Modelli di Xenotrapianto ortotopico derivati dal paziente per carcinoma a cellule uroteliali umane e crescita del tumore del tumore colorettale e metastasi spontanea

Riepilogo

Questo protocollo descrive la generazione di modelli di xenotrapianto ortotopico derivati dal paziente infondendo inmodo vesicalmente cellule carcinoma a cellule urotemaliali o cellule di cancro colorettale intra-rettale in diabete/grave non obesi immunodeficienza (NOD/SCID) per la crescita primaria del tumore e metastasi spontanee sotto l'influenza delle cellule stromali del linfonodo, che imitano la progressione delle malattie metastatiche umane.

Abstract

I pazienti oncologici hanno una prognosi scarsa quando il coinvolgimento dei linfonodi (LN) è presente sia nel carcinoma a cellule uroteliali di alto grado (HG-UCC) della vescica e del cancro del colon-retto (CRC). Più del 50% dei pazienti con UCC invasivo muscolare, nonostante la terapia curativa per malattie clinicamente localizzate, svilupperà metastasi e morirà entro 5 anni, e il CRC metastatico è una delle principali cause di decessi correlati al cancro negli Stati Uniti. Sono necessari modelli Xenograft che imitano costantemente la metastasi di UCC e CRC osservati nei pazienti. Questo studio ha lo scopo di generare modelli di xenotrapianto ortotopico (DOX) derivati dal paziente di UCC e CRC per la crescita primaria del tumore e metastasi spontanee sotto l'influenza di cellule stromali LN che imitano la progressione delle malattie metastatiche umane per lo screening farmacologico. I tumori freschi di UCC e CRC sono stati ottenuti da pazienti conacchiti sottoposti a resezione rispettivamente per HG-UCC e adenocarcinoma colorettale. Co-inoculate con cellule HK analogiche con cellule nt-lmusali LN (LNSC), cellule UCC con tag luciferasi sono state intra-veseticamente (IB) instillate in topi da parentedeficisi diabetici/gravi (NOD/SCID) inebiti inominati in obliamente (IR) topi maschi NOD/SCID. La crescita tumorale e la metastasi sono state monitorate settimanalmente utilizzando l'imaging della bioluminescenza (BLI). Dopo il sacrificio, i tumori primari e gli organi murini furono raccolti, pesati e fissati in formalina per l'ematossiae e l'eosina e la colorazione immunoistochimica. Nei nostri modelli PDOX unici, i tumori dello xenotrapianto assomigliano ai tumori preimpianto del paziente. In presenza di cellule HK, entrambi i modelli hanno alti tassi di impianto tumorale misurato da PESI BLI e tumorali, 83,3% per UCC e 96,9% per il CRC, e alti tassi di metastasi dell'organo distante (33,3% rilevato metastasi epatica o polmonare per UCC e 53,1% per CRC). Inoltre, entrambi i modelli hanno mortalità zero dalla procedura. Abbiamo stabilito modelli PDOX unici e riproducibili per gli studi umani HG-UCC e CRC, che consentono la formazione di tumori, la crescita e gli studi sulle metastasi. Con questi modelli, il test di nuovi farmaci terapeutici può essere eseguito in modo efficiente e clinicamente mimetico.

Introduzione

È stato dimostrato che la metastasi dei linfonodi (LN) è un indicatore prognostico incattive in molte neoplasie dell'organo solido, tra cui il carcinoma a cellule uroteliali di alto grado (UCC) della vescica e del cancro colorettale (CRC)^1,2. Oltre la metà dei pazienti con UCC muscolo-invasivo (MIUCC), nonostante la terapia curativa per la malattia clinicamente localizzata, svilupperà metastasi e morirà entro 5 anni. Il CRC metastatico è una delle principali cause di morte legata al cancro negli Stati Uniti.

