Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول توليد نماذج xenograft المتقوّدة من قبل المريض من خلال غرس خلايا سرطان الخلايا البولية عالية الجودة أو خلايا سرطان القولون والمستقيم داخل المستقيم في مرض السكري غير البدين / شديد مجتمعة الفئران نقص المناعة (NOD / SCID) لنمو الورم الأولي والانبثاث التلقائي تحت تأثير الخلايا اللمفية سترومال العقدة، والتي تحاكي تطور الأمراض النقيلية البشرية.

Abstract

يعاني مرضى السرطان من ضعف التكهن عند وجود مشاركة العقدة الليمفاوية (LN) في كل من سرطان الخلايا البولية عالي الجودة (HG-UCC) من المثانة وسرطان القولون والمستقيم (CRC). أكثر من 50٪ من المرضى الذين يعانون من UCC الغازية العضلات، على الرغم من العلاج العلاجي للأمراض الموضعية سريريا، سوف تتطور الانبثاث ويموتون في غضون 5 سنوات، وCRC النقيلي هو السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان في الولايات المتحدة. هناك حاجة إلى نماذج Xenograft التي تحاكي باستمرار UCC وCRC الانبثاث ينظر في المرضى. تهدف هذه الدراسة إلى توليد نماذج xenograft (PDOX) المستمدة من المريض من UCC وCRC لنمو الورم الأولي والانبثاث التلقائي تحت تأثير الخلايا سترومال LN تقليد تطور الأمراض النقيلية البشرية لفحص المخدرات. تم الحصول على أورام جديدة UCC وCRC من المرضى الذين تمت الموافقة عليهم الذين يخضعون لعملية استئصال لHG-UCC وسرطان الغدة الدرقية القولون والمستقيم، على التوالي. التلقيح المشترك مع الخلايا السترومال LN (LNSC) الخلايا التناظرية هونج كونج، والخلايا UCC الموسومة لوسيفيراز كانت داخل vesically (IB) غرست في الإناث غير السمنة السكري / شديدة الفئران نقص المناعة مجتمعة (NOD / SCID)، وكانت خلايا CRC داخل المستقيم (IR) حقن في ذكر NOD / SCID الفئران. تم رصد نمو الورم وورم خبيث أسبوعيا باستخدام التصوير الإنارة الحيوية (BLI). عند التضحية، تم حصاد الأورام الأولية وأجهزة الماوس، ووزنها، وثبت رسميًا للهيماتوكسيلين وإيوسين وتلطيخ الكيمياء المناعية. في نماذج PDOX الفريدة من نوعها، تشبه أورام xenograft أورام المريض قبل الزرع. في وجود خلايا هونج كونج، كلا النموذجين لديها معدلات زرع الورم عالية تقاس بـ BLI وأوزان الورم، 83.3٪ لUCC و 96.9٪ للجنة حقوق الطفل، وارتفاع معدلات الانبثاث عن الأعضاء البعيدة (33.3٪ الكشف عن الكبد أو سرطان الرئة لUCC و 53.1٪ لCRC). وبالإضافة إلى ذلك، فإن كلا النموذجين لا يحتويان على أي معدل وفيات بسبب هذا الإجراء. لقد أنشأنا نماذج PDOX فريدة من نوعها قابلة للاستنساخ لـ HG-UCC وCRC البشرية، والتي تسمح لتكوين الورم، والنمو، ودراسات الانبثاث. مع هذه النماذج، يمكن إجراء اختبار الأدوية العلاجية الجديدة بكفاءة وبطريقة تمثيلية.

Introduction

وقد تبين أن العقدة الليمفاوية (LN) الانبثاث هو مؤشر التكهن الفقراء في العديد من الأورام الخبيثة الأعضاء الصلبة، بما في ذلك سرطان الخلايا البولية عالية الجودة (UCC) من سرطان المثانة والقولون والمستقيم (CRC)1،2. أكثر من نصف المرضى الذين يعانون من UCC الغازية العضلات (MIUCC)، على الرغم من العلاج العلاجي للمرض الموضعي سريريا، سوف تتطور الانبثاث ويموتون في غضون 5 سنوات. تعتبر اتفاقية حقوق الطفل النقيلية أحد الأسباب الرئيسية للوفاة المرتبطة بالسرطان في الولايات المتحدة.

