JoVE 비디오를 활용하시려면 도서관을 통한 기관 구독이 필요합니다. 전체 비디오를 보시려면 로그인하거나 무료 트라이얼을 시작하세요.
Method Article
이 프로토콜은 환자 유래 정형외 이종이식 모델의 생성을 중급 요뇨세포 암종 세포 또는 직장 내 대장암 세포를 비만 당뇨병/중증 복합으로 주입하여 생성하는 것을 설명합니다. 면역 결핍 (NOD /SCID) 림프절 기질 세포의 영향하에 1 차적인 종양 성장 및 자발적인 전이를 위한 마우스, 이는 인간 전이성 질병의 진행을 모방합니다.
암 환자는 림프절 (LN) 침범이 방광과 대장암 (CRC)의 고급 비뇨기과 세포 암종 (HG-UCC)에 존재할 때 나쁜 예후를 가지고 있습니다. 근육 침습성 UCC를 가진 환자의 50% 이상은, 임상으로 현지화한 질병을 위한 치료 치료에도 불구하고, 전이를 개발하고 5 년 안에 정지할 것이고, 전이성 CRC는 미국에 있는 암 관련 죽음의 주요한 원인입니다. 환자에서 볼 수 있는 UCC 및 CRC 전이를 일관되게 모방하는 이종이식 모델이 필요합니다. 본 연구는 약물 스크리닝을 위한 인간 전이성 질환의 진행을 모방한 LN 기질 세포의 영향하에 1차 종양 성장 및 자발적 전이를 위한 UCC 및 CRC의 환자 유래 직교 이종이식(PDOX) 모델을 생성하는 것을 목표로 한다. 신선한 UCC 및 CRC 종양은 각각 HG-UCC 및 대장 선암에 대한 절제술을 받는 동의된 환자로부터 얻어졌습니다. LN 기질 세포 (LNSC) 아날로그 HK 세포와 병용 접종, 루시페라아제 태그 UCC 세포는 여성 비만 당뇨병 / 심한 결합 면역 결핍 (NOD / SCID) 마우스로 주입 된 내 정맥 (IB) 및 CRC 세포는 내-직장 (IR)으로 주입되었다 남성 NOD / SCID 마우스. 종양 성장 및 전이를 생물 발광 이미징(BLI)을 사용하여 매주 모니터링하였다. 희생시, 1 차적인 종양 및 마우스 기관은 헤마톡실린및 에오신 및 면역히스토화학 염색을 위해 수확, 칭량 및 포르말린 고정되었습니다. 우리의 독특한 PDOX 모형에서는, 이종이식 종양은 환자 전 이식 종양을 유사합니다. HK 세포의 존재에서, 두 모형은 BLI와 종양 무게에 의해 측정된 높은 종양 이식 비율이, UCC를 위한 83.3% 및 CRC를 위한 96.9%, 및 높은 먼 기관 전이 비율 (UCC를 위한 33.3% 검출된 간 또는 폐 전이 및 CRC를 위한 53.1%). 또한, 두 모델 모두 절차에서 사망률이 0입니다. 우리는 종양 형성, 성장 및 전이 연구를 허용하는 인간 HG-UCC 및 CRC를 위한 독특하고 재현 가능한 PDOX 모형을 설치했습니다. 이러한 모델을 통해 새로운 치료 약물의 테스트는 임상적으로 모방된 방식으로 효율적이고 수행될 수 있습니다.
림프절(LN) 전이는 방광 및 대장암(CRC)의 고급 비뇨기과 세포 암종(UCC)을 포함한 많은 고체 장기 악성 종양에서 불량한 예후 지표임을 나타내었다1,2. 근육 침습성 UCC (MIUCC)를 가진 환자의 반 이상은, 임상적으로 국소화한 질병을 위한 치료 치료에도 불구하고, 전이를 개발하고 5 년 안에 정지할 것입니다. 전이성 CRC는 미국에 있는 암 관련 죽음의 주요한 원인입니다.
약 81,190명의 새로운 환자 및 17,240의 암 특정 죽음은 방광의 UCC 때문에 미국에서2018년에 생길 것으로 예상됩니다 3,4. 환자가 우세하게 (70%) 비 근육 침략적인 질병으로 존재하는, 30%는MIUCC 5가 있을 것입니다. 임상적으로 국소화 된 질병에 대한 치료 요법 (전신 화학 요법유무에 관계없이 급진적 인 방광 절제술 [RC]에도 불구하고 방광의 MIUCC 환자의절반은 여전히 전이를 개발하고 5 년 이내에 사망합니다 3. 림프절침범은 RC6,7,8을겪은 환자의 약 20 %-25 %에서 발견됩니다. LN 양성 환자에 있는 5 년 생존율은 UCC 환자에 있는 예후에 대한 결정적인 음성 예측자로 LN 관련을 건의하는 RC 후에도 35% 미만입니다.