Si stima che 81.190 nuovi pazienti e 17.240 decessi specifici per il cancro si verifichino nel 2018 negli Stati Uniti a causa dell'UCC della vescica^3,4. Mentre i pazienti saranno prevalentemente (70%) presente con malattia invasiva non muscolare, il 30% avrà MIUCC⁵. Nonostante la terapia curativa (cistectomia radicale [RC] con o senza chemioterapia sistemica) per la malattia localizzata clinicamente, la metà dei pazienti con MIUCC della vescica svilupperà ancora metastasi e morirà entro 5 anni³. Il coinvolgimento dei linfonodi si trova in circa il 20%-25% dei pazienti che hanno subito RC^6,7,8. Il tasso di sopravvivenza a cinque anni nei pazienti positivi a LN è inferiore al 35% anche dopo RC, suggerendo il coinvolgimento di LN come predittore negativo cruciale per la prognosi nei pazienti ucc.

Il cancro colorettale è il terzo cancro più comune diagnosticato sia negli uomini che nelle donne negli Stati Uniti. Gli esiti del paziente dipendono in gran parte dalle caratteristiche tumorali e dal microambiente tumorale, come la profondità di invasione, il coinvolgimento di LN e le metastasi di organi distanti. Anche se il tasso di mortalità nel CRC è diminuito nell'ultimo decennio a causa di screening e interventi chirurgici efficaci, si stima che quasi il 50% dei pazienti crC svilupperà metastasi o malattie ricorrenti⁹.

I piccoli modelli animali forniscono una piattaforma rapida, riproducibile e modificabile per studiare la progressione del tumore e diversi modelli metastatici. Attualmente non esistono modelli di xenotrapianto descritti che imitano costantemente la metastasi CRC e UCC osservata nei pazienti. La via primaria della metastasi a distanza di cancro è attraverso la diffusione linfatica. Una nuova ricerca suggerisce che le LN forniscono ai tumori un microambiente unico, e non sono solo bersagli fissi in cui le cellule tumorali passano transitoriamente, ma svolgono anche un ruolo fondamentale interagendo con le cellule tumorali nel processo metastatico. Infatti, i nostri studi hanno scoperto che, oltre a educare e promuovere la progressione e le metastasi del tumore, il microambiente stromale LN è anche responsabile della resistenza ai farmaci in CRC^10,11. Il nostro laboratorio ha recentemente confermato gli effetti tumorigeni delle cellule stromali LN (LNSC) su CRC e UCC utilizzando modelli murini ortotopici (PDOX) derivati dal paziente^12,13.

Lo sviluppo di modelli DoDOX fornisce un'importante piattaforma per la ricerca traslazionale sul cancro^14,15. Mantenendo le principali caratteristiche istologiche e genetiche del tumore del donatore, i modelli PDOX rimangono stabili tra i passaggi e rendono buone piattaforme per la ricerca traslazionale sul cancro^12,15. I modelli DODoX vengono utilizzati per la valutazione preclinica dei farmaci, l'identificazione dei biomarcatori e la valutazione preclinica di strategie di medicina personalizzate che consentono la previsione degli esiti clinici. Attualmente, non esistono modelli di xenotrapianto descritti che considerino l'importanza del coinvolgimento di LN e siano in grado di riprodurre costantemente il tumore primario e la metastasi dell'organo distante nel CRC e nell'UCC. In questo studio, descriviamo lo sviluppo di modelli PDOX in topi NOD/SCID con riproduzione di malattie metastatiche CRC e UCC con coinvolgimento LNSC.

Protocollo

Tutti i metodi descritti in questi studi sugli animali sono stati condotti secondo le linee guida approvate del Comitato istituzionale per la cura degli animali e l'uso del sistema sanitario di Ochsner e in conformità con le linee guida per la ricerca sugli animali. Tutti i tumori dei pazienti per questo studio sono stati raccolti da pazienti acconsentiti sottoposti a interventi chirurgici di resezione del cancro in conformità con l'Ochsner Health System Investigative Review Board e gli standard etici del Comitato Istituzionale per l'Educazione sperimentazione f. I patologi certificati dal consiglio di Ochsner Health System hanno determinato le diagnosi patologiche dei campioni dei pazienti in base alle caratteristiche microscopiche delle cellule tumorali, al loro tipo istologico e al livello di grado.