ومن المتوقع أن يحدث ما يقدر بـ 81,190 مريض جديد و17,240 حالة وفاة خاصة بالسرطان في عام 2018 في الولايات المتحدة بسبب UCC من المثانة3,4. في حين أن المرضى سوف في الغالب (70٪) الحالي مع مرض الغازية غير العضلات، وسوفيكون 30٪ MIUCC 5. على الرغم من العلاج العلاجي (استئصال المثانة الجذري [RC] مع أو بدون العلاج الكيميائي الجهازي) للمرض الموضعي سريريا، فإن نصف المرضى الذين يعانون من MIUCC من المثانة لا تزال تتطور الانبثاث ويموتون في غضون 5 سنوات3. تم العثور على مشاركة العقدة الليمفاوية في ما يقرب من 20٪ -25٪ من المرضى الذين خضعوا RC6،7،8. معدل البقاء على قيد الحياة لمدة خمس سنوات في المرضى إيجابية LN هو أقل من 35٪ حتى بعد RC، مما يشير إلى مشاركة LN كتوقع سلبي حاسم للتشخيص في المرضى UCC.

سرطان القولون والمستقيم هو ثالث أكثر حالات السرطان شيوعًا في كل من الرجال والنساء في الولايات المتحدة. تعتمد نتائج المريض إلى حد كبير على خصائص الورم والبيئة الدقيقة للورم، مثل عمق الغزو، ومشاركة LN، ونقائل الأعضاء البعيدة. على الرغم من أن معدل الوفيات في لجنة حقوق الطفل انخفض في العقد الماضي بسبب الفحص والعمليات الجراحية الفعالة، ويقدر أن ما يقرب من 50٪ من مرضى CRC سوف تتطور الانبثاث أو الأمراض المتكررة9.

توفر النماذج الحيوانية الصغيرة منصة سريعة وقابلة للاستنساخ وقابلة للتعديل لدراسة تطور الورم وأنماط النقيلي المختلفة. لا توجد حاليًا نماذج xenograft موصوفة تحاكي باستمرار CRC وUCC metastasis ينظر إليها في المرضى. الطريق الرئيسي للورم النقي للسرطان هو عن طريق انتشار اللمفاوية. تشير الأبحاث الجديدة إلى أن الـ LNs توفر الأورام ببيئة دقيقة فريدة من نوعها، وليست مجرد أهداف ثابتة حيث تمر الخلايا السرطانية بشكل عابر، ولكنها تلعب أيضًا دورًا أساسيًا من خلال التفاعل مع الخلايا السرطانية في العملية النقيلية. في الواقع، اكتشفت دراساتنا أنه، بالإضافة إلى تعليم وتعزيز تطور الورم والانبثاث، فإن البيئة الدقيقة سترومال LN مسؤولة أيضا عن مقاومة المخدرات في CRC10،11. أكد مختبرنا مؤخرا الآثار السرطانية للخلايا سترومال LN (LNSCs) على CRC وUCCs باستخدام نماذج الماوس xenograft المتوارثية المستمدة من المريض (PDOX)12،13.

تطوير نماذج PDOX يوفر منصة هامة لبحوث السرطان الترجمة14،15. من خلال الحفاظ على الخصائص الأنسجة والوراثية الرئيسية للورم المانح، نماذج PDOX تبقى مستقرة عبر الممرات وجعل منصات جيدة لبحوث السرطان الترجمة12،15. يتم استخدام نماذج PDOX لتقييم الأدوية قبل السريرية، وتحديد العلامات الحيوية، والتقييم قبل السريرية لاستراتيجيات الطب الشخصية التي تسمح للتنبؤ بالنتائج السريرية. حاليا، لا توجد نماذج xenograft الموصوفة التي تنظر في أهمية مشاركة LN وقادرة على استنساخ باستمرار الورم الأساسي وورم الأعضاء البعيد في CRC وUCC. في هذه الدراسة، ونحن نصف تطور نماذج PDOX في الفئران NOD / SCID مع استنساخ CRC النقيلي والأمراض UCC مع مشاركة LNSC.