Colorectal 암은 미국에 있는 남자와 여자 둘 다에서 진단된 세 번째로 일반적인 암입니다. 환자 결과는 침략의 깊이, LN 관련 및 먼 기관 전이와 같은 종양 특성 및 종양 미세 환경에 크게 달려 있습니다. CRC에 있는 사망률은 검열과 효과적인 수술 때문에 마지막 십년간에서 감소하더라도, CRC 환자의 거의 50%가 전이또는 재발하는 질병을 개발할 것이라는 점을 추정됩니다 9.
작은 동물 모델은 종양 진행과 다른 전이성 패턴을 연구하기 위해 신속하고 재현 가능하며 수정 가능한 플랫폼을 제공합니다. 환자에서 볼 수 있는 CRC 및 UCC 전이를 일관되게 모방하는 설명된 이종이식 모델은 현재 없습니다. 암 먼 전이의 1 차적인 경로는 림프 퍼짐을 통해서입니다. 새로운 연구는 LN이 독특한 미세 환경으로 종양을 제공하고, 단순히 암세포가 일시적으로 통과하는 고정 표적일 뿐만 아니라 전이성 과정에서 암세포와 상호 작용하여 중요한 역할을 한다는 것을 시사합니다. 실제로, 우리의 연구 결과는 종양 진행 및 전이를 교육하고 승진시키는 이외에, LN 기질 미세 환경이 또한 CRC10,11에있는 약 저항에 책임 있다는 것을 것을을 발견했습니다. 우리 연구실은 최근 환자 유래 정형외 이종이식(PDOX) 마우스 모델12,13을이용하여 CRC 및 UCC에 대한 LN 기질 세포(LNSC)의 종양성 효과를 확인하였다.
PDOX 모델 개발은 번역암 연구14,15를위한 중요한 플랫폼을 제공한다. 그들의 기증자 종양의 주요 조직학 및 유전적 특성을 유지함으로써, PDOX 모델은 통로전반에 걸쳐 안정적으로 유지되고 번역암 연구를 위한 좋은 플랫폼을 만든다12,15. PDOX 모델은 임상 결과 예측을 가능하게 하는 개인화된 의학 전략의 전임상 약물 평가, 바이오마커 식별 및 전임상 평가에 사용되고 있습니다. 현재, LN 관련의 중요성을 고려하고 CRC와 UCC에 있는 1 차적인 종양 및 먼 기관 전이를 일관되게 재생할 수 있는 기술된 이종이식 모형이 없습니다. 이 연구에서는, 우리는 LNSC 관련으로 전이성 CRC 및 UCC 질병의 재생산을 가진 NOD/SCID 마우스에 있는 PDOX 모형의 발달을 기술합니다.
이러한 동물 연구에 설명된 모든 방법은 Ochsner 건강 시스템의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인된 지침에 따라 동물 연구 지침에 따라 수행되었습니다. 이 연구를 위한 모든 참을성 있는 종양은 Ochsner 건강 시스템 조사 검토 위원회 및 인간에 기관 위원회의 윤리 기준에 따라 암 절제 수술을 겪고 있는 동의한 환자에게서 집합되었습니다 실험. Ochsner Health System의 보드 인증 병리학자는 종양 세포의 현미경 특징, 조직학적 유형 및 등급 수준에 따라 환자 표본의 병리학 적 진단을 결정했습니다.
참고: 다음 프로토콜은 두 개의 분리이식 모델, UCC 세포를 주입하기 위해 방광 벽의 전기 캐터삽입을 통한 UCC 모델 및 CRC 모델에서의 연구를 위한 CRC 세포의 직장 내 주사에 대한 단계를 설명합니다. 실험을 준비하고 모니터링하는 모든 단계는 두 모델 모두에 대해 동일하며, 섹션 7과 8은 UCC 점안 및 CRC 주입 절차를 각각 구체적으로 설명합니다.
1. 세포주 배양
2. 환자 표본 수집
3. 환자 종양의 확장
4. 태그 및 luciferase 표시 종양의 농축
5. 효소 소화를 위한 종양의 적당한 부분을 선택하십시오
6. 종양의 효소 소화
7. UCC 마우스 모델
8. CRC 마우스 모델
9. 생물 발광 이미징
10. 수확 기관 및 종양
11. 조직학적 평가
UCC PDOX 모델에서, UCC 환자의 BlCaPt15 또는 BlCaPt37 세포는 HK 세포의 존재 내 존재에 주입된 내-VED/SCID마우스 방광(그림 1A). 30명 중 25명(83.3%) 동물은 주간 BLI에 기초하여 원발성 종양을 생성하고 시간 의존적 1 차 종양 성장을 표시하였다(도1B,C 및 표1). 마찬가지로 CRC PDOX 모델에서 32명 중 31명(96.9%)이 마우스?...