NOTA: il protocollo seguente descrive i passaggi per due modelli di xenotrapianto separati, un modello UCC tramite l'elettrocauterizzazione della parete della vescica per infondere le cellule UCC e un'iniezione intrarettale di cellule CRC per lo studio in un modello CRC. Tutti i passaggi per preparare e monitorare gli esperimenti sono identici per entrambi i modelli, mentre le sezioni 7 e 8 descrivono specificamente la procedura per l'instillazione UCC e l'iniezione CRC, rispettivamente.

1. Linee cellulari di coltura

1. Coltivano cellule HK nel mezzo RPMI-1640 completo integrato con 10% siero bovino fetale, 2 n N M glutammina, 100 U/mL penicillina G, e 100 mg/mL streptomicina a 37 gradi centigradi in un 5% di CO₂ incubatore umido.
   NOTA: Le cellule HK sono normali cellule dendritiche follicolari umane e possono essere coltivate ed espanse per 15 passaggi in vitro¹⁶.
2. Per prepararsi a un esperimento, provare le cellule.
   1. Rimuovere i supporti e aggiungere 2 mL di 1% di prova nella soluzione di sale equilibrato di Hank (HBSS) alle cellule. Rimettere le cellule nell'incubatrice umidificata di CO₂ del 5% a 37 gradi centigradi per 4 min.
   2. Raccogliere le cellule dal piatto in un tubo da 15 mL utilizzando un supporto di pipet portatile con un pipet sierologico da 10 mL attaccato. Aggiungere 8 mL di supporto RPMI-1640 completo.
   3. Unire 40 -L di cellule e 40 l di trypan blu in un unico pozzo di un pozzo 96. Aggiungere 10 l di miscela a un emocitometro e contare le cellule vive. Aggiungere 1 milione di cellule in 25 mL mezzo RPMI-1640 completo a un piatto trattato con coltura di tessuto sterile da 150 mm per continuare a coltivare le cellule.
      NOTA: La sospensione delle cellule HK preparata in questa fase deve essere utilizzata entro un'ora per mescolare con le cellule tumorali per l'iniezione.

2. Raccolta di campioni di pazienti

1. Raccogliere i tumori UCC dal paziente acconsentito 15 (BlCaPt15, pT3b N1 M0) e 37 (BlCaPt37, pT3b pN0 M0) a intervento chirurgico di resezione.
2. Raccogliere i tumori CRC dal paziente acconsentito 155 (CoCaPt155, T1 N0 M0) e 302 (CoCaPt302, T1 N0 M0) a seguito di un intervento chirurgico di resezione.

3. Espansione del tumore del paziente

1. Raccogliere i tumori in chirurgia a freddo sterile McCoy mezzo contenente penicillina G (500 U/mL) e streptomicina (500 mg/mL).
2. Impiantare i tumori direttamente sul fianco sinistro e destro dei topi NOD/SCID femminili di 6-8 settimane.
   1. Tessuti tritati meccanicamente in piccoli pezzi (1 mm³) utilizzando piccole forbici chirurgiche.
   2. Impianto di tessuto sottocutaneo sul fianco sinistro e destro utilizzando 13 G aghi biopsia aspirazione del midollo osseo.
      NOTA: Impiantare un volume totale di 8 mm³ diviso uniformemente su entrambi i lati del fianco.