Protocol

وقد أجريت جميع الأساليب الموصوفة في هذه الدراسات الحيوانية بموجب المبادئ التوجيهية المعتمدة للجنة الرعاية والاستخدام الحيوانية المؤسسية لنظام أوشسنر الصحي ووفقا ً للمبادئ التوجيهية للبحوث الحيوانية. تم جمع جميع أورام المرضى لهذه الدراسة من المرضى الذين تمت الموافقة عليهم الذين يخضعون لعمليات جراحية لاستئصال السرطان وفقا ً لمجلس مراجعة التحقيق في نظام أوشسنر الصحي والمعايير الأخلاقية للجنة المؤسسية المعنية بالبشر التجريب. حدد أخصائيو الأمراض المعتمدون من المجلس في نظام Ochsner الصحي التشخيصات المرضية لعينات المرضى استنادًا إلى السمات المجهرية للخلايا السرطانية، ونوعها النسيجي، ومستوى الصف.

ملاحظة: يصف البروتوكول التالي الخطوات الخاصة بنموذجين منفصلين من نماذج xenograft، وهو نموذج UCC عن طريق الكي الكهربائي لجدار المثانة لغرس خلايا UCC وحقن داخل المستقيم لخلايا CRC للدراسة في نموذج CRC. وجميع الخطوات التي تعد وترصد التجارب متطابقة بين النموذجين، بينما يصف الفرعان 7 و8 على وجه التحديد الإجراء المتعلق بغرس الغرس في الاتفاقية وحقن لجنة حقوق الطفل، على التوالي.

1. زراعة خطوط الخلايا

  1. تنمو خلايا هونج كونج في كامل RPMI-1640 المتوسطة تستكمل مع 10٪ مصل البقر الجنيني، 2 نم الجلوتامين، 100 U / مل البنسلين G، و 100 ملغ / مل العقديات في 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 المرطبة 5٪.
    ملاحظة: خلايا هونج كونج هي الخلايا الدنية الجريبية البشرية العادية ويمكن زراعتها وتوسيعها ل ≤ 15 الممرات في المختبر16.
  2. للتحضير لتجربة، جرّب الخلايا.
    1. إزالة الوسائط وإضافة 2 مل من 1٪ تريبسين في محلول الملح متوازن ة هانك (HBSS) إلى الخلايا. ضع الخلايا مرة أخرى في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 2 الرطبة بنسبة 5% عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 4 دقائق.
    2. جمع الخلايا من طبق في أنبوب 15 مل باستخدام المساعدات pipet المحمولة مع الأنابيب المصلية 10 مل المرفقة. أضف 8 مل من الـ RPMI-1640 متوسطة كاملة.
    3. الجمع بين 40 درجة مئوية من الخلايا و 40 درجة مئوية من الأزرق تريبان في بئر واحد من لوحة بئر 96. إضافة 10 ميكرولتر من الخليط إلى مقياس الهيموكيتومات وحساب الخلايا الحية. إضافة 1 مليون خلية في 25 مل كاملة RPMI-1640 المتوسطة إلى 150 ملم معقمة الأنسجة المعالجة بزراعة الطبق لمواصلة نمو الخلايا.
      ملاحظة: يجب استخدام تعليق خلية هونج كونج المعدة في هذه الخطوة في غضون ساعة للاختلاط مع الخلايا السرطانية للحقن.

2. جمع عينات المريض

  1. جمع أورام UCC من المريض وافق 15 (BlCaPt15، pT3b N1 M0) و 37 (BlCaPt37، pT3b pN0 M0) في جراحة الاستئصال.
  2. جمع أورام CRC من المريض موافقة 155 (CoCaPt155، T1 N0 M0) و 302 (CoCaPt302، T1 N0 M0) في جراحة الاستئصال.

3. توسيع ورم المريض

  1. جمع الأورام في الجراحة في وسط McCoy العقيمة الباردة التي تحتوي على البنسلين G (500 U / مل) والعقدية (500 ملغ / مل).
  2. زرع الأورام مباشرة في الجناح الأيسر والأيمن من 6-8 أسابيع من الإناث الإناث NOD / SCID الفئران.
    1. الأنسجة mince ميكانيكيا إلى قطعصغيرة (~ 1 مم 3) باستخدام مقص الجراحية الصغيرة.
    2. زرع الأنسجة تحت الجلد إلى الجناح الأيسر والأيمن باستخدام 13 G نخاع العظم شفط خزعة الإبر.
      ملاحظة: زرع حجم إجمالي من 8 مم3 مقسمة بالتساوي إلى كلا الجانبين من الجناح.