전이성 질병은 대부분의 암 환자 사망에 대한 책임이 있습니다. 전 임상 치료 시험에서, 자발적인 먼 기관 전이를 가진 인간 적인 종양 성장을 가장 밀접하게 에뮬레이트하는 마우스 모형을 설치하는 것이 중요합니다. 이식된 환자 종양 유래 암세포(xenografts)를 이용한 뮤린 모델을 사용하면 종양 생물학 및 예측 바이오마커에 대한 더 나은 이해뿐만 아니라 새로운 치료법의 항종양 효과의 테스트 ?...
이 연구는 부분적으로 Ochsner 번역 의학 연구 이니셔티브 교부금에 의해 지원 되었다 2014. 저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
저자는 브라이언 로이터, 다니엘 베르토니, 피터 밀러, 섀넌 맥체스니에게 감사를 표하며, 뛰어난 기술 지원을 위해 이러한 연구를 시작하도록 도왔습니다. 저자는 또한 환자를 동의하고 종양 견본을 제공하는 것을 돕기 위하여 헤더 녹색 Matrana, 마가렛 Variano, Sunil Talwar 및 마리아 Latsis를 감사합니다.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Avidin-biotin-peroxidase | Vector Labs Inc | PK-6100 | |
Biotinylated secondary antibody | Vector Labs Inc | BA-1000 | |
Collagenase IV (1.5 mg/mL) | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
Deoxyribonuclease I (0.1 mg/mL) | Sigma | D4263 | |
D-Luciferin (150 mg/kg) | Perkin Elmer | 122796 | |
Formalin (10% neutral buffered) | Leica | 46129 | |
glutamine (2 nM) | Fisher Scientific | 35050061 | |
Hair Removal Cream | Church & Dwight Co., Inc | 1 (800) 248-8820 | |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | SH30016.02 | |
Hyaluronidase (20 mg/mL) | Sigma | H3884 | |
Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 108333 | |
Luc/RFP-lentivirus | From our collaborators. See reference 13: Gills, J. et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729, doi:10.18632/oncotarget.26024 (2018). | ||
McCoy’s medium | Life Technologies | 110862 | |
penicillin/streptomycin 100 mL (100 U/mL) | Fisher Scientific | 15140-122 | |
RPMI-1640 Medium | American Type Culture Collection | 110636 | |
Trypan Blue | Sigma | T6146 | |
Trypsin/EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Gas | |||
100% Oxygen | Airgas Inc | OX USP200 | |
100% CO2 | Airgas Inc | CD USPE | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Mice | |||
6-8 week old NOD/SCID Mice (male) | Jackson Lab | 001303 | |
6-8 week old NOD/SCID Mice (female) | Jackson Lab | 001303 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Immunohistochemistry | |||
Hematoxylin | Sigma | GHS232 | |
Ki-67 Rabbit Monoclonal Antibody | Thermo Scientific | RM-9106-S | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Tools | |||
40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
100 µm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
15 mL Conical Tube | Sarstedt | 11799 | |
50 mL Conical tube | Sarstedt | 15762 | |
150 mm Tissue Culture Dish | USA Scientific Inc | CC7682-3614 | |
96 Well plate | USA Scientific Inc | CC7682-7596 | |
Forceps | Symmetry Surgical Inc | 06-0011 | |
Surgical scissors | Symmetry Surgical Inc | 02-2011 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
5% CO2 humidified incubator | Thermo Scientific | 3110 | |
Bioluminescent (BLI) Imaging Machine | Perkin Elmer | CLS136334 | |
BLI Imaging Machine Software | Perkin Elmer | CLS136334 | |
Centrifuge | Beckman | 366830 | |
Deconvoluting Microscope | Intelligent Imaging Innovations | Marianas | |
Deconvoluting Microscope Imaging Software | Intelligent Imaging Innovations | +1 (303) 607-9429 x1 | |
Digital caliper | Fowler Tools and Instruments | 54-115-330 | |
Dissecting microscope | Precision Instruments LLC | (504) 228-0076 | |
Electrosurgical generator | ValleyLab | FORCE1C20 | |
Isoflurane Induction Chamber | Perkin Elmer | 119038 | |
Microtome | American Optical Corporation | 829 | |
Pipet Aid | Fisher Healthcare | 13-681-15E | |
Serological pipet (10 mL) | Sarstedt | 86.1254.001 |
JoVE'article의 텍스트 или 그림을 다시 사용하시려면 허가 살펴보기
허가 살펴보기This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. 판권 소유