4. Tagging e arricchimento di tumori con etichettatura luciferate

1. Misurare la crescita del tumore bisettimanale utilizzando una pinza digitale.
2. A 1 cm di diametro, trasduzione del tumore. Iniettare direttamente nel tumore con una singola dose di proteine fluorescenti Luc/red (RFP)-lentivirus (50 anni/tumore, 1:30 diluizione da concentrato stock di lentivirus alto titro) utilizzando una siringa da 1 cc con un ago da 27 G.
   NOTA: Il tumore del paziente raggiunge in genere 1 cm di diametro in 1/2 mesi. Tuttavia, il tasso di crescita è estremamente variabile e basato su una serie di fattori tra cui il grado e il tipo di tumore.
3. Monitorare il tumore settimanalmente da imaging bioluminescente (BLI) in animali vivi.
   1. Pesare i topi. Iniettare il topo cosciente con 150 mg/kg luciferina intraperitonealmente e attendere 5 min per il substrato di circolare nel corpo del mouse.
   2. Anestesizzare il topo con 2,5% isoflurane in 100% ossigeno, 1 L/min in una camera di induzione.
   3. Posizionare il mouse sullo stomaco in una macchina di imaging BLI con isoflurane che scorre e immagine. Scattare immagini sequenziali per confermare la presenza di regioni tumorali positivi Luc/RFP (immagine bio-luminescente a falsi colori). Riportare il mouse in gabbia al termine dell'imaging.

5. Selezionare la porzione appropriata di tumore per la digestione ezimatica

1. Il giorno della procedura UCC o CRC, immagine mouse con luciferasi etichettato tumore come nei passaggi 4.3.1.4.3.3.
   NOTA: Il periodo di tempo per la crescita del tumore sottocutaneo dipende dalla velocità di crescita del tumore e dal numero previsto di animali da iniettare nell'esperimento.
2. Morale del raccolto dal fianco e dall'immagine del topo.
   1. Eutanasia del topo per inalazione di CO₂ dopo l'imaging. Posizionare il topo nella camera CO 2, accendere il gas a 1,4 L/min fino all'arresto respiratorio e lasciare agire per 3 min.
   2. Pelle pulita con 70% di etanolo. Pelle della tenda direttamente sopra il tumore. Con le forbici chirurgiche fare una piccola incisione nella pelle. Separare la pelle dal tumore con le forbici.
   3. Rimuovere il tumore e mettere in una sterile petri-dish. Immagine dell'intero piatto in una macchina di imaging.
3. Utilizzare forbici sterili o bisturi per separare le sezioni luciferasi-negative dalle sezioni positive luciferasi nel tumore e ri-immagine.
4. Ripetere fino a quando rimangono solo pezzi di tumore più altamente positivi.

6. Digestione ezimatica del tumore

1. Sotto cappa di flusso laminare, tritare luciferate pezzi di tumore positivi (fase 5.4) nei pezzi più piccoli possibili utilizzando forbici chirurgiche sterili e metterli in uno sterile tubo conico 50 mL.
   NOTA: La messa a quota del tumore nei pezzi più piccoli possibili produrrà più cellule individuali.
2. Preparare la soluzione di digest aggiungendo 10 mL di collagenasi IV (1,5 mg/mL), 80 - L di ialuronidasi (20 mg/mL) e 160 l of deoxyribonuclease I (0,1 mg/mL) a 40 mL di HBSS. Mescolare la soluzione invertendo.
3. Aggiungere i 35-40 mL della soluzione di gergo al tumore macinato. Incubare a 37 gradi centigradi con rotazione continua per 2 h.
   NOTA: Agitare vigorosamente il tubo periodicamente durante l'incubazione per evitare che il tessuto tumorale si agglomi.
4. Filtrare l'intera digestione attraverso un colino sterile di 100 m seguito da un colino di 40 m per rimuovere i detriti. Salvare il flusso attraverso e scartare i detriti.
5. Lavare le cellule libere aggiungendo 20 mL di HBSS e centrifugare a 329 x g per 5 min. Aspirate il supernatante e resuspend pellet in 30 mL di HBSS.
6. Unire 10 l di soluzione cellulare e 90 l di trypan blu in un unico pozzo di una piastra di 96 pozze. Contare le cellule vive usando un emacytometro.
7. Trasferire da 1 x 10⁴ a 1 x 10⁶ cellule tumorali per topo in un tubo conico sterile da 15 mL. Aggiungere 3 x 10⁵ cellule HK dal passaggio 1.2.3 per mouse, allo stesso tubo con cellule tumorali.
   NOTA: Utilizzare tubo conico sterile da 50 mL se il volume totale supera i 15 mL. Calcolare sempre più dosi per animali aggiuntivi per gruppo di studio per tenere conto della perdita di liquido durante l'uso di siringhe. Ad esempio, se un gruppo contiene 5 mouse, creare un numero sufficiente di cellule per 6 o 7 topi.
8. Centrifuga a 329 x g per 5 min. Scartare supernatante aspirando o pipettando.
9. Risospendere le celle in 50 : L per mouse per il modello UCC o 10 L per mouse per il modello CRC su supporto RPMI completo. Mantenere la sospensione cellulare sul ghiaccio fino a quando non è pronto per l'uso.