4. وضع العلامات وإثراء الأورام المسمى لوسيفيراز

  1. قياس نمو الورم مرتين في الأسبوع باستخدام الفرجار الرقمي.
  2. في 1 سم في القطر، ورم تحويل. حقن مباشرة في الورم مع جرعة واحدة من البروتين الفلورسنت لوك / الأحمر (RFP)-lentivirus (50 μL / الورم، 1:30 تخفيف من الأسهم ارتفاع titer lentivirus مركزة) باستخدام حقنة 1 سم مكعب مع إبرة 27 G.
    ملاحظة: يصل عمق ورم المريض عادة ً إلى 1 سم في 1-2 شهر. ومع ذلك، فإن معدل النمو متغير للغاية ويستند إلى عدد من العوامل بما في ذلك درجة الورم ونوعه.
  3. مراقبة الورم أسبوعيا عن طريق التصوير الحيوي (BLI) في الحيوانات الحية.
    1. وزن الفئران. حقن الماوس واعية مع 150 ملغ / كغ لوسيفيرين داخل اقعيان وانتظر 5 دقائق لالركيزة لتعميم في جسم الماوس.
    2. التخدير الماوس مع 2.5٪ isoflurane في الأكسجين 100٪، 1 L / دقيقة في غرفة التعريفي.
    3. وضع الماوس على المعدة في آلة التصوير BLI مع isoflurane تتدفق والصورة. التقاط الصور المتسلسلة لتأكيد وجود مناطق الورم الإيجابي لوك / RFP (صورة ملونة بيولوجيا كاذبة الإنارة). عودة الماوس إلى القفص بعد اكتمال التصوير.

5. حدد الجزء المناسب من الورم للهضم الأنزيمي

  1. في يوم إجراء UCC أو CRC، وسم الماوس الصور مع لوسيفيراز الورم كما هو الحال في الخطوات 4.3.1−4.3.3.
    ملاحظة: يعتمد طول الوقت لنمو الورم تحت الجلد على سرعة نمو الورم والعدد المخطط للالحيوانات التي سيتم حقنها في التجربة.
  2. حصاد الورم من جانب الماوس والصورة.
    1. قتل الماوس عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون بعد التصوير. ضع الماوس في غرفة CO 2، قم بتشغيل الغاز بسرعة 1.4 لتر/دقيقة حتى توقف الجهاز التنفسي واتركه لمدة 3 دقائق.
    2. بشرة نظيفة مع الإيثانول 70٪. خيمة الجلد مباشرة فوق الورم. مع مقص الجراحية جعل شق صغير في الجلد. فصل الجلد عن الورم مع مقص.
    3. إزالة الورم ومكان في طبق بيتري معقمة. صورة طبق كامل في آلة التصوير.
  3. استخدم مقص معقم أو مشرط لفصل المقاطع السلبية لوسيفيراز عن المقاطع الإيجابية لوسيفيراز في الورم وإعادة الصورة.
  4. كرر حتى تبقى قطع الورم الأكثر إيجابية للغاية.

6. الهضم الأنزيمي للورم

  1. تحت غطاء تدفق اللامينار، mince luciferase قطع الورم الإيجابية (الخطوة 5.4) في أصغر القطع الممكنة باستخدام مقص الجراحية العقيمة ووضعها في أنبوب مخروطي معقمة 50 مل.
    ملاحظة: فرم الورم إلى أصغر القطع الممكنة سوف تسفر عن المزيد من الخلايا الفردية.
  2. إعداد محلول هضمي عن طريق إضافة 10 مل من الكولاجين الرابع (1.5 ملغ / مل)، 80 ميكرولتر من hyaluronidase (20 ملغ / مل)، و 160 ميكرولتر من ديوكسيريبونوكليس الأول (0.1 ملغ / مل) إلى 40 مل من HBSS. مزيج الحل عن طريق عكس.
  3. أضف 35-40 مل من محلول الهضم إلى الورم المفروم. حضانة في 37 درجة مئوية مع دوران مستمر لمدة 2 ساعة.
    ملاحظة: هز أنبوب بقوة بشكل دوري في جميع أنحاء الحضانة لمنع أنسجة الورم من التكتل.
  4. تصفية الهضم بأكمله من خلال مصفاة خلية معقمة 100 ميكرومتر تليها مصفاة خلية 40 ميكرومتر لإزالة الحطام. حفظ تدفق من خلال وتجاهل الحطام.
  5. غسل الخلايا الحرة عن طريق إضافة 20 مل من HBSS والطرد المركزي في 329 × ز لمدة 5 دقائق.
  6. الجمع بين 10 درجة مئوية من محلول الخلية و 90 درجة مئوية من الأزرق تريبان في بئر واحد من لوحة بئر 96. عد الخلايا الحية باستخدام مقياس الهيميسي.
  7. نقل 1 × 104 إلى 1 × 106 خلايا الورم لكل ماوس إلى أنبوب مخروطي معقمة 15 مل. إضافة 3 × 105 خلايا هونج كونج من الخطوة 1.2.3 لكل ماوس، إلى نفس الأنبوب مع الخلايا السرطانية.
    ملاحظة: استخدم أنبوب مخروطي معقم 50 مل إذا تجاوز الحجم الإجمالي 15 مل. دائما حساب المزيد من الجرعات للالحيوانات الإضافية لكل مجموعة دراسة لحساب فقدان السوائل أثناء استخدام الحقنة. على سبيل المثال، إذا كانت المجموعة تحتوي على 5 فئران، قم بإجراء خلايا كافية لـ 6 أو 7 فئران.
  8. الطرد المركزي في 329 × ز لمدة 5 دقائق.
  9. إعادة تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر لكل ماوس لنموذج UCC أو 10 ميكرولتر لكل ماوس لنموذج CRC في وسائط RPMI كاملة. احتفظ بتعليق الخلايا على الثلج حتى يصبح جاهزاً للاستخدام.

