Detection Kit	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	DR17A12
BioIC Cartrideg Placement plate	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	T20SET
BioIC Reagent Dispenser	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	DS-1
Image two-dimensional barcode machine	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	NLS-HR200
Software Package, LabIT	Agnitio Science & Technology(Taiwan, China)	Version 2.4.12
VORTEX-5 Vortex Mixer	Haimen Kylinbell Lab Lastruments Co., Ltd.	VORTEX-5