7. Modello mouse UCC

1. Preparazione dei topi per la procedura
   1. Ottenere topo NOD/SCID donna di sei-otto settimane. Rasare la parte bassa della parte bassa del mouse utilizzando crema per la rimozione dei peli. Anestesizzare il topo in una camera di induzione con isoflurane (2,5% in 100% di ossigeno, 1 L/min).
   2. Una volta sedato, posizionare il topo in posizione supina con il muso in un cono naso isoflurano e schiena nuda saldamente messa a terra su un elettrodo dispersivo.
      NOTA: Il mouse è completamente sedato se non risponde alla pizzicamento dell'punta.
2. Cellule UCC instillate preparate nel passaggio 6.9 alla vescica utilizzando un angiocater (Figura 1Aa,Ab).
   1. Impostare un elettrocauterio monopolare e impostare una potenza di 4 W. lubrificare un 24 G sterile antheter con gelatina lubrificante e inserto attraverso urgiocaethra del topo femminile.
      NOTA: Si può avvertire una leggera resistenza. Spingere delicatamente in avanti o rimuovere angiocate ter e ripetere. Non forzare. Se il catetere si piega all'ingresso, inserire un filo guida sterile (cfr. 7.2.2) a metà catetere per fornire stabilità.
   2. Inserire completamente il filo guida dritto del nucleo fisso da 0,025" 1 mm oltre la fine dell'angiocatheter.
      NOTA: Il filo è contrassegnato con nastro prima della procedura per indicare il punto di arresto di 1 mm e assicurare la consistenza.
   3. Tenere il perno monopolare al filo guida per 1 s permettendo irritazione elettrica della mucosa della vescica.
   4. Attaccare un angiocate sterile fresco a 1 cc siringa luer-lok e redigere 200 -L di cellule raccolte dal punto 6,9.
      NOTA: almeno 100 l vengono persi dall'angiocater alla siringa. Compensare il volume di perdita durante il calcolo del volume della sospensione cellulare necessaria.
   5. Rimuovere il filo guida e l'angiocateter dall'uretra del mouse. Inserire angiocathete con siringa di cellule attaccate all'uretra.
      NOTA: L'avanzamento dovrebbe essere più facile di prima.
   6. Instillare 50 -L di cellule alla vescica del topo. Attendere alcuni secondi prima di rimuovere l'angiocatheter per consentire alle cellule di aderire alla parete della vescica.
      NOTA: Le cellule rimangono nella vescica e si sviluppano in un tumore primario.
3. Rimuovere il mouse dal cono naso isoflurane e pad di messa a terra. Osservare il mouse per 1 h procedura seguente. Cercare segni di disagio, cioè, schiena inclinata, respirazione affannosa, ecc.