7. UCC نموذج الماوس

  1. إعداد الفئران للإجراء
    1. الحصول على ستة إلى ثمانية أسابيع من العمر الإناث NOD / SCID الماوس. حلاقة أسفل ظهور الماوس باستخدام كريم إزالة الشعر. التخدير الماوس في غرفة التعريفي مع isoflurane (2.5٪ في الأكسجين 100٪، 1 لتر / دقيقة).
    2. مرة واحدة مخدر، وضع الماوس في موقف supine مع وضعها في مخروط الأنف isoflurane وعارية مرة أخرى ترتكز بقوة على قطب التشتت.
      ملاحظة: يتم تخدير الماوس تماماً إذا لم يستجب لقرصة اصبع القدم.
  2. غرس خلايا UCC المعدة في الخطوة 6.9 إلى المثانة باستخدام قسطرة وعائية (الشكل1Aa, Ab).
    1. قم بإعداد آلة إحتكار الكي الكهربائي وتعيينها إلى قوة 4 W. تليين 24 G القسطرة الوعائية العقيمة مع هلام التشحيم وإدراج من خلال مجرى البول من الماوس الإناث.
      ملاحظة: قد يشعر مقاومة طفيفة. دفع بلطف إلى الأمام أو إزالة القسطرة الوعائية وتكرار. لا تجبري إذا انحنين القسطرة عند الدخول، أدخل سلكًا إرشاديًا معقمًا (انظر 7.2.2) في منتصف الطريق إلى القسطرة لتوفير الاستقرار.
    2. أدخل بالكامل سلك توجيه النواة الثابتة الثابتة 0.025 بوصة 1 مم بعد نهاية القسطرة الوعائية.
      ملاحظة: يتم وضع علامة على السلك مع الشريط قبل الإجراء للإشارة إلى نقطة التوقف 1 مم وتأمين التناسق.
    3. عقد دبوس مونوبولي إلى سلك دليل ل1 s السماح لتهيج الكهربائية من الغشاء المخاطي للمثانة.
    4. إرفاق قسطرة وعائية معقمة جديدة إلى 1 سم مكعب luer-lok حقنة ورسم 200 ميكرولتر من الخلايا التي تم جمعها من الخطوة 6.9.
      ملاحظة: يتم فقدان ما لا يقل عن 100 ميكرولتر من القسطرة الوعائية إلى الحقنة. التعويض عن حجم الخسارة عند حساب حجم تعليق الخلية المطلوبة.
    5. إزالة الأسلاك الإرشادية والقسطرة الوعائية من مجرى البول الماوس. أدخل القسطرة الوعائية مع حقنة الخلايا المرفقة في مجرى البول.
      ملاحظة: يجب أن يكون التقدم أسهل من ذي قبل.
    6. غرس 50 ميكرولتر من الخلايا إلى المثانة الماوس. انتظر بضع ثوان قبل إزالة القسطرة الوعائية للسماح للخلايا بالتمسك بجدار المثانة.
      ملاحظة: تبقى الخلايا في المثانة وتتطور إلى ورم أساسي.
  3. إزالة الماوس من مخروط الأنف isoflurane وسادة التأريض. مراقبة الماوس لمدة ساعة 1 الإجراء التالي. ابحث عن علامات الشدة، أي الظهر الحدس، والتنفس المجهد، الخ.