8. Modello mouse CRC

1. Anestetizza il topo NOD/SCID di 6-otto settimane con isoflurane (2,5% in 100% di ossigeno, 1 L/min) nella camera di induzione. Confermare la sedazione con un pizzico di dita dei dei imminichi.
2. Posizionare il topo anetizzato in posizione supina sotto un microscopio dissezioso, assicurandosi di fissare il muso a un nosecone isoflurano e di fissare i loro arti anteriori con nastro adesivo per la stabilità.
   NOTA: Le loupes possono essere utilizzate al posto di un microscopio sezionato. Un piccolo oggetto può essere utilizzato per migliorare la visibilità e l'angolo quando viene posizionato sotto la base della coda, elevando l'ano. Tipicamente, piccole sezioni di garza sono rotolati in una forma a cilindro di diametro di 1 pollice.
3. Dilatare il canale anale con pinze con tundilo lubrificate curve per esporre la mucosa anale e rettale distale. Rimuovere le feci.
4. Utilizzare un ago sterile da 30 G rimovibile su una siringa di vetro da 50 L per iniettare 10 cellule tumorali e HK (dal punto 6.9) nella submucosa rettale posteriore distale da 1 a 2 mm sopra il canale anale. Lo smusso dell'ago deve essere coperto da mucosa. Fare attenzione a non passare nella cavità pelvica.
5. Rimuovere il topo dal cono naso isoflurane. Osservare il mouse per 1 h procedura seguente. Cercare segni di disagio, cioè, schiena inclinata, respirazione affannosa, ecc.

9. Imaging bioluminescente

1. Monitorare il tumore primario, fegato, e l'onere metastatico polmonare settimanale utilizzando un sistema di imaging bioluminescente per l'attività luciferasi.
   1. Ottenere un mouse dall'esperimento UCC o CRC e pesare. Iniettare 150 mg/kg luciferina intraperitonealmente e attendere 5 min per il substrato di circolare nel corpo del mouse.
   2. Anestesizzare il topo con 2,5% isoflurane in ossigeno al 100%, 1 L/min nella camera di induzione.
   3. Posizionare il mouse nella macchina BLI Imaging con naso fissato in nosecone. Quando si espone per l'immagine, assicurarsi che l'area di interesse sia rivolta verso la fotocamera. Per l'iniezione di UCC e CRC, il lato ventrale deve affrontare la fotocamera per ogni immagine. Mouse immagine in posizione supina.

10. La raccolta di organi e tumori

1. Quando la luminosità della luminescenza tumorale primaria raggiunge 1 x 10¹¹ fotoni o se i topi presentano segni di disagio (ad esempio, perdita di peso, schiena inclinata, respirazione dura/fatica, ecc.), eutanasia dei topi da INalalazione DI CO₂ (come nel passaggio 5.2.1) dopo luciferina iniezione e l'imaging di tutto il corpo.
2. Rimuovere fegato e polmone, mettere in una piastra di Petri e immagine per identificare eventuali metastasi. Rimuovere il tumore, pesare e immagine. Fissare organi e tumore in formalina tamponata al 10% neutra per 48 h a temperatura ambiente.
   NOTA: Pulire/pulire forbici e pinze tra ogni organo per evitare il trasferimento di tessuto.

11. Valutazione istologica

1. Incorporare i tessuti fissi di formalina nella paraffina e affettare i tessuti a spessore di 5 m su un microtoma per l'ematossia e l'eosina (H&E) e la colorazione immunohistochimica (IHC).
   NOTA: tutte le macchie H&E dei vetrini di paraffina sono state effettuate nel laboratorio di patologia del sistema sanitario Ochsner, e tutte le macchie IHC in questo articolo sono state eseguite in un laboratorio di ricerca del sistema sanitario Ochsner dopo il recupero dell'antigene ad alta temperatura utilizzando Ki67 e cytokeratin 20 anticorpi, seguiti da anticorpi secondari biotinylati, e carina-biotina-perossidi secondo le istruzioni del produttore^13,17.

Risultati

Nel modello UCC PDOX, le cellule BlCaPt15 o BlCaPt37 dei pazienti UCC sono state instillate inmodo-vesicalmente (IB) in presenza di cellule HK nella vescica muraria NOD/SCID femminile (Figura 1A). Venticinque su trenta (83,3%) gli animali hanno generato tumori primari e hanno mostrato una crescita tumorale primaria dipendente dal tempo in base al BLI settimanale (Figura1B, C e Tabella 1). Analoga...

Discussione

La malattia metastatica è responsabile della maggior parte dei decessi dei pazienti affetti da cancro. Nei test terapeutici pre-clinici, è fondamentale stabilire modelli murini che emulano più da vicino la crescita del tumore umano con metastasi spontanee di organi distanti. L'utilizzo di modelli murini con cellule tumorali derivate dal tumore del paziente impiantato (xenografi) consente una migliore comprensione della biologia tumorale e dei biomarcatori predittivi, nonché test e previsioni degli effetti antineoplas...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Avidin-biotin-peroxidase	Vector Labs Inc	PK-6100
Biotinylated secondary antibody	Vector Labs Inc	BA-1000
Collagenase IV (1.5 mg/mL)	Worthington Biochemical Corporation	LS004189
Deoxyribonuclease I (0.1 mg/mL)	Sigma	D4263
D-Luciferin (150 mg/kg)	Perkin Elmer	122796
Formalin (10% neutral buffered)	Leica	46129
glutamine (2 nM)	Fisher Scientific	35050061
Hair Removal Cream	Church & Dwight Co., Inc	1 (800) 248-8820
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Fisher Scientific	SH30016.02
Hyaluronidase (20 mg/mL)	Sigma	H3884
Isoflurane	Henry Schein Animal Health	108333
Luc/RFP-lentivirus	From our collaborators. See reference 13: Gills, J. et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729, doi:10.18632/oncotarget.26024 (2018).
McCoy’s medium	Life Technologies	110862
penicillin/streptomycin 100 mL (100 U/mL)	Fisher Scientific	15140-122
RPMI-1640 Medium	American Type Culture Collection	110636
Trypan Blue	Sigma	T6146
Trypsin/EDTA	Life Technologies	15400-054
Name	Company	Catalog Number	Comments
Gas
100% Oxygen	Airgas Inc	OX USP200
100% CO2	Airgas Inc	CD USPE
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice
6-8 week old NOD/SCID Mice (male)	Jackson Lab	001303
6-8 week old NOD/SCID Mice (female)	Jackson Lab	001303
Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunohistochemistry
Hematoxylin	Sigma	GHS232
Ki-67 Rabbit Monoclonal Antibody	Thermo Scientific	RM-9106-S
Name	Company	Catalog Number	Comments
Tools
40 µm cell strainer	Fisher Scientific	08-771-1
100 µm cell strainer	Fisher Scientific	08-771-19
15 mL Conical Tube	Sarstedt	11799
50 mL Conical tube	Sarstedt	15762
150 mm Tissue Culture Dish	USA Scientific Inc	CC7682-3614
96 Well plate	USA Scientific Inc	CC7682-7596
Forceps	Symmetry Surgical Inc	06-0011
Surgical scissors	Symmetry Surgical Inc	02-2011
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
5% CO2 humidified incubator	Thermo Scientific	3110
Bioluminescent (BLI) Imaging Machine	Perkin Elmer	CLS136334
BLI Imaging Machine Software	Perkin Elmer	CLS136334
Centrifuge	Beckman	366830
Deconvoluting Microscope	Intelligent Imaging Innovations	Marianas
Deconvoluting Microscope Imaging Software	Intelligent Imaging Innovations	+1 (303) 607-9429 x1
Digital caliper	Fowler Tools and Instruments	54-115-330
Dissecting microscope	Precision Instruments LLC	(504) 228-0076
Electrosurgical generator	ValleyLab	FORCE1C20
Isoflurane Induction Chamber	Perkin Elmer	119038
Microtome	American Optical Corporation	829
Pipet Aid	Fisher Healthcare	13-681-15E
Serological pipet (10 mL)	Sarstedt	86.1254.001