8. نموذج الماوس CRC

  1. التخدير ستة إلى ثمانية أسابيع من العمر الذكور NOD / SCID الماوس مع isoflurane (2.5٪ في الأكسجين 100٪، 1 لتر / دقيقة) في غرفة التعريفي. تأكيد التخدير مع قرصة اصبع القدم.
  2. وضع الماوس التخدير في موقف supine تحت المجهر تشريح، والتأكد من تأمين خطفهم إلى أنف isoflurane وتأمين أطرافهم الأمامية مع الشريط للاستقرار.
    ملاحظة: يمكن استخدام Loupes بدلاً من مجهر تشريح. يمكن استخدام كائن صغير لتحسين الرؤية والزاوية عند وضعها تحت قاعدة الذيل، ورفع فتحة الشرج. عادة، يتم توالت أجزاء صغيرة من الشاش في شكل اسطوانة من قطر 1 بوصة.
  3. قم بفصل القناة الشرجية باستخدام ملقط مشحم مشحم مشحم مشحم لكشف الشرج القاصي والغشاء المخاطي المستقيمي. إزالة البراز.
  4. استخدم إبرة قابلة للإزالة بوزن 30 غ معقمة على حقنة زجاجية بوزن 50 ميكرولتر لحقن 10 ميكرولتر من الخلايا السرطانية وخلايا هونج كونج (من الخطوة 6.9) في تحت الغشاء الفرعي المستقيمي الخلفي القاصي القاصي 1 إلى 2 مم فوق القناة الشرجية. يجب تغطية شطبة الإبرة بالغشاء المخاطي. يجب الحرص على عدم المرور إلى تجويف الحوض.
  5. إزالة الماوس من مخروط الأنف isoflurane. مراقبة الماوس لمدة ساعة 1 الإجراء التالي. ابحث عن علامات الشدة، أي الظهر الحدس، والتنفس المجهد، الخ.

9- التصوير الإنارة الأحيائية

  1. مراقبة الورم الأولي, الكبد, والرئة عبء النقيلي أسبوعيا باستخدام نظام التصوير bioluminescent لنشاط لوسيفيراز.
    1. الحصول على ماوس من UCC أو CRC التجربة والوزن. حقن 150 ملغ / كغ لوسيفيرين داخل اقابي وانتظر 5 دقائق لالركيزة لتعميم في جسم الماوس.
    2. التخدير الماوس مع 2.5٪ isoflurane في الأكسجين 100٪، 1 L / دقيقة في غرفة التعريفي.
    3. وضع الماوس في آلة التصوير BLI مع الأنف ثابتة في أنف. عند الكشف عن الصورة، تأكد من أن منطقة الاهتمام تواجه الكاميرا. بالنسبة لحقن UCC وCRC، يجب أن يواجه الجانب البطني الكاميرا لكل صورة. صورة الماوس في موقف supine.

10. حصاد الأعضاء والورم

  1. عندما يصل تألق الإنارة الورم الأولي 1 × 1011 فوتونأو إذا كانت الفئران تظهر علامات الشدة (أي فقدان الوزن، حدس الظهر، والتنفس القاسي / المجهد، وما إلى ذلك)، قتل الفئران عن طريق استنشاق CO2 (كما هو الحال في الخطوة 5.2.1) بعد لوسيفيرين الحقن والتصوير لكامل الجسم.
  2. إزالة الكبد والرئة، ووضعها في طبق بيتري وصورة لتحديد أي الانبثاث. إزالة الورم والوزن والصورة. إصلاح الأعضاء والورم في 10٪ محايدة المخزنة الرسمية لمدة 48 ساعة في درجة الحرارة المحيطة.
    ملاحظة: تنظيف / مسح مقص وملقط بين كل عضو لتجنب نقل الأنسجة.

11. التقييم النسيجي

  1. تضمين الأنسجة الثابتة formalin في البارافين وشريحة الأنسجة في سمك 5 ميكروتومي على ميكروتومي للهيماتوكسيلين ويوسين (H & E) والمناعية الكيميائية (IHC) تلطيخ.
    ملاحظة: تم إجراء جميع H & E تلطيخ الشرائح البارافين في مختبر علم الأمراض من نظام الصحة Ochsner، وتم تنفيذ جميع تلطيخ IHC في هذه الورقة في مختبر البحوث من نظام الصحة Ochsner بعد ارتفاع درجة الحرارة مستضد استرجاع باستخدام Ki67 و سيتوكيراتين 20 الأجسام المضادة، تليها الأجسام المضادة الثانوية biotinylated، ومجمعات أفيدين البيوتين بيروكسيداز وفقا لتعليمات الشركة المصنعة13،17.

النتائج

في نموذج PDOX UCC، كانت خلايا BlCaPt15 أو BlCaPt37 المرضى UCC داخل vesically (IB) غرست في وجود خلايا هونج كونج في الإناث NOD / SCID المثانة الماوس (الشكل1A). خمسة وعشرون من أصل ثلاثين (83.3 في المائة) الحيوانات ولدت الأورام الأولية وعرض نمو الورم الأولية تعتمد على الوقت على أساس BLI الأ...

Discussion

المرض النقيلي هو المسؤول عن معظم وفيات مرضى السرطان. في الاختبارات العلاجية قبل السريرية، من المهم جداً إنشاء نماذج الماوس التي تحاكي نمو الورم البشري بشكل وثيق مع الانبثاث الجهاز البعيد التلقائي. استخدام نماذج المورين مع زرع الخلايا السرطانية المشتقة من ورم المريض (xenografts) يسمح لفهم أفضل...

Disclosures

وقد تم دعم هذه الدراسة جزئيا من قبل منحة مبادرة أبحاث الطب الترجمة Ochsner 2014. ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

ويشكر المؤلفون برايان رويتر، ودانييل بيرتوني، وبيتر ميلر، وشانون ماتشيسني الذين ساعدوا في بدء هذه الدراسات على دعمهم التقني الممتاز. كما يشكر المؤلفون هيذر غرين ماترانا ومارغريت فاريانو وسونيل تالوار وماريا لاتسي على مساعدتهم في مساعدة المرضى على الموافقة وتوفير عينات الورم.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Avidin-biotin-peroxidaseVector Labs IncPK-6100
Biotinylated secondary antibodyVector Labs IncBA-1000
Collagenase IV (1.5 mg/mL)Worthington Biochemical CorporationLS004189
Deoxyribonuclease I (0.1 mg/mL)SigmaD4263
D-Luciferin (150 mg/kg)Perkin Elmer122796
Formalin (10% neutral buffered)Leica46129
glutamine (2 nM)Fisher Scientific35050061
Hair Removal CreamChurch & Dwight Co., Inc1 (800) 248-8820
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)Fisher ScientificSH30016.02
Hyaluronidase (20 mg/mL)SigmaH3884
IsofluraneHenry Schein Animal Health108333
Luc/RFP-lentivirusFrom our collaborators. See reference 13: Gills, J. et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729, doi:10.18632/oncotarget.26024 (2018).
McCoy’s mediumLife Technologies110862
penicillin/streptomycin 100 mL (100 U/mL)Fisher Scientific15140-122
RPMI-1640 MediumAmerican Type Culture Collection110636
Trypan BlueSigmaT6146
Trypsin/EDTALife Technologies15400-054
NameCompanyCatalog NumberComments
Gas
100% OxygenAirgas IncOX USP200
100% CO2Airgas IncCD USPE
NameCompanyCatalog NumberComments
Mice
6-8 week old NOD/SCID Mice (male)Jackson Lab001303
6-8 week old NOD/SCID Mice (female)Jackson Lab001303
NameCompanyCatalog NumberComments
Immunohistochemistry
HematoxylinSigmaGHS232
Ki-67 Rabbit Monoclonal AntibodyThermo ScientificRM-9106-S
NameCompanyCatalog NumberComments
Tools
40 µm cell strainerFisher Scientific08-771-1
100 µm cell strainerFisher Scientific08-771-19
15 mL Conical TubeSarstedt11799
50 mL Conical tubeSarstedt15762
150 mm Tissue Culture DishUSA Scientific IncCC7682-3614
96 Well plateUSA Scientific IncCC7682-7596
ForcepsSymmetry Surgical Inc06-0011
Surgical scissorsSymmetry Surgical Inc02-2011
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
5% CO2 humidified incubatorThermo Scientific3110
Bioluminescent (BLI) Imaging MachinePerkin ElmerCLS136334
BLI Imaging Machine SoftwarePerkin ElmerCLS136334
CentrifugeBeckman366830
Deconvoluting MicroscopeIntelligent Imaging InnovationsMarianas
Deconvoluting Microscope Imaging SoftwareIntelligent Imaging Innovations+1 (303) 607-9429 x1
Digital caliperFowler Tools and Instruments54-115-330
Dissecting microscopePrecision Instruments LLC(504) 228-0076
Electrosurgical generatorValleyLabFORCE1C20
Isoflurane Induction ChamberPerkin Elmer119038
MicrotomeAmerican Optical Corporation829
Pipet AidFisher Healthcare13-681-15E
Serological pipet (10 mL)Sarstedt86.1254.001

References

  1. Sundlisaeter, E., et al. Lymphangiogenesis in colorectal cancer--prognostic and therapeutic aspects. International Journal of Cancer. Journal international du cancer. 121, 1401-1409 (2007).
  2. Gout, S., Huot, J. Role of cancer microenvironment in metastasis: focus on colon cancer. Cancer Microenvironment. 1, 69-83 (2008).
  3. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 68, 7-30 (2018).
  4. Hautmann, R. E., de Petriconi, R. C., Pfeiffer, C., Volkmer, B. G. Radical cystectomy for urothelial carcinoma of the bladder without neoadjuvant or adjuvant therapy: long-term results in 1100 patients. European Urology. 61, 1039-1047 (2012).
  5. Stein, J. P., et al. Radical cystectomy in the treatment of invasive bladder cancer: long-term results in 1,054 patients. Journal of Clinical Oncology. 19, 666-675 (2001).
  6. Lerner, S. P., et al. The rationale for en bloc pelvic lymph node dissection for bladder cancer patients with nodal metastases: long-term results. The Journal of Urology. 149, 758-764 (1993).
  7. Poulsen, A. L., Horn, T., Steven, K. Radical cystectomy: extending the limits of pelvic lymph node dissection improves survival for patients with bladder cancer confined to the bladder wall. The Journal of Urology. 160, 2015-2019 (2020).
  8. Margolin, D. A., et al. Lymph node stromal cells enhance drug-resistant colon cancer cell tumor formation through SDF-1alpha/CXCR4 paracrine signaling. Neoplasia. 13, 874-886 (2011).
  9. Vermeulen, L., et al. Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment. Nature Cell Biology. 12, 468-476 (2010).
  10. Margolin, D. A., et al. The critical roles of tumor-initiating cells and the lymph node stromal microenvironment in human colorectal cancer extranodal metastasis using a unique humanized orthotopic mouse model. FASEB Journal. 29, 3571-3581 (2015).
  11. Gills, J., et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729 (2018).
  12. Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).
  13. Hiroshima, Y., et al. Patient-derived mouse models of cancer need to be orthotopic in order to evaluate targeted anti-metastatic therapy. Oncotarget. 7, 71696-71702 (2016).
  14. Kim, H. S., Zhang, X., Klyushnenkova, E., Choi, Y. S. Stimulation of germinal center B lymphocyte proliferation by an FDC-like cell line, HK. The Journal of Immunology. 155, 1101-1109 (1995).
  15. Hite, N., et al. An Optimal Orthotopic Mouse Model for Human Colorectal Cancer Primary Tumor Growth and Spontaneous Metastasis. Diseases of the Colon and Rectum. 61, 698-705 (2018).
  16. Jager, W., et al. Ultrasound-guided intramural inoculation of orthotopic bladder cancer xenografts: a novel high-precision approach. PloS One. 8, e59536 (2013).
  17. Schirner, M., et al. Integrin alpha5beta1: a potent inhibitor of experimental lung metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 16, 427-435 (1998).
  18. Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445, 111-115 (2007).
  19. Todaro, M., et al. Colon cancer stem cells dictate tumor growth and resist cell death by production of interleukin-4. Cell Stem Cell. 1, 389-402 (2007).
  20. Lee, J. S., et al. Tumor establishment features of orthotopic murine bladder cancer models. Korean Journal of Urology. 53, 396-400 (2012).
  21. Hadaschik, B. A., et al. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging. BJU International. 100, 1377-1384 (2007).
  22. Silinsky, J., et al. CD 133+ and CXCR4+ colon cancer cells as a marker for lymph node metastasis. The Journal of Surgical Research. 185, 113-118 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

147xenograftmicroenvironment